兩種不同方法檢測兒童肺炎支原體感染的對比分析

李正秋，　劉蘭香，　劉云花

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臨床研究

兩種不同方法檢測兒童肺炎支原體感染的對比分析

李正秋，劉蘭香，劉云花

目的 比較血清肺炎支原體抗體ELISA檢測和間接血凝試驗法，探討肺炎支原體感染實驗室診斷的高性價比方法。方法2013年12月至2015年1月湖南省兒童醫院兒科收治住院的支氣管肺炎患兒352例，取患兒呼吸道分泌物及血清進行ELISA檢測和間接血凝試驗，并且對血清進行分離培養，以分離培養作為檢測的金標準，比較ELISA檢測和間接血凝試驗的診斷效果。結果間接血凝實驗法的靈敏度為97.5%(159/163)，顯著高于ELISA檢測法86.5%(141/163)，差異有統計學意義(P<0.05)；ELISA檢測法的特異度為91.5%(173/189)，顯著高于間接血凝法70.9%(134/189)，差異有統計學意義(P<0.05)。ELISA檢測法診斷效率為89.2%，Kappa指數為0.782，間接血凝試驗法診斷效率為83.2%，Kappa指數為0.670。兩組方法診斷效率相近，Kappa指數呈中高度一致。結論ELISA檢測和間接血凝實驗法各有優勢，實驗室可按照臨床診斷要求選擇合適的方法進行檢測。

肺炎支原體；分離培養；血清學；免疫；兒童

兒童肺炎支原體感染往往起病緩慢，病程持續長短不一，其致病微生物為肺炎支原體(Mycoplasma pneumonia，MP)，是一種介于細菌和病毒之間的微生物，菌體大小為0.2～0.3 μm，且呈高度多形性[1]，在顯微鏡下難以鑒定。且其癥狀、體征無特異性，患兒胸片尚難以與其他致病原所致感染進行區分，因而臨床上常常漏診或誤診，尤其是當病情控制不佳時，因漏診、使用的抗生素無效而導致的嚴重并發癥常常危及患兒生命。兒童對MP普遍易感，尤其是免疫功能發育不全或低下的患兒常常出現反復感染，為避免錯用、濫用抗生素，MP的實驗室檢查的重要性不言而喻。現臨床上的病原學診斷有兩大類，一是直接病原體檢測，依賴分離培養和PCR法鑒定MP-DNA，其中分離培養和鑒定被認為是感染性疾病診斷的金標準[2]；二是血清學檢測，如采用補體結合試驗檢測MP-IgM，間接血凝試驗及酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測IgM、IgG等。本研究擬將間接血凝試驗與ELISA檢測進行對比，為相關臨床決策及醫療實踐提供參考。

1　資料與方法

1.1臨床資料2013年12月至2015年1月湖南省兒童醫院兒科收治住院的支氣管肺炎患兒352例，其中男200例，女152例；年齡6個月至12歲；其主要癥狀為“發熱、咳嗽、呼吸急促、伴或不伴有流涕”，主要體征為“肺部能聞及中、細濕性啰音”，X線胸片提示肺紋理增強、片狀或斑塊狀陰影等改變。

1.2診斷標準參照《諸福棠實用兒科學》中支氣管肺炎的診斷標準[3]。

1.3納入標準(1)符合支氣管肺炎的診斷標準；(2)年齡6個月至12歲；(3)患兒家屬知情同意。

1.4排除標準(1)不固定在本院治療或中途轉院、轉診者；(2)原發性或繼發性的免疫缺陷疾病者。

1.5偏倚的控制嚴格納入對象的選擇標準，取得患兒及家屬的合作，提高診療依從性，可采用雙份樣本的方法，及時對照，對技術人員進行培訓，按儀器設備要求的環境條件操作，完善質量控制措施。多次復發的患兒只計入一次樣本。

1.6方法352例患兒同時進行分離培養、間接血凝實驗檢查MP-IgM檢測痰液MP。具體如下：

1.6.1MP培養[3]取所有患兒鼻咽拭子、痰液或支氣管分泌物。培養基中富含足量血清和新鮮酵母浸出液，接種后于37 ℃培養5 d，觀察菌落。為提高診療效率，即全面充分利用樣本，避免反復取材，在進行MP培養外，進行藥物敏感試驗。

