嗜麥芽寡養單胞菌角蛋白酶基因在畢赤酵母中的表達

李光磊張娟，2方真，2隆明星堵國成，2陳堅

（1. 江南大學生物工程學院，無錫 214122；2. 江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122；3. 江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，無錫 214122）

嗜麥芽寡養單胞菌角蛋白酶基因在畢赤酵母中的表達

李光磊1張娟1，2方真1，2隆明星1堵國成1，2陳堅2，3

（1. 江南大學生物工程學院，無錫 214122；2. 江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122；3. 江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，無錫 214122）

將嗜麥芽寡養單胞菌BBE11-1來源的角蛋白酶基因kerD進行畢赤酵母密碼子優化，構建重組載體pPIC9k-kerD；整合該重組載體到畢赤酵母SMD1168基因組，篩選到Mut+型重組子；對利用G418抗性篩選到的重組子進行甲醇誘導，篩選到產酶效果最好的重組菌株。純化和SDS-PAGE檢測表達的重組酶，研究重組酶的部分酶學性質，結果表明，重組酶的最適反應pH為10，最適反應溫度為60℃。為進一步提高目的蛋白的產量，采用甲醇與山梨醇和甘露醇混合流加的策略，優化重組菌產角蛋白酶的發酵過程。結果表明，甲醇與甘露醇以20∶0.5比例混合流加，發酵168 h，角蛋白酶的產量2 048 U/mL，比單流加甲醇提高了87.2％。

角蛋白酶；畢赤酵母；酶學性質；雙碳源；發酵優化

角蛋白是自然界中廣泛存在的一種硬性蛋白，是動物的毛發、羽毛、表皮和蹄角的組成成分［1］。角蛋白結構中β折疊結構較多，富含半胱氨酸和二硫鍵，不溶于水、抗分解，通常較難被一般的蛋白酶降解［2］；化學方法降解角蛋白，不僅效率低，且產生較多下游廢棄物，造成極大的資源浪費和環境污染［3］。角蛋白酶能專一性降解角蛋白，細菌［4］、真菌［5］、放線菌［6］等微生物均可分泌，能有效地將羽毛、羊毛等角蛋白降解成動物和人可以利用的氨基酸等產物［7］，在制革、飼料、環境保護等工業中有廣泛的應用前景。目前，產角蛋白酶的原始菌株由于角蛋白酶表達量不高［8］或菌株本身具有致病性［9］等因素，較少用于角蛋白酶的商業化生產。在已開展的角蛋白酶基因的克隆和異源表達研究中，以大腸桿菌為角蛋白酶的表達宿主時，通常產生包涵體，導致產酶效率不高［10］；利用枯草芽孢桿菌生產角蛋白酶時，角蛋白酶產量不高，且產物對細胞的毒害作用導致細胞裂解，難以進行擴大培養［11］。巴斯德畢赤酵母是一種強效真核表達系統，由于外源基因遺傳穩定、亞細胞結構的天然修飾、過氧化物酶體對細胞的保護、可進行高密度培養等優勢，目前已有多種外源蛋白在該表達系統中得到了成功表達［12-14］。在前期研究中，本團隊篩選到一株嗜麥芽寡養單胞菌BBE11-1，表達的角蛋白酶能有效降解羽毛和羊毛，但基于菌株的培養成本及角蛋白酶分泌量等因素，本研究擬將該角蛋白酶基因進行密碼子優化，克隆到畢赤酵母表達系統，以期獲得高效表達的、對羊毛和羽毛具有特異性降解作用的角蛋白酶重組菌株，旨為角蛋白酶的工業化生產提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1質粒和菌株 嗜麥芽寡養單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia BBE11-1）來源的角蛋白酶基因序列由本實驗室克隆得到，將該基因序列根據畢赤酵母密碼子偏好性進行優化，再全基因合成，得到基因序列kerD，由南京金斯瑞公司完成。大腸桿菌（JM109）菌株由本實驗室保藏。巴氏畢赤酵母菌株Pichia pastoris SMD1168和分泌型表達載體pPIC9k由Invitrogen公司提供。

