5/6腎切除慢性腎衰竭大鼠殘腎組織中HIF-1表達對貧血的影響

孫秀麗， 馮國徵， 侯國存， 雷震坤， 尚小梅

(包頭市中心醫院腎內科,包頭　014040； *通訊作者，E-mail:btszbdf@163.com)

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5/6腎切除慢性腎衰竭大鼠殘腎組織中HIF-1表達對貧血的影響

孫秀麗*， 馮國徵， 侯國存， 雷震坤， 尚小梅

(包頭市中心醫院腎內科,包頭014040；*通訊作者，E-mail:btszbdf@163.com)

目的通過制作5/6腎切除慢性腎衰竭大鼠模型，觀察殘腎組織中缺氧誘導因子-1(HIF-1)的表達對貧血的影響。方法雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠行5/6腎切除，隨機分為假手術組、模型組(5/6腎切除)和促紅細胞生成素(EPO)干預組。術后第3周，EPO組大鼠皮下注射重組人促紅細胞生成素(rhEPO)40 IU/kg，每周2次，直到動物處死。實驗動物分別于術后第90天處死，采集血液和留取殘余腎組織標本，血液檢測Scr及Hb，殘余腎組織行HE染色和Masson染色觀察病理變化；連續切片免疫熒光染色觀察HIF-1在腎臟中的表達；Western blot印跡檢測HIF-1的蛋白表達水平。結果①模型組殘腎組織部分腎小球出現節段性硬化，腎間質局灶性纖維化，上皮萎縮，模型組與假手術組腎小球硬化指數相比明顯升高(P<0.05)；模型組與EPO組腎小球硬化指數相比無明顯差異(P>0.05)。②手術組與假手術組相比，Scr明顯升高(P<0.05)，模型組與EPO組相比，Scr無顯著差異(P>0.05)。③與假手術組比較，模型組Hb明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，EPO組Hb變化不明顯(P<0.05)。④與假手術組比較，模型組HIF-1表達明顯增加(P<0.05);與模型組相比，EPO組HIF-1表達明顯減少(P<0.05)。結論在慢性腎衰竭大鼠中，HIF-1的表達增加可改善腎性貧血。

慢性腎衰竭；貧血；HIF-1；血紅蛋白

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increased in model group(P<0.05). Compared with model group, the expression of HIF-1 decreased significantly in EPO group(P<0.05).ConclusionThe increasing expression of HIF-1 could improve the renal anemia in chronic renal failure rats.

近些年，雖然腎臟病的診療有了很大的發展，替代治療也有進一步的提高，然而貧血仍然是造成慢性腎臟病患者死亡和病情加重的主要原因之一。貧血不僅影響慢性腎臟病患者的生活質量，而且增加心血管疾病發生和死亡的風險。雖然rhEPO(重組人促紅細胞生成素)已廣泛應用于腎性貧血治療，但個體對藥物的敏感性和劑量存在顯著差異，約90%-95%的患者應用后，血紅蛋白水平明顯升高，然而約5%-10%的患者應用后不能達到目標值，即出現促紅細胞生成素抵抗，嚴重影響患者的壽命，因此，從基因水平或內源誘導促紅細胞生成素增加是很有必要的，而許多研究發現HIF-1的靶基因為EPO編碼基因[1-3]。因此，我們推測HIF-1可能在基因水平誘導內源性促紅細胞生成素方面起重要作用，從而對重組促紅細胞生成素抵抗患者貧血的改善方面起重要作用，所以本研究從此方面著手進行相關研究。

1　材料與方法

1.1實驗動物

成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，體重(250.0±20.0)g，內蒙古大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(蒙2002-0001)。

1.2主要儀器與試劑

MICROS-60血細胞分析儀(法國ABX公司)；CX9全自動生化分析儀(美國Beckman公司)；HITACHl7180全自動生化儀(日本HITACHl公司)；Rabbit Anti-HIF-1(北京博奧森生物技術有限公司)；FITC標記的山羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司)；5%BSA封閉液(武漢博士德生物工程有限公司)；正常山羊血清工作液和辣根酶標記鏈酶卵白素工作液(S-A/HRP)購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3動物模型的制作及分組