1.6.2間接血凝實驗取患兒靜脈血2 mL置于采樣管內，離心置于冰箱內備用，實驗時取血清上清液，進行間接血凝試驗。試劑盒購自日本富士MP檢測試劑盒(SERODIA——MYCOⅡ)，載體為明膠粒子，按試劑盒說明書嚴格操作。在微量滴定板或試管中進行，將標本倍比稀釋，稀釋倍率為1∶64，同時設不含標本的稀釋液對照孔。在含稀釋標本1滴的板孔(或試管)中，加入0.5%致敏紅細胞懸液1滴，充分混勻，置室溫1～2 h，即可觀察結果。凡紅細胞沉積于孔底，集中呈1圓點的為不凝集(-)。如紅細胞凝集，則分布于孔底周圍。根據紅細胞凝集的程度判斷陽性反應的強弱，以抖凝集的孔為滴度終點。

1.6.3抗MP-IgM ELISA檢測方法嚴格根據ELISA試劑盒的說明書進行操作，樣本稀釋液中含有IgG/RF吸附劑，要與血清標本充分反應時間超過20 min之后再進行檢測。

1.7觀察指標靈敏度、特異度、診斷指數、診斷效率、陽性預測值、陰性預測值、漏診率、誤診率、可用度、約登指數、Kappa指數。診斷指數值越大，診斷試驗的應用價值也越大，當診斷指數值≤1的試驗應淘汰；診斷效率值俞大，臨床應用價值愈好，診斷效率值≤50%的試驗應予廢棄；患病率相同時，陽性預測值和陰性預測值越接近1，檢測方法的診斷價值越高；診斷性試驗的可用度波動在0～1之間，一般認為，只有可用度≥0.5的試驗才有利用價值；約登指數的取值范圍在(-1，+1)，越接近于+1，診斷的正確性越好；Kappa指數用于評價兩種檢驗方法的兩次檢驗結果的一致性，即可重復性檢驗，是評價可靠性的指標之一，一般認為Kappa指數>0.8則可靠性很好，0.4～0.8表明可靠性中高度一致，<0.4則提示該實驗或檢測方法的可靠性較差。

1.8統計學方法采用SPSS 18.0軟件進行統計學處理，計數資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1間接血凝實驗法的診斷效果分析見表1。

表1　間接血凝實驗法診斷的效果分析(n)

表1結果表明，間接血凝實驗的靈敏度為97.5%(159/163)，特異度為70.9%(134/189)，診斷指數為168.4%，陽性預測值為74.3%(159/214)，陰性預測值為97.1%(134/138)，漏診率為2.5%，誤診率為29.1%，可用度70.49%，約登指數68.4%。

2.2ELISA檢測法診斷的效果分析見表2。

表2　ELISA檢測法診斷的效果分析(n)

表2結果表明，ELISA檢測法的靈敏度為86.5%(141/163)，特異度為91.5%(173/189)，診斷指數為178.0%，陽性預測值為89.8%(141/157)，陰性預測值為88.7%(173/195)，漏診率為13.5%，誤診率為8.5%，可用度78.07%，約登指數78.0%。

表1、表2可知，間接血凝實驗法的靈敏度為97.5%(159/163)，顯著高于ELISA檢測法86.5%(141/163)，差異有統計學意義(χ2=13.54，P<0.05)；ELISA檢測法的特異度為91.5%(173/189)，顯著高于間接血凝法70.9%(134/189)，差異有統計學意義(χ2=26.38，P<0.05)。

2.3間接血凝試驗檢測法和ELISA檢測法的可靠性檢驗見表3。

表3　間接血凝試驗檢測法和ELISA檢測法的可靠性檢驗

表3結果表明，間接血凝試驗檢測法和ELISA檢測法診斷效率相近，兩種檢測方法Kappa指數呈中高度一致。

3　討論

近年來，兒童MP流行有抬頭趨勢，流行年份可達30%，其一年四季均可發病，發病的高峰在每年的6～10月[3]。由MP造成的感染，因其發病隱匿，臨床癥狀及體征、X線表現與其他病原微生物所致的感染并無特異性，常需依賴于兒科醫師根據臨床經驗做出判斷，故不符合循證醫學時代的發展要求。其多臟器、多系統并發癥，如腎炎、關節炎、心肌炎、免疫性溶血、中樞神經系統受累產生的腦膜炎、腦疝等往往危及患兒生命，產生嚴重的疾病負擔。故能在早期確診MP感染，有針對性的使用大環內脂類抗生素，是極其重要的環節之一[4]。