1.1.2酶和試劑 EcoR I、Not I和Sac I等限制性內切酶、DNA聚合酶（PrimeSTAR HS premix）、DNA連接酶、Ex Taq DNA聚合酶等均購自TaKaRa公司，G418、質粒提取試劑盒、感受態制備試劑盒、福林酚試劑均購自上海Sangon公司，DNA純化試劑盒和膠回收試劑盒購自Thermo公司。SDS-PAGE所用的試劑購自Life公司，可溶性角蛋白購自東京化成工業株式會社，其他常規試劑采用國產分析純或進口分裝。

1.1.3引物的設計與合成 根據kerD基因序列設計引物EcoR I-F：5'-CCGGAATTCGCAGGACTTCCAACCAGAGAAC-3'和Not I-R：5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTGAGTTGCCAAAATGGAAACAC-3'，根據質粒pPIC9k設計引物5'AOX1：5'-GACTGGTCCAATTGACAAGC-3'和3'AOX1：5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'。引物的合成由上海Sangon公司完成。

1.2方法

1.2.1培養基和培養條件 大腸桿菌培養使用LB培養基，配方及培養條件見pET系統手冊；酵母培養使用YPD、MD、MM、BMGY、BMMY培養基，配方及培養條件見 Invitrogen公司的畢赤酵母操作手冊［15］。

1.2.2重組載體的構建 利用引物EcoR I-F、Not I-R，通過PCR分別在基因兩端添加EcoR I和Not I酶切位點。將PCR產物和載體pPIC9k分別用EcoR I和Not I雙酶切，酶切產物利用DNA純化試劑盒純化，連接。連接產物轉化大腸桿菌GM109感受態細胞，利用含有卡那霉素的LB平板篩選陽性克隆，經菌落PCR驗證和酶切驗證，片段大小正確后再進行測序鑒定，最終獲得含有正確序列的重組質粒pPIC9kkerD。

1.2.3重組畢赤酵母的構建及平板篩選 將重組質粒pPIC9k-kerD用Sac I線性化，電轉化畢赤酵母SMD1168感受態細胞，電轉化條件為：15 μL質粒（500 ng/mL）加入到85 μL的SMD1168感受態細胞中，混合后移入預冷的2 mm的電轉杯中，冰上放置10 min。電壓1 500 v，電容25 μF，電阻200 Ω。電擊后加1 mL預冷的1 mol/L的山梨醇溶液至電轉杯，混勻后將溶液轉移至1.5 mL EP管中，3 000 r/min離心2 min，去上清。加100 μL預冷的1 mol/L的山梨醇溶液，涂布MD平板。利用MD平板篩選His+型（組氨酸缺陷回復突變型）重組菌株，再將得到的陽性克隆轉接到MM平板上篩選Mut+型（甲醇利用快速型）的重組菌株。將篩選到的Mut+型的重組菌株分別轉接到含有1、2、3、4和5 mg/mL的G418 YPD平板上，篩選到含有不同拷貝數目的基因的重組菌株，最后進行特異性菌落PCR（引物EcoR I-F 和3' AOX）驗證，篩選得到P. pastoris SMD1168-pPIC9k-kerD。

1.2.4重組畢赤酵母的搖瓶篩選 挑取上述篩選到的重組菌，接種到25 mL的BMGY培養基中，30℃，220 r/min培養24 h，5 000 r/min離心5 min，去上清，用50 mL的BMMY培養基重懸后置于500 mL錐形瓶中30℃，220 r/min誘導表達。每24 h向培養基中添加無水甲醇，使其終濃度維持0.5％，每24 h取樣離心測定上清液中角蛋白酶的活性，從中篩選到表達角蛋白酶活性最高的一株重組菌株。

1.2.5角蛋白酶活力的測定 取兩只1.5 mL EP管，分為樣品組和對照組，分別加入150 μL pH9.0的50 mmol/L甘氨酸-NaOH緩沖液、50 μL的發酵上清液，對照組再加入200 μL的4％的三氯乙酸溶液混勻，都分別再加入100 μL的2.5％的角蛋白溶液，置于50℃金屬浴中，準確反應20 min，向樣品組中加入200 μL的4％的三氯乙酸溶液混勻。10 000 r/min下離心5 min。分別取200 μL上清液于新的1.5 mL EP管，分別加入1 mL的0.4 mol/L的NaCO3溶液、200 μL的福林酚溶液，50℃金屬浴中準確反應10 min，冷卻至室溫，利用分光光度計測定660 nm處吸光值，以三氯乙酸使酶失活的樣品作對照，根據酪氨酸標準曲線換算酶活［16］。酶活的定義：50℃，pH9.0條件下，角蛋白酶催化角蛋白反應過程中，1 min生成1 μg的酪氨酸所需的酶量為一個角蛋白酶酶活力單位，以U/mL表示。