根據參考文獻[4,5]，通過兩步法進行5/6腎切除，兩次手術前后相隔一周。適應性喂養1周后，大鼠用10%水合氯醛(0.3 ml/kg)腹腔注射，20 min左右麻醉后俯臥位固定、局部剪毛、常規皮膚消毒，行左側斜向外下方(腎區)切口3-4 cm，充分暴露左側腎臟，剝離腎包膜，先夾閉腎臟上下極，待夾閉區域因缺血變深呈紫黑色，迅速切除上下極及左腎外側緣，共切除約2/3腎組織，用明膠海綿止血后還納體內，向腹腔內注入青霉素后，縫合，消毒。7-10 d后行第2次手術。同切除左腎的方法，行右側斜向外下方(腎區)切口3-4 cm，充分暴露右側腎臟，分離腎包膜，結扎腎蒂，待腎臟缺血變深色時，切除右腎，縫合、消毒。

兩次手術共切除約5/6腎臟。待大鼠蘇醒后，放入單籠飼養，保持呼吸道通暢，術后禁食24 h，不禁水，術后密切觀察皮膚切口、精神狀態和進食進水情況。假手術組不切除腎組織，只給予先后2次麻醉和分離雙腎脂肪囊。

右腎切除術后1周，選取存活的18只大鼠，隨機分為假手術組、模型組和促紅細胞生成素組(皮下注射促紅細胞生成素40 IU/kg)，每周2次，直至處死。

1.4血清學指標檢測

酶法測定血清肌酐(Scr)濃度，用血細胞分析儀測定Hb的值。

1.5殘余腎組織病理學檢查

腎組織常規固定，脫水，透明，包埋后3 μm切片，行HE染色和Masson觀察其不同時間點腎組織的病理變化，并進行半定量評分，其評分標準同文獻[6]。

1.6免疫熒光法觀察HIF-1在腎組織的表達

采用BX51/BX52系統軟件分析FITC標記的HIF-1免疫熒光，陽性細胞呈綠色熒光，定位顯示綠色熒光。采用圖像半定量分析方法，每張切片在腎皮質部位隨機采集20個不重疊視野，光鏡下計數HIF-1陽性細胞核，以核數/HP表示。

1.7 Western blot印跡檢查HIF-1蛋白質的表達

用蛋白質抽提試劑提取蛋白質，在12%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，并且電泳的產物轉到硝酸纖維膜上。用含有5%的脫脂奶粉封閉膜1 h，加入一抗(以1∶100稀釋)于4 ℃孵育過夜，用TBST和TBS洗完膜后，HRP標記的二抗(以1∶500稀釋)在室溫下孵育1 h，然后再次用TBST和TBS洗膜，用ECL顯色并曝光成像。以beta-actin為內參，應用紫外透視成像系統對X線片進行光密度分析蛋白質的相對表達量，并掃描。

1.8統計學分析

2　結果

2.1大鼠腎功能及血紅蛋白改變

與假手術組比較，模型組血肌酐明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)，模型組與EPO干預組相比，差異無統計學意義(P>0.05，見表1)。與假手術組比較，模型組Hb明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)，EPO干預組貧血較模型組有所改善，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2殘余腎組織病理改變

HE和Masson染色發現，假手術組腎小球、腎小管、腎間質無明顯改變(圖1A、D)。模型組部分腎小球結構紊亂，出現節段性硬化，腎間質局灶性纖維化，炎性細胞浸潤，上皮萎縮(圖1B、E)。注射EPO后，殘余腎組織的病理改變不明顯(圖1C、F)。模型組腎小球硬化指數為3.24±0.98，EPO組為3.13±0.88，兩組之間差異無統計學意義(P>0.05，見表2)。

