花生NBS-LRR類基因的克隆及表達特性分析

馮艷芳耿麗麗韓榕張杰

（1. 山西師范大學生命科學學院，臨汾 041004；2. 中國農業科學院植物保護研究所 植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

花生NBS-LRR類基因的克隆及表達特性分析

馮艷芳1，2耿麗麗2韓榕1張杰2

（1. 山西師范大學生命科學學院，臨汾 041004；2. 中國農業科學院植物保護研究所 植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

基于花生轉錄組及基因組數據，克隆獲得一個花生的NBS-LRR類抗逆基因的全長序列，該基因與大豆抗病性蛋白基因（KHN40407.1）的相似性為79％，命名為AhNDrp基因。該基因不含內含子，cDNA 全長2 832 bp，有5個典型的抗逆性蛋白保守結構域，其中DomainⅤ是富含亮氨酸的重復序列。熒光定量PCR分析表明，AhNDrp基因在花生根中特異性表達，且黃曲霉處理后該基因表達量顯著上升，說明該基因可能參與抗病反應。

花生；NBS-LRR基因；基因克隆；表達分析

栽培花生（Arachis hypogaea L.）作為一種重要的油料作物和經濟作物，具有重要的經濟價值和營養價值。2015年我國花生的總產量達1 670萬t，居世界首位。但是一些生物及非生物脅迫會影響花生的產量和品質，如干旱、鹽堿、低溫、寒冷、高溫及各種病原菌等外界不良環境會延緩植物的生長發育，降低植物的生產效率，甚至在極端條件下，會導致植物死亡。植物的應激反應是動態的，涉及到不同調節水平之間錯綜復雜的關系，包括新陳代謝的調節、生理上基因表達的調節和形態上的適應等［1］。使用寄主抗性是控制植物病害最有效、經濟的方式［2］。

有研究表明，抗病基因（R基因）在識別和抵御病原菌入侵方面具有重要作用。編碼具有核苷酸結合位點（NBS）和C-末端富含亮氨酸重復（LRR）的基因，是R基因中最大一類抗性基因［3］。植物NBS-LRR蛋白（nucleotide-binding site-leucine rich re-peat protein）根據氨基酸末端序列可分為兩類，卷曲螺旋（CC）- NBS-LRR類蛋白質和TIR-NBSLRR類蛋白，后一類蛋白在單子葉植物中尚未被鑒別［4，5］，而且TIR-NBS-LRR類蛋白可能比CC-NBSLRR型蛋白起源更早［6］。抗逆性反應的識別過程是基于NBS-LRR蛋白介導的直接或間接的識別病理分子——無毒蛋白AVR進行的，而AVR蛋白突變會使抗逆性反應過程中識別異常，從而導致抗性異常。也有研究表明，抗性反應的識別過程是通過NBSLRR蛋白與轉錄因子的相互作用進行的，Shen 等［7］的研究表明，在大麥中識別白粉病抗性蛋白（Mla10）是通過CC結構域與一個WRKY轉錄因子結構域的相互作用，進行防御反應。NBS結構域位于NBSLRR型蛋白的中間區域，存在于真核生物具有結合ATP和GTP的許多蛋白質之中，如ATP合成酶β亞基、核糖體延伸子、腺苷酸激酶以及抗病基因編碼蛋白等。NBS結構域可以與核苷酸進行結合，LRR結構域在將感知到的病原體激活方面起著至關重要的作用［8-10］。

花生作為豆科植物家族中的一個重要成員，其NBS-LRR類基因在不同脅迫下的功能分析報道尚不多見。本研究以花生抗逆性基因AhNDrp為研究對象，以本課題組此前獲得的花生根轉錄組測序數據為依據［11］，從基因注釋結果中篩選到contig281453為花生抗逆性蛋白，獲得基因的半長序列，利用電子克隆技術獲得AhNDrp全長基因，從而分析該基因在花生不同組織部位（根、莖、葉、幼胚）的表達情況以及干旱和黃曲霉脅迫下的表達特性，旨在為花生抗黃曲霉的機理研究提供依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗材料與處理 供試花生栽培品種白沙1016，由山東省花生研究所提供。花生根、莖、葉取自2周齡的組培苗，幼胚子葉為收集果針入土后25-55 d不同大小的花生莢果，剝皮后混合。所有植物材料取樣后于液氮中迅速冷凍，在-80℃冰箱保存。干旱處理：當花生生長至15 d左右時，選擇健壯且長勢一致的幼苗，用15％ PEG6000溶液模擬干旱處理，分別取未處理及處理后2、4、6和8 h的幼苗根，液氮速凍后于-80℃保存，用于總RNA提取和熒光定量PCR分析。試驗設3次重復。