1.2.6重組角蛋白酶的純化與SDS-PAGE 發酵液8 000 r/min離心2 min，取上清，在攪拌過程中緩慢加入30％（質量與體積比）的（NH4）2SO4，離心2 min，抽濾上清。使用AKTA PURE純化重組角蛋白酶，純化柱使用Hi Trap Phenyl FF（high sub），1 mL，A流動相為1 mol/L（NH4）2SO4溶液，B流動相為20 mmol/L pH7.0的Tris-HCl緩沖液，上樣量10 mL，流速1.0 mL /min，12％-100％ B梯度洗脫8 CV，100％ B洗脫5 CV。

使用12％聚丙烯酰胺凝膠預置膠對發酵樣品和純化樣品進行SDS-PAGE分析。

1.2.7醇氧化酶AOX活力的測定 1 mL發酵液，8 000 r/min下離心2 min，去上清，細胞沉淀用去離子水重懸洗滌兩次，離心，用50 mmol/L pH7.5的PBS溶液重懸，測定OD600 nm。取300 μL的重懸液于0℃機械破碎，加入700 μL PBS溶液，混勻，4℃，8 000 r/min 離心10 min，取上清，置于0℃。反應體系共3 mL：100 mmol pH6.0的磷酸鉀緩沖液，4.3 μmol的苯酚，200 μmol的甲醇，1 μmol的APP，15 U的辣根過氧化物酶以及適量待測酶液。在37℃、500 nm，用UV2450分光光度計動態測定無細胞酶液吸光度的改變，計算出醌的增加量，測定AOX醇氧化酶的活力［17］。酶活力單位定義為：1 mL細胞重懸液，在OD600=1時，37℃，pH6.0的條件下每分鐘產生1 μmol的過氧化氫（H2O2）所需的酶量，以U/mL表示。

1.2.8雙碳源混合流加發酵過程優化 將通過搖瓶篩選到的重組菌株轉接到YPD平板，挑取單菌落接種到含有100 mL的YPD培養基的1 L搖瓶中，置于搖床中30℃，220 r/min培養24 h作為種子液。將其接種到含有800 mL的BSM培養基的3 L全自動發酵罐（LiFlus GM BioTRON，Korea）中。以50％氨水和磷酸溶液控制pH5.5，30℃，調節攪拌轉速500 r/min，通氣量2 vvm；當甘油耗盡（DO迅速上升，且DO大于60％時），開始以指數流加方式流加350 mL的50％（W/V）甘油（含12 mL/L PTM1），維持比生長速率約0.18/h，并逐漸將攪拌轉速調節到1 000 r/min，通氣量調節到4 vvm。待甘油再次耗盡，繼續保持體系中基質匱乏狀態約1 h且DO大于60％后，開始流加甲醇與山梨醇（甘露醇）（分別以W/W 20∶0.5、20∶1、20∶1.5、20∶2的混合方式），以反饋流加的方式維持培養基中的甲醇濃度在1.8％ （V/V）。從發酵開始每隔12 h取一次樣，7 000 r/min離心1.5 min，分別取上清和菌體，測定菌體干重和上清酶活。

1.2.9重組角蛋白酶對羊毛的處理 取兩個50 mL錐形瓶，分別加入緩沖液3 mL，羊毛0.3 g，樣品組加1 mL純化的酶液，對照組加1 mL滅活（沸水浴20 min）的酶液，用塑料膜封口，50℃震蕩24 h。將羊毛取出晾干，拍照并做電子顯微鏡掃描。

2　結果

2.1重組載體構建

將kerD基因插入畢赤酵母分泌表達載體pPIC9k中，獲得重組載體pPIC9k-kerD。用EcoR I 和Not I雙酶切，得到兩個片段分別為9.3 kb和1.7 kb（圖1），測序結果進一步證明重組載體構建成功。

