KRAS突變對非小細胞肺癌增殖的影響及其機制

曾誠，姚貝，吳啟鵬，劉冰（廣東藥學院藥科學院，廣東廣州510006）

KRAS突變對非小細胞肺癌增殖的影響及其機制

曾誠，姚貝，吳啟鵬，劉冰
（廣東藥學院藥科學院，廣東廣州510006）

目的觀察在非小細胞肺癌（NSCLC）細胞中KRAS突變對炎癥因子 IL-6和NADPH氧化酶4 （NOX4）表達的影響，并研究由KRAS突變引起的IL-6分泌和NOX4的表達對NSCLC細胞增殖能力的影響。方法分別通過質粒pBabe puro-KRASG12V和siRNA轉染細胞，制備KRASG12V過表達的Calu3細胞株和KRASG12V干擾的H411細胞株，采用Western blotting法對NOX4的表達進行檢測；采用ELISA法檢測IL-6的分泌水平；采用MTT法檢測Calu3細胞的增殖能力。結果與對照組相比，經質粒pBabe puro-KRASG12V轉染后，Calu3細胞中NOX4的蛋白表達水平和IL-6的分泌水平均顯著升高；經siRNA轉染干擾KRASG12V后，H411細胞中NOX4表達和IL-6的分泌量均顯著降低；在KRASG12V過表達的基礎上，在Calu3細胞中加入IL-6的中和抗體Siltuximab可降低NOX4的表達，而干擾NOX4后可減少IL-6的分泌；在過表達KRASG12V的Calu3細胞中，分別干擾NOX4的表達或加入Siltuximab，均可顯著抑制細胞的增殖能力。結論在NSCLC細胞中，KRAS的突變能引起IL-6的分泌和NOX4的表達，并通過IL-6和NOX4的相互激活共同促進癌細胞的惡性增殖。

KRAS；NOX4；IL-6；NSCLC；細胞增殖

近年來，肺癌的死亡率明顯上升，已成為全球死亡率最高的惡性腫瘤［1］。肺癌的基本類型可分為小細胞肺癌（small cell lung carcinoma，SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC）兩種，后者約占所有肺癌的80%-85%。

KRAS蛋白屬于RAS蛋白家族中的一員，當在胞外信號分子的刺激下，RAS蛋白從與GDP結合的無活性形式轉變成與GTP結合的有活性形式，從而繼續激活下游PI3K/Akt等信號，參與多種細胞的增殖、分化及凋亡。突變的KRAS基因造成GTP酶的活性減少，使其處于與GTP結合的持續激活狀態，從而使許多正常類型的細胞發生惡性轉化成為腫瘤細胞，其中包括NSCLC［2］。臨床研究顯示，KRAS突變在NCSCL患者中占25%左右且與患者的不良預后密切相關［3］。

NADPH氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOXs）是一個主要產生超氧化物和過氧化氫的酶家族。許多研究表明NOXs與多種癌細胞的生長、惡性進展有密切關系［4-6］。前期研究發現作為NOX家族成員之一的NOX4在NSCLC中高表達，且通過正反饋調節 PI3K/Akt信號促進NSCLC增殖及侵襲轉移［7］。

炎癥與腫瘤的關聯性近年來得到了廣泛的關注，而細胞因子被認為是聯系兩者的關鍵因素［8］。其中IL-6（interleukin-6，IL-6）作為重要的細胞因子在NSCLC中高表達，且表達量與患者的不良預后有關［9］。此外，有研究發現NOX4能通過誘導IL-6的產生促進腎癌細胞的侵襲，這一研究提示在腫瘤惡性進展過程中NOX4與IL-6存在相互作用［10］。

本研究以NSCLC細胞株Calu3和H441作為試驗細胞模型，檢測KRAS突變對IL-6和NOX4的表達的影響，并進一步探究IL-6和NOX4的表達對KRAS突變的 NSCLC細胞增殖能力的影響，為KRAS突變的NSCLC患者提供新的藥物治療靶點。

1　材料與方法

1.1材料

DMEM培養基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）均購自美國Gibco公司；兔源NOX4、β-Tubulin抗體購自美國Abcam公司；羊抗兔二抗購自日本Proteintech公司；Siltuximab（CNT0328）購自Centocor Inc；細胞轉染試劑Lipofectamine2000購自Invitrogen公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；IL-6酶聯免疫分析試劑盒（Cat.No.D6050）購自于R&D systems；其余試劑均為國產分析純。