表1各實驗組大鼠測血清肌酐、Hb含量比較(n=6)

Table 1Comparison of serum Scr and Hb contents among three groups(n=6)

組別 Scr(μmol/L)Hb(g/L)假手術組25.78±0.8115.21±0.52模型組125.79±14.09*11.30±0.52*EPO組126.24±13.99*12.55±0.53#

與假手術組比較,*P<0.05；與模型組比較,#P<0.05

圖1　殘余腎組織的形態學改變 (×40)Figure 1　Changes of renal pathology by HE and Masson staining (×40)

表2各組實驗大鼠腎小球硬化指數和腎小管間質損傷程度比較(n=6)

Table 2Comparison of glomerulosclerosis index and damage degree of renal tubule among three groups(n=6)

組別腎小球硬化指數腎小管損傷程度假手術組0.00±0.000.01±0.01模型組3.24±1.39*4.76±0.50*EPO組3.13±1.23*4.90±0.49*

與假手術組比較，*P<0.05

2.3免疫熒光檢查HIF-1在殘腎組織中的表達

在免疫熒光中，HIF-1陽性細胞呈綠色熒光，定位顯示為黃色熒光。假手術組HIF-1在腎組織細胞核染色偶見(圖2A)，相反HIF-1在殘余腎組織術后3個月，細胞核黃染陽性率增加明顯，主要在萎縮擴張的腎小管上皮細胞表達明顯(圖2B)。但是注射EPO之后，HIF-1表達相應地減少(圖2C)。同時檢測HIF-1在免疫熒光中的核陽性(細胞核/HP)計數，所得結果如下：與假手術組比較(HIF-1核陽性3±0.56)，模型組HIF-1核陽性達28±1.32，且HIF-1主要在萎縮擴張的腎小管上皮細胞表達。注射EPO后，HIF-1的表達減少，HIF-1核陽性數為20±1.48(P<0.05，見圖3，表3)。

A.假手術組　　　　　　　　　　　B. 模型組　　　　　　　　　　　C. EPO組圖2　 HIF-1在殘腎組織中表達免疫熒光 (×40)Figure 2　HIF-1 expression in remnant kidney by immunofluorescence (×40)

2.4Western blot免疫印跡檢查HIF-1在殘腎組織中的表達

通過Western blot檢測發現，以actin為內參，隨著機體缺氧增加HIF-1蛋白表達有所變化。模型組和EPO組的殘余腎組織的HIF-1蛋白顯著高于假手術組，差異有統計學意義(P<0.05，見圖3,表3)。Western Blot結果顯示：術后隨著機體缺氧逐漸加重，HIF-1的蛋白水平表達逐漸增加 。

1.假手術組；2.模型組；3.EPO組圖3　大鼠殘腎組織 HIF-1蛋白的Western blotFigure 3　Expression of HIF-1 protein in residual kidney tissues by Western blot

表3殘腎組織中HIF-1的表達比較(n=6)

Table 3The HIF-1 expression in residual renal tissues(n=6)

組別HIF-1陽性表達數HIF-1灰度值假手術組3±0.561.7528±0.7412模型組28±1.32*5.8017±0.5904*EPO組20±1.48*#4.9017±0.5984*#

與假手術組比較,*P<0.05；與模型組比較,#P<0.05

3　討論

腎性貧血是慢性腎衰竭患者常見的并發癥之一，促紅細胞生成素分泌的相對或絕對不足以及紅細胞壽命的縮短是慢性腎衰竭腎性貧血的主要原因，研究顯示，紅細胞壽命的縮短與EPO抵抗有關[7]，自1989年rhEPO應用于臨床，有效地減少和改善腎性貧血的發生率，然而也有部分患者應用EPO以后，血紅蛋白水平達不到目標值，可能存在EPO抵抗，因此從分子水平治療腎性貧血顯得尤為重要，所以本研究利用建立大鼠慢性腎衰竭模型，進一步研究影響慢性腎衰竭患者預后的因素。