圖 1 重組載體pPIC9k-kerD酶切驗證

2.2重組畢赤酵母的篩選和誘導表達

先后利用MD、MM和YPD-G418平板，共篩選到14株含有不同拷貝數目的基因的Mut+型轉化子。用引物EcoR I-F和3'AOX1對這些轉化子進行菌落PCR，擴增出的條帶與目的基因大小相符（圖2）。對這些轉化子進行甲醇誘導表達，結果表明，誘導144 h時，從3 mg/mL G418的YPD平板上篩選的一株轉化子酶活最高（248 U/mL）。在3 L發酵罐上，對該轉化子進行誘導表達，誘導156 h時，菌體干重達到133.8 g/L，酶活1 094 U/mL。

圖2　重組子的菌落PCR

2.3重組角蛋白酶的SDS-PAGE及檢測

發酵罐72 h，發酵液上清經SDS-PAGE分析，在38-49 kD之間有兩條特異性的條帶（圖3），且隨著發酵時間的增長，分子量較小的條帶越來越清晰。將兩個條帶切下來，經過MALDI-TOFMS/MS和N端測序分析，分子量較小的為成熟酶，而分子量較大的蛋白的前導肽沒有被剪切掉。

2.4重組角蛋白酶的酶學性質分析

分別配制50 mmol/L pH4、pH5的乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH6、pH7磷酸緩沖液，pH8 Tris-HCl緩沖液，pH9、pH10、pH11甘氨酸-NaOH緩沖液，在50℃下測定重組角蛋白酶的最適pH為10（圖4）。將酶分別置于上述不同pH條件下，50℃保存60 min后測定酶活，以樣品在最適條件下的最高酶活作對照，分析重組角蛋白酶的pH穩定性。結果（圖5）表明，重組角蛋白酶在pH5-9，經過60 min仍保留40％的比酶活，在pH9條件下保存60 min，仍然有最大酶活的64.5％，pH 大于10后，酶活迅速降低，pH10下保存60 min，酶活只剩余初始酶活的25.5％。

分別在30、40、50、60和70℃下測定重組角蛋白酶的活性，測定重組角蛋白酶的最適反應溫度為60℃（圖6）。在pH9的緩沖體系下，將酶分別置于上述不同溫度下，每20 min測定一次酶活，以不同溫度下最初的酶活作對照，分析重組角蛋白酶的熱穩定性，結果（圖7）表明重組角蛋白酶在50℃以下經過100 min仍保留60％的比酶活，但當溫度超過60℃時，比酶活會在20 min內迅速下降到20％。

圖3　重組酵母表達角蛋白酶的SDS-PAGE

圖4　角蛋白酶的最適pH

圖5　角蛋白酶的pH穩定性

圖6　角蛋白酶活性的最適溫度

圖7　角蛋白酶的熱穩定性

2.5雙碳源發酵過程中醇氧化酶AOX的變化

本研究利用AOX酶（醇氧化酶）基因啟動子調控角蛋白酶基因的表達，在非甲醇碳源條件（如甘油和葡萄糖）下，AOX啟動子處于抑制狀態，角蛋白酶基因不表達［18］，而在甲醇做碳源時，角蛋白酶基因被誘導表達，AOX酶的變化直接反映了角蛋白酶基因的表達狀況（圖8）。在重組畢赤酵母表達角蛋白酶的發酵過程中，醇氧化酶的活性在60 h內逐漸增加。60 h后，不同碳源混合發酵過程分別在不同的時間達到最大值，之后又逐漸下降，分別維持在不同的活性值。為了降低甲醇對細胞的毒害作用，同時又不抑制AOX啟動子，采用AOX啟動子的非抑制性碳源-山梨醇和甘露醇與甲醇混合流加發酵。甲醇與山梨醇以20∶1混合流加時，AOX活性最高（62.9 U/mL），比單流加甲醇提高32.2％；60 h后AOX活性最低（33.3 U/mL），比單流加甲醇提高162.2％。甲醇與甘露醇以20∶0.5混合流加時，AOX活性最高（69.4 U/mL），比單流加甲醇提高46.1％，60 h后AOX活性最低（46.5 U/mL），比單流加甲醇提高266.1％