黃曲霉處理：花生剝去種皮后種植于溫室中，3周后接種黃曲霉孢子。用無菌水收集在PDA培養基上培養2-3 d 的黃曲霉菌孢子，調整孢子濃度為6×108/ mL［12］，噴于花生的根部，分別取未處理及處理后 1、3、5和7 d的幼苗根，液氮速凍后，于-80℃保存，用于熒光定量PCR分析。試驗設3次重復。

1.1.2酶及主要試劑 Primer Star高保真聚合酶購自TaKaRa公司；2×Taq Mix PCR擴增試劑購自北京博邁得生物技術有限公司；pMD19-T Vector購自TaKaRa公司；DNA Marker DL2000分子量標準購自Promega公司；其他試劑均為國產分析純產品。PCR產物測序由北京華大生物技術有限公司完成。反轉錄和熒光定量PCR試劑盒為北京天根公司FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒和SYBR Green熒光定量試劑盒。

1.1.3PCR 引物 引物的合成由上海生工生物技術有限公司完成，引物序列見表 1。

表 1 本研究所用的基因克隆和real-time的引物序列

1.1.4生物信息學數據庫和軟件 花生基因組網址（http：//peanutbase.org）；序列檢索采用NCBI blast （http：//www.ncbi.nlm.Nih.gcv/blast）；蛋白保守結構域分析在（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ wrpsb.cgi）進行；三級結構預測在（http：//swissmodel. expasy.org/workspace/index.php？func=modelling_ simple1）進行；氨基酸同源性比對分析采用DNAMAN軟件；系統發育樹構建采用MEGA4.0軟件。

1.2方法

1.2.1花生基因組的提取 花生基因組DNA的提取采用改良的CTAB法［13］。將提取基因組放于-20℃儲存備用。

1.2.2NBS-LRR類基因全長獲得 根據peanutDB上序列，設計引物見序列表 1。以花生栽培品種白沙1016基因組為模板，AhNDrp-f和AhNDrp-r為引物進行PCR擴增。PCR 擴增程序為：94℃ 10 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 2 min，30個循環；72℃10 min。取PCR產物電泳，選取目的條帶，回收、克隆到 pMD19-T Vector，經 PCR 鑒定正確后進行測序拼接。

1.2.3RNA的提取、cDNA第一鏈的合成 RNA的提取 采用上海生工生物工程有限公司TRIzol試劑，提取方法參見說明書。TaKaRa公司的DNaseⅠ用于消化殘留 DNA，cDNA 第一條鏈的合成用天根的FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒。

1.2.4花生AhNDrp的mRNA轉錄分析 分別提取花生2周齡的根、莖、葉和不同生長時期混合幼胚的總RNA及干旱和黃曲霉接種處理下不同時期的花生根總RNA，反轉錄成cDNA，進行AhNDrp基因表達特性分析。用天根公司的SYBR Green熒光定量試劑盒檢測花生AhNDrp基因的表達量。設actin基因為內部參照，AhNDrp-real-time-f和AhNDrp-realtime-r分別為擴增目的基因的上下游引物。PCR 擴增程序為：95℃ 15 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個循環。序列中不包含內含子，編碼943個氨基酸，終止密碼子為TAG（圖2）。

圖1　AhNDrp基因的擴增結果

圖2　AhNDrp基因的結構示意圖

2　結果

2.1AhNDrp全長基因的獲得與序列分析

本實驗室經轉錄組測序，獲得一條1 970 bp的EST序列（contig281453），在NCBI上進行比對，注釋為NBS-LRR型抗逆性蛋白（NBS-LRR type disease resistance protein）。將該序列與http：//peanutbase.org網站上公布的花生基因組序列進行比對，根據比對結果設計引物（AhNDrp-f/r），以花生基因組為模板，擴增得到3 200 bp的片段（圖1），送測序。在NCBI數據庫中進行相似性比較，該蛋白與大豆抗逆性蛋白（Glycine soja disease resistance protein RPM1，GenBank No：KHN40407.1）的相似性最高為79％。將該基因命名為AhNDrp基因，編碼區為2 832 bp，GenBank登錄號為KU128398。AhNDrp基因DNA序列與cDNA序列比對分析發現，AhNDrp基因DNA