我們采用大鼠5/6腎切除術后90 d模型，手術組大鼠的Scr值明顯升高，Hb下降。在腎臟病理觀察中，大鼠腎臟在術后90 d時出現腎小球病變加重，腎小球局灶性硬化，上皮萎縮，腎小管間質纖維化等慢性化指標，這與許多文獻報道一致[5,6]，說明慢性腎衰竭動物模型制備成功。

眾所周知，慢性缺血缺氧是促進慢性腎臟病進展和纖維化的重要因素[8,9]。缺氧是腎纖維化發生的重要機制[10]，缺氧誘導缺氧誘導因子(HIF)的表達，從而能減輕腎纖維化的發生，其中HIF-1起主要介導作用[11]。慢性腎功能衰竭時，機體出現貧血狀態，從而會導致機體組織缺血缺氧，繼而會誘發HIF-1的表達顯著增加。本研究所建立的殘余腎組織模型中，經免疫熒光染色觀察發現，HIF-1核陽性主要位于萎縮擴張的腎小管上皮細胞，這與Kairaitis等[12]在小鼠阿霉素腎病中描述的一致，其次在腎小球也有表達。另外，通過Western blot檢測HIF-1蛋白表達水平方面，HIF-1 在模型組表達明顯增加，但是注射EPO之后，檢測殘余腎組織HIF-1表達的變化發現，HIF-1表達減少，說明HIF-1在改善貧血方面起重要作用，其可能機制是HIF-1是一種轉錄調節因子[13]，其能與人促紅細胞生成素(EPO)基因3′端增強的核苷酸序列特異性結合，促進EPO生成，因此，在腎性貧血中，HIF-1的表達增加能改善其腎性貧血狀態。

綜上所述， HIF-1可能在糾正CKD患者貧血中起重要的作用，將來運用誘導HIF-1基因表達或直接給予HIF-1蛋白在治療CKD患者貧血狀態中具有廣闊的前景，對提高患者的生存質量和改善預后具有極其重要意義。

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Effect of HIF-1 on anemia of the chronic renal failure rats induced by 5/6 nephrectomy kidney

SUN Xiuli*,FENG Guozheng,HOU Guocun,LEI Zhenkun,SHANG Xiaomei

(DepartmentofNephrology,BaotouCentralHospital,Baotou014040,China;*Correspondingauthor,E-mail:btszbdf@163.com)

ObjectiveTo explore the effect of HIF-1 expression in the remnant kidney on anemia in the chronic kidney failure model rats caused by 5/6 nephrectomy.MethodsSD male rats with 5/6 nephrectomy were randomly divided into three groups: sham group, model group and EPO group. In EPO group, the recombinant human erythropoietin(rhEPO) 40 IU/kg was injected subcutaneously twice a week at 3 week after operation till the rats were killed. The experimental animals were sacrificed at 90 d after surgery. The samples of blood and residual kidney tissue were collected to detect the contents of Scr and Hb and observe the pathological changes by HE and Masson staining, respectively. Protein expression level of HIF-1 was detected by Western blot and immunofluorescence assay.Results①In model group, most glomeruloes in the remnant kidney showed segmental glomerulosclerosis, renal interstitial fibrosis and gland atrophy. Compared with sham group, the glomerulosclerosis index was significantly increased in model group(P<0.05). However, there was no significant difference between model group and EPO group.②Compared with sham group, the Scr content increased obviously in model group and EPO group(P<0.05). However, there was no significant difference between model group and EPO group(P>0.05).③Compared with sham group, the Hb content increased significantly in model group(P<0.05). But there was no significant difference between model group and EPO group(P<0.05).④Compared with sham group, the expression of HIF-1

chronic renal failure;anemia；HIF-1;hemoglobin

包頭市社會發展科技支撐資助項目(2013S2006-04-05)

孫秀麗，女，1963-10生，碩士，主任醫師，E-mail：332876922@qq.com

2015-12-02

R692

A

1007-6611(2016)03-0223-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.03.007