圖8　甲醇與山梨醇（A）及甘露醇（B）混合流加中AOX酶活性變化

2.6雙碳源混合流加的發酵優化

為了提高重組畢赤酵母發酵生產角蛋白酶的產量，在3 L發酵罐中研究了雙碳源［甲醇與山梨醇（圖9-A和圖9-B）和甲醇與甘露醇（圖10-A和圖10-B）］混合流加對發酵過程中生物量和角蛋白酶產量的變化。當甲醇與山梨醇以20∶0.5和20∶1（W/W）混合流加時，生物量和角蛋白酶產量都比單一流加甲醇有所提高，而甲醇與山梨醇以20∶1.5和20∶2 （W/W）混合流加時結果卻相反。其中甲醇與山梨醇以20∶1混合流加，發酵168 h，菌體干重達到166.2 g/L，角蛋白酶產量達到1 463 U/mL，比單一流加甲醇分別提高了22.9％和33.7％。

圖9　甲醇與山梨醇混合流加中菌體干重變化（A）及角蛋白酶產量變化（B）

甲醇與甘露醇混合流加時，20∶0.5、20∶1、20∶1.5的混合比例都促進發酵過程中生物量和角蛋白酶產量的增加。甲醇與甘露醇以20∶0.5比例混合流加，發酵168 h，菌體干重達到134.4 g/L，角蛋白酶的產量達到2 048 U/mL，角蛋白酶產量比單流加甲醇提高了87.2％，菌體干重卻僅增加了0.4％。在一定程度上增加甘露醇的流加比例，角蛋白酶的產量比單一流加甲醇時有所提高，甲醇與甘露醇的混合比例為20∶2時，生物量和角蛋白酶的產量都有下降。

圖10　甲醇與甘露醇混合流加中菌體干重變化（A）及角蛋白酶產量變化（B）

2.7重組角蛋白酶對羊毛的處理效果分析

將羊毛分別用滅活后的角蛋白酶以及有活性的角蛋白酶進行處理，如圖11所示，前者呈球狀，纖維集合體較為緊密，而后者呈餅狀，纖維集合體較疏松，表明經重組角蛋白酶處理后的羊毛具備了一定的抗氈化作用。

分別對上述兩種羊毛進行電子顯微鏡掃描，對比檢測結果（圖12）發現，角蛋白酶處理過的羊毛纖維表面的鱗片層被破壞，表層邊緣斷裂，表面附著較多碎屑，說明角蛋白酶能夠有效降解羊毛表面的鱗片層。

圖 11 重組角蛋白酶對羊毛的處理效果分析

圖12　羊毛纖維的電子顯微鏡掃描圖片

3　討論

pPIC9k攜帶的卡那霉素抗性賦予重組子G418抗性，而隨著目的基因在畢赤酵母基因組上的拷貝數目的增加，重組子對G418的抗性也逐漸增加，因此可以利用重組子對G418的抗性篩選到目的基因的拷貝數目不同的重組子。理論上講，目的基因的拷貝數目越高，目的產物的表達量越高，但是李兵等［19］的研究表明基因拷貝數對基因產物表達量的影響是無法預測的，高表達菌株的篩選應以表達的蛋白量或酶活為標準。本研究最終篩選到抗3 mg/mL G418的重組子的產酶能力最好，根據Invitrogen公司的多拷貝畢赤酵母表達系統說明書的經驗數據，推測目的基因的拷貝數在5個拷貝左右。

畢赤酵母通常被用來高密度發酵來提高外源蛋白的表達量，因此對篩選到的重組子進行了3 L發酵罐誘導發酵，并利用疏水層析對目的蛋白進行了純化。SDS等實驗結果表明部分目的蛋白的前導肽沒有被剪切掉，而條帶的變化表明未正確折疊的目的蛋白在體外可以自身折疊形成成熟酶。就重組角蛋白酶的酶學性質來看，該重組酶反應的pH的范圍較大，在其最適pH（pH10.0）上下變動一個單位，酶活下降很小，可見該酶對pH值不是很敏感，反應過程中pH在一定程度上變化不會對該酶的酶活造成大的影響。從pH穩定性上來看，該酶在適當的堿性環境下放置1 h仍然可以保留多半的酶活。另外從溫度對重組酶的影響上來看，該酶降解角蛋白適宜在高溫條件下（50℃）進行，而且酶活在一定溫度范圍內長時間放置損失很少。羊毛、羽毛等角蛋白的降解通常在堿性高溫的環境進行，因此重組角蛋白酶十分適合用于工業中角蛋白的降解。