2.2AhNDrp蛋白的生物信息學分析

2.2.1AhNDrp蛋白的保守結構域分析及三維結構預測 使用CDD（conserved domain database）在線數據庫進行蛋白功能結構域的預測，發現AhNDrp蛋白有5個典型的抗逆性蛋白保守結構域（圖3）。其中DomainⅠ為RX-CC-like結構域，位于2-127區，與抗病反應的必要因素RanGAP2相互作用；DomainⅡ為AAA-ATP酶結構域，由117個氨基酸組成，包含一個P-Loop（NBS結構域中的保守基序）元件；DomainⅤ位于595-804區，由209個氨基酸組成，是富含亮氨酸重復序列，LRR基序可參加蛋白-蛋白互作，在分子識別過程中發揮重要的作用。這3個保守區域說明AhNDrp屬于NBS-LRR型抗逆性蛋白。

利用同源建模的分析工具SWISS-MODEL對花生NDrp蛋白結構域進行三維結預測。軟件自動選擇PDB數據庫中的2qkwB作為模板，對目標蛋白的605-879氨基酸進行3-D結構預測，如圖4所示，蛋白的胞內結構域是由132個α-螺旋、65個無規則卷曲、52個延伸鏈和26個β-折疊連接共同構成的復雜結構。

圖3　花生AhNDrp蛋白保守結構域預測分析

圖4　花生NDrp蛋白的三級結構

2.2.2AhNDrp蛋白同源性分析 將AhNDrp蛋白序列與豆科植物花生、大豆、野生大豆、鷹嘴豆、菜豆（Phaseolus vulgaris，XP_007158209.1）、苜蓿（Medicago truncatula，AF491998.1）和非豆科植物白梨（P.×bretschneideri，XP_009373508.1）、蘋果（Malus domestica，XP_008342592.1）、薔薇科落葉喬木植物梅（Prunus mume，XP_008238133.1）、可可（Theobroma cacao，XP_007040756.1）、川桑（Morus notabilis，XP_010110397.1）的抗逆性蛋白序列進行多重比對，并構建系統發育樹（圖5）。白沙1016號花生AhNDrp蛋白與白梨和蘋果的進化關系最近；苜蓿和菜豆等次之；與鷹嘴豆、梅的進化關系最遠。

2.3AhNDrp基因在干旱和黃曲霉處理下的表達特性分析

通過熒光定量PCR方法分析花生品種BS1016 中AhNDrp基因的表達情況，結果（圖6-A）顯示AhNDrp基因在莖、葉、幼胚中均無表達，僅在根中特異表達。用15％ PEG6000溶液模擬干旱脅迫處理，分析0-8 h AhNDrp基因在花生根中的表達量（圖6-B），發現隨著干旱處理時間的增加AhNDrp基因表達量也逐漸上升，在處理6 h時表達量最高，處理8 h時表達量降低，但該基因在干旱處理下的表達量始終低于未處理時的植株，說明AhNDrp基因無抗干旱能力。用孢子濃度為6×108/mL的黃曲霉處理花生后，0-3 d，AhNDrp基因的表達量處于上升階段，在3 d達到最高表達量，為對照表達量的1.62倍；之后開始下降，在第7天時表達量降到最低，明顯低于對照組及其他處理組（圖6-C）。

圖5　12種植物抗逆性蛋白的系統發育樹

3　討論

目前花生基因組測序已經取得重要進展，部分基因組已公布（http：//peanutbase.org），為花生新基因克隆及基因功能研究等提供了數據平臺。本實驗室通過對花生根、葉及未成熟種子的轉錄組深度測序，構建了含3萬多條花生EST序列的數據庫。本研究結合轉錄組數據和基因組測序，成功克隆到了花生AhNDrp全長基因，并利用生物信息學方法對該抗逆性蛋白結構和功能進行了預測，為后續探究花生抗逆性基因的表達調控和作用機制提供參考。