1.2Calu3和H441細胞系、質粒及轉染

人 NSCLC細胞株 Calu3（KRAS野生型）和H441（KRAS突變型）均購于ATCC。Calu3和H441分別使用MEM培養基和RPMI1640培養基培養，所用培養基中均含有10%（φ）FBS，在37℃含有5% （φ）CO2的培養箱中培養。pBabe puro-KRASG12V質粒購自美國Addgene公司，參考文獻［11］的方法，通過轉染pBabe puro-KRASG12V和pBabe puro構建KRAS穩定過表達的Calu3細胞株（KRASG12V）和相應的空載組（KRASDN），細胞培養48 h后提取蛋白。KRASG12V為靶點的siRNA購自廣州銳博生物有限公司。其序列為5′-GUUGGAGCUGUU GGCGUAGTT-3′（順義鏈）和5′-CUACGCCAACAG CUCCAACTT-3′（反義鏈）。使用Lipofectamine 2000將siRNA轉染到 H441細胞株內。NOX4的 siRNA購自美國Origene公司，轉染方法嚴格按照其說明書。

1.3細胞增殖實驗

細胞增殖實驗采用MTT法檢測。將已經成功轉染KRASG12V質粒的Calu3細胞以5×104個/孔接種于96孔板中，待細胞貼壁后，分別加入Siltuximab培養48 h和用NOX4 siRNA再次轉染細胞。然后，每孔中加入50 μL MTT試劑，在37℃下孵育4 h后棄上清，然后每孔加入200 μL DMSO溶解結晶體，置于搖床上振搖10 min，至藍紫色顆粒完全溶解后，于酶標儀570 nm波長處測量各孔光吸收值。實驗重復3次。

1.4免疫印跡法（Western blotting）

檢測Calu3和H441細胞中NOX4蛋白表達，首先細胞以1×105/孔種于6孔板，待細胞貼壁后開始轉染，48 h后加入Siltuximab，終質量濃度為20 μg/ mL。培養48 h后每孔細胞中加入80 μL的蛋白裂解液后，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，計算每泳道上樣總蛋白為70 μg，蛋白經電泳分離后轉移至硝酸纖維素膜上。用含脫脂牛奶的TBST室溫下封閉1 h，與稀釋好的NOX4一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜。TBST洗膜后，與10 mL 1∶10 000稀釋的羊抗兔二抗室溫孵育，1 h后TBST洗膜，然后加入ECL化學發光液，X光片暗室曝光、顯影及定影。采用ImageJ軟件分析膠片中的蛋白條帶及相對蛋白表達豐度。實驗重復3次

1.5酶聯免疫分析（ELISA）

IL-6的含量測定按試劑盒說明書操作，建立標準曲線。加樣:待測品孔中每孔各加入樣品稀釋液及待測樣品各50 μL。將反應板置37℃ 120 min。洗板:用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次，在濾紙上印干。每孔中加入第一抗體工作液50 μL。將反應板充分混勻后置37℃60 min，洗板。每孔加酶標抗體工作液100 μL。將反應板置37℃ 60 min，洗板。每孔加入底物工作液100 μL，置37℃暗處反應5～10 min。每孔加入1滴終止液混勻。在492 nm處測吸光值（A）。用標準物濃度與A值計算出標準曲線的直線回歸方程，將樣品的A值代入方程式求出樣品濃度。實驗重復3次。

1.6統計分析

數據分析用GraphPad Prism 5統計軟件（GraphPad Software，San Diego，CA，US）。兩組間計量資料統計采用t檢驗，多組間計量資料統計采用單向方差分析（One-way ANOVA）。所有結果以均數±標準差表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1突變的KRAS對Calu3細胞系中NOX4表達和IL-6分泌的影響

結果如圖1A所示，在Calu3細胞系中，Western blotting實驗結果表明，過表達KRASG12V組較KRAS野生組（wild type，WT）或空載組（KRASDN）NOX4蛋白表達量顯著升高。如圖1B所示，經ELISA分析，過表達 KRASG12V組較 KRAS野生組和空載組（KRASDN）分泌的IL-6含量顯著升高。

圖1　在Calu3細胞系中突變的KRAS對NOX4表達和IL-6分泌的影響Figure 1 Expression of NOX4 and IL-6 in Calu3 cells with overexpression of KRASG12V

2.2干擾KRASG12V對H441細胞系中NOX4蛋白表達和IL-6分泌的影響

結果如圖2A所示，Western blotting分析表明，在自身KRAS突變的H441細胞系中，對比空白組（cont）和空載組（contsiRNA），使用 siRNA干擾KRASG12V組NOX4的表達量顯著降低。結果如圖2B所示，ELISA分析表明，對比空白組和空載組（contsiRNA），干擾KRASG12V組IL-6的分泌水平顯著降低。

圖2　在H441細胞系中干擾KRASG12V對NOX4蛋白表達和IL-6分泌的影響Figure 2 Expression of NOX4 and IL-6 in KRASG12V-depleted H441 cells

2.3KRAS突變的Calu3細胞系中NOX4蛋白的表達量和IL-6分泌水平之間的相互影響

結果如圖3A所示，在Calu3細胞系中，過表達KRASG12V組較KRAS空白質粒組（KRASDN）中NOX4蛋白的表達量顯著升高，但當使用IL-6的中和抗體Siltuximab（劑量）后，NOX4蛋白表達量顯著降低，但仍然比KRASDN組的NOX4表達量高。結果如圖3B所示，過表達KRASG12V組較KRAS空載質粒組IL-6分泌水平顯著升高，但當使用 siRNA干擾NOX4后，IL-6的分泌水平顯著降低，但仍然比KRASDN組的IL-6分泌水平高。