誘導階段，重組P. pastoris以甲醇為唯一碳源和能源表達外源目的蛋白時，細胞生長和外源蛋白表達是一對十分尖銳的矛盾，共同爭奪碳源和能源，導致外源基因表達效率低下［20］。山梨醇和甘露醇作為已知的對AOX1啟動子沒有抑制作用的碳源［21，22］，通常被用作額外的碳源在誘導階段和甲醇一起流加，不僅可以弱化甲醛異化供能途徑，抑制毒副產物甲醛的生成積累，同時降低體系中甲醇對細胞的壓力，提高AOX1胞內啟動子的表達效率，進一步提高了目的產物的產量［23，24］。本實驗中，采用甲醇與山梨醇和甘露醇混合流加的策略，從兩種碳源的流加效果上來看，適量的山梨醇和甘露醇與甲醇混合流加都能在一定程度上促進膠蛋白酶產量的提高。其中甲醇與甘露醇以適當的比例混合流加時對角蛋白酶的產量的提高影響最大。從結果上來看，雖然山梨醇與甘露醇為同分異構體，但是在重組P. pastoris發酵產角蛋白酶的過程中的影響卻不同，從發酵過程中醇氧化酶的活性變化來看，兩種流加方式中醇氧化酶活性的變化趨勢是相似的，但區別在于誘導表達后期，流加甘露醇時，醇氧化酶的活性一直維持在較高的水平，菌體對甲醇的利用效率更高，更有利于角蛋白酶的表達，因此甘露醇更適合與甲醇混合流加，來降低甲醇對菌體的毒害作用，提高角蛋白酶的產量。

在實際應用中，受羊毛纖維表面鱗片層的結構影響［25］，羊毛經機械力反復作用，會出現纖維集合體逐漸收縮成球的氈化現象，導致羊毛織物在使用過程中發生變形。在本研究中，純化的角蛋白酶作用于羊毛使其鱗片層被破壞，導致羊毛的氈化率下降，進一步證實了本研究獲得的重組角蛋白酶在紡織等行業的應用價值。

4　結論

本研究成功實現了嗜麥芽寡養單胞菌角蛋白酶基因在畢赤酵母SMD1168中的表達，純化的角蛋白酶對羊毛鱗片層有顯著的降解作用，可以用來改性羊毛，降低氈化率。角蛋白酶酶學性質的初步研究表明，該酶為高溫堿性蛋白酶。利用甲醇和甘露醇雙碳源混合流加策略發酵，角蛋白酶的產量達到2 048 U/mL，比單一流加甲醇提高了87.2％，為目前應用酵母生產角蛋白酶報道中的最高水平。

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（責任編輯 馬鑫）

Expression of Keratinase Gene Derived from Stenotrophomonas maltophilia in Pichia pastoris

LI Guang-lei1ZHANG Juan1，2FANG Zhen1，2LONG Ming-xing1DU Guo-cheng1，2CHEN Jian2，3
（1. School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122；2. Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122；3. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122）

kerD，a keratinase gene derived from Stenotrophomonas maltophilia BBE11-1，was optimized by Pichia codon，and then the recombinant vector pPIC9k-kerD was constructed；the recombinant vector was integrated into the Pichia SMD1168 genome，and Mut+recons were screened；recons resisting G418 were induced by methanol，and the best recombinant strain with the highest enzyme production was screened. The recombinant enzyme was purified and detected by SDS-PAGE，while part of the enzymatic properties was investigated. We found that the optimal reaction pH of recombinant enzyme was 10，and the optimal reaction temperature was 60℃. In order to further increase the yield of recombinant enzyme，multi-carbon source feeding strategy，using methanol mixed with sorbitol and mannitol as carbon source，was used to optimize the formation of producing keratinase by the recombinant strain. The results showed that when mixing ratio of methanol to mannitol was 20∶0.5，fermenting 168 h，production of recombinant keratinase reached 2 048 U/mL，which was improved 87.2％ from single methanol carbon.

keratinase；Pichia pastoris；enzymatic properties；double carbon source；optimization of fermentation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.023

2016-02-03

國家高技術研究發展計劃（2011AA100905），國家自然科學基金項目（31470160），中國博士后科學基金特別資助項目（114957）

李光磊，男，碩士研究生，研究方向：發酵工程；E-mail：leegl09@163.com

陳堅，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：食品生物技術和生化工程；E-mail：jchen@jiangnan.edu.cn張娟，女，博士，研究方向：食品微生物生理學與生物化學及食品酶制劑的發酵工學；E-mail：zhangj@jiangnan.edu.cn