MP感染的確診依賴于MP的實驗檢測，感染性疾病的金標準是病原體的分離和培養，其可以結合藥敏實驗[5]，更能對抗生素的臨床使用提供科學參考。但由于MP的培養條件挑剔且生長緩慢，其敏感度不高，故而限制了其臨床使用范圍。血清學方法現階段有冷凝集試驗、補體結合實驗、間接血凝實驗、ELISA檢測IgM、IgG等。冷凝集試驗因其非特異性不高，其他病原體的感染仍能提示有陽性結果(如呼吸道合胞病毒、腺病毒感染、衣原體感染等)，因而臨床上目前僅為初篩實驗，目前已被棄用；間接血凝試驗是以紅細胞為載體(本法使用明膠粒子作為改良載體)，與待檢樣品中的抗體相結合，出現肉眼可見的凝集現象，依據此來判斷感染與否，本法采用的日本富士MP檢測試劑盒(SERODIA——MYCOⅡ)技術成熟，價格成本不高，且陽性率較高，因而使用廣泛。其主要檢測的血清抗體為抗MP-IgM。本法敏感度較培養法高，但特異度有待商榷，故而易出現假陽性的情況，從而造成誤診。近年來耐紅霉素支原體菌株的出現，提示與臨床實踐中過度使用抗生素有關，因此依據本法在進行抗生素選用時，要注意結果假陽性的可能，應對照細菌耐藥實驗輔助決策。此外尚有ELISA法檢測血清IgM、IgG，葉新明[6]研究指出感染MP的患兒往往血清中IgM出現較早且持續時間較長(在血清中維持在10～16周左右)，該法在MP感染中的早前診斷往往較有臨床意義，但血清IgG則出現時間晚，免疫應答慢，因而該法僅能提供回顧性診斷[7]，同時血清特異性抗體IgM常常與患兒的年齡、發育情況、炎癥反應程度等有關，為提高診斷準確性，往往需要雙份血清抗體滴度4倍及以上方有意義[8]，這無疑增加了取樣的難度，同時準確的結果同樣與取樣的時機密切相關。有研究發現，直接應用P1蛋白和P30蛋白的單克隆抗體通過ELISA方法從患者分泌物、血清中可直接檢測到MP特異性抗原[1,8]，該法特異度、敏感度均高，且不受患者自身免疫應答的影響，出現假陽性的情況較普通血清學方法為小，越來越受到科研工作者的關注，但該法僅運用在科學研究領域，尚未推廣到臨床使用，且其成本較之ELISA檢測抗體法顯然要大，能否納入醫保制度尚需進一步研究。

間接血凝檢測和ELISA檢測的靈敏度度分別為97.5%(159/163)和86.5%(141/163)，與胡元生等[9]的研究結果相一致，此外在可靠性檢驗中，兩種實驗的Kappa指數均較高，提示分離培養法雖然陽性率低、培養時間長，但其特異度、可靠性高，仍然是感染性疾病診斷的良好指標之一。在直接檢測病原體方法中，尚有PCR法直接檢測MP-DNA法，該法敏感度高，有較高的約登指數，但要求的實驗儀器設備、環境條件、人員操作都較高，樣本不能被污染，且檢測花費較高，按成本-效益法看不易推廣。血液生化學指標同樣在MP感染的診斷中發揮重要作用，在檢測微生物學感染證據同時，關注血清降鈣素原與C反應蛋白等指標[10]，更能對病程進行監控，特別是為抗生素的療效提供臨床觀察依據。在MP感染中，血清降鈣素原與C反應蛋白等指標的變化提示出MP可能進入血液循環，出現MP血癥的可能[11]，因而及時控制感染在MP感染中有重大意義。

本次研究采用的ELISA檢測和血凝檢測法，成本低，對儀器設備等硬性條件要求不高、操作易于標準化，人員要求低、對技術人員加強培訓也有利于質量控制，更有利于在廣大基層醫療推廣普及。ELISA檢測和間接血凝實驗法各有優勢，實驗室可以按照臨床診斷要求選擇合適的方法進行檢測。

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(本文編輯：劉穎)

A comparative analysis of two different methods for detection of Mycoplasma pneumoniae infection in children

LIZhengqiu，LIULanxiang，LIUYunhua.