2.4KRAS突變介導分泌的IL-6和NOX4分別對Calu3細胞系增殖能力的影響

結果如圖4所示，在Calu3細胞系中，過表達KRASG12V組較空載組（KRASDN）組細胞的增殖能力顯著增強，但在過表達 KRASG12V的基礎上，干擾NOX4表達或加入Siltuximab，細胞的增殖能力都明顯被抑制，但仍然較空載組（KRASDN）細胞的增殖能力強。

圖3　在過表達KRASG12V基礎上，NOX4的表達和IL-6分泌之間的相互影響Figure 3 Correlation between NOX4 and IL-6 in Calu3 cells with overexpression of KRASG12V

圖4　KRAS突變介導分泌的IL-6和NOX4的表達對Calu3細胞增殖能力的影響Figure 4 Effect of IL-6 and NOX4 mediated by KRASG12Von the proliferation of Calu3 cells

3　討論

當前，KRAS基因的突變被視為最重要的異常分子參與NSCLC的惡性進展，然而其具體機制尚不明確。

已有大量的研究表明，突變KRAS與NOX家族的表達密切相關。比如，在KRAS突變的胰腺癌細胞中，由NOX2介導產生的活性氧族（ROS）促進細胞的生長［12］。Laurent等［13］研究發現，NOX1在結直腸癌中高表達并且與突變的KRAS表達呈正相關性。本研究進一步發現，在 NSCLC中，突變的KRAS在誘導NOX4表達的基礎上可以促進細胞的增殖。這些結果共同表明 KRAS的突變能促進NOX家族的表達，且這種功能是具有腫瘤特異性的。之前的研究已經證明，NOX4在NSCLC中高表達且介導其惡性進展［7］。結合本次研究，KRAS突變的Calu3細胞中NOX4的表達水平升高，這些發現解釋了NOX4在NSCLC中高表達的原因，擴展了之前的研究成果。

在本次實驗中，相較于正常的Calu3細胞，細胞過表達KRASG12V后，IL-6的表達量顯著升高，而當使用IL-6的中和抗體Siltuximab后，細胞的生長明顯被抑制。這些實驗說明KRAS突變能誘導IL-6分泌，進而促進腫瘤細胞的增殖。此外，進一步的研究發現，在過表達KRASG12V之后，使用IL-6的中和抗體，NOX4的表達量下降。而在過表達KRASG12V之后干擾NOX4的表達，IL-6的含量顯著下降。這些實驗說明在KRAS突變的情況下，NOX4與IL-6可相互作用，且兩者能共同促進NSCLC的惡性增殖。

綜上所述，在NSCLC中，KRAS的突變能促進NOX4的表達和IL-6的分泌，IL-6和NOX4的相互激活可共同促進癌細胞的惡性增殖。本研究發現了KRAS突變誘導NSCLC惡性增殖的一個新的機制，為臨床KRAS突變的肺癌患者治療提供新的治療靶標。

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（責任編輯：幸建華）

Effect of KRAS mutation on the proliferation of NSCLC cells

ZENG Cheng，YAO Bei，WU Qipeng，LIU Bing
（School of Pharmacy，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

Objective To study the effect of KRAS mutation on the expression of IL-6 and NOX4 and identify the role of NOX4 and IL-6 on the cell proliferation in NSCLC cells.Methods KRASG12V-overexpressed Calu3 cells and KRASG12V-intervened H411 cells were generated by transfection of pBabe puro-KRASG12Vand KRASG12VsiRNA，respectively.The expression of NOX4 was analyzed by western blotting.The level of IL-6 was determined by ELISA.The ability of Calu3 cell proliferation was analyzed by MTT assay.Results Compared with the control group，the expression of NOX4 and IL-6 were obviously increased in Calu3 cells after transfected with KRASG12Vplasmid，which was significantly reduced in H411 cells after transfected with KRASG12VsiRNA.After treatment with siltuximab or NOX4 siRNA，the expression of NOX4 and IL-6 were reduced in Calu3 cells with overexpression of KRASG12V.Meantime，treatment with siltuximab or NOX4 siRNA inhibited the Calu3 cell proliferation.Conclusion KRAS mutation enhances the expression of IL-6 and NOX4 in NSCLC cells，which may promote the cell proliferation.

KRAS；NOX4；IL-6；NSCLC；proliferation

R734.2

A

1006-8783（2016）04-0503-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016030701

2016-03-07

廣東省自然科學基金（2015A030313580）

曾誠（1990—），男，2014級碩士研究生，Email:classiczengcheng@163.com；通信作者:劉冰（1982—），男，博士，副教授，主要從腫瘤藥理學研究，Email:liubing52000@163.com。

網絡出版時間:2016-07-04 15:39 網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160704.1539.005.html