有報道指出，NBS-LRR類基因是在進化過程中通過串聯或部分復制祖先基因而得到的。NBS結構域包含幾個保守基序：P-loop、kinase 2a、kinase 3a 和GLPL motifs等［14］；P-loop被證明在ATP結合能力中起到關鍵作用［10］，在煙草［15］和擬南芥［16］PR5中也得到類似結論；kinase-3a激酶可以結合嘌呤或核糖［14］，但是NBS結構域在植物抗病性機制中的作用尚不清楚。LRR結構域在蛋白與蛋白之間的相互作用中發揮重要作用，最新研究結果表明LRR蛋白片段足以啟動防御信號［17］，是識別病原體衍生的效應分子，隨后激活宿主防御反應。LRR蛋白的多種結構域使其可以同時作為病原體探測器、傳感器、開關和響應因子［18］。這些NBS-LRR類蛋白質在細胞生長、風化、細胞骨架的形成、囊泡運輸和防御反應中起重要作用。目前，已從不同植物中克隆得到一些NBS-LRR類基因，例如，何利等［19］從桑樹中克隆到5個NBS類基因分別為CL93、Unigene14278、Unigene26173、Unigene32704、Unigene31320的片段；史靜東等［20］利用同源序列法分離小麥NBS-LRR類抗病基因類似片段，獲得4 個RGAs片段。本研究利用電子克隆的方法，克隆得到的基因全長2 832 bp，命名為AhNDrp基因，含有NBS-LRR類抗病基因典型的保守結構域。

圖6　AhNDrp基因口花生根、莖、葉、幼胚（A）及干旱（B）和黃曲霉接種處理下（C）花生根口表達分析

劉建成等［21］從草莓中克隆得到一個NBS-LRR類基因，經半定量 RT-PCR 分析顯示，該基因在草莓的所有組織中都表達，但在莖尖分生組織中表達水平最高，且在葉中的表達水平明顯受到外源水楊酸和脫落酸處理的影響。本研究中克隆的AhNDrp基因只在花生根部特異性表達，與前期轉錄組測序結果及半定量RT-PCR的結果一致。趙小波等［22］在花生抗旱品種中克隆到NBS-LRR類PDRl基因，該基因在干旱脅迫處理12 h 后表達量達到峰值。但本研究中，干旱處理后AhNDrp基因的表達量始終低于未處理時的植株，說明該基因的表達產物不參與干旱脅迫的響應，被迫應答干旱脅迫。

劉宇等［23］克隆到花生抗病基因，并測得在黃曲霉侵染后，種皮、籽仁及果皮中基因PnAG3的表達量都上升。而經黃曲霉脅迫后，AhNDrp基因在0-3 d中表達量持續上升，說明該基因可能參與了黃曲霉抗病反應過程。

NBS-LRR類基因是一類抗逆性基因，黃曲霉是一種致病性真菌，而在干旱脅迫下，黃曲霉菌株可能成為土壤中的優勢菌株，導致花生黃曲霉毒素污染、品質下降等。所以測定AhNDrp基因在干旱和黃曲霉脅迫下的表達量，為在理想遺傳背景下引進高效抗病基因的育種工作提供一定的參考。

4　結論

本研究克隆了花生AhNDrp基因的全長序列，含有NBS-LRR保守結構域，該基因在花生根部特異表達，并根據實時熒光定量PCR結果，推測其可能參與黃曲霉脅迫響應。

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（責任編輯 李楠）

Cloning and Expression Pattern Analysis of NBS-LRR Like-gene in Peanut

FENG Yan-fang1，2GENG Li-li2HAN Rong1ZHANG Jie2
（1. School of Life Sciences，Shanxi Normal University，Linfen 041004；2. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193）

Based on peanut's transcriptome and genome data，a full length sequence of NBS-LRR like-gene was cloned. This gene，which showed 79％ similarity with disease resistance protein（KHN40407.1）of Glycine soja，was designated as AhNDrp gene. The length of cDNA of AhNDrp gene was 2 832 bp，and contained no intron. AhNDrp gene harbored 5 typical conserved domains with resistance-related protein，and Domain V was repeat sequence with rich leucine. Real-time quantitative PCR analysis showed that AhNDrp gene was expressed exclusively in root，and the expression was significantly increased after aflatoxin treatment，indicating that this gene was involved in the resistance response.

peanut；NBS-LRR gene；gene clone；expression analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.014

2015-12-24

國家自然科學基金青年基金項目（31501711）

馮艷芳，女，碩士，研究方向：抗蟲植物基因工程；E-mail：yanfang1369@163.com

韓榕，男，博士，教授，研究方向：環境植物學；E-mail：hhwrsl@163.com張杰，男，博士，研究員，研究方向：生防微生物功能基因；E-mail：jzhang@ippcaas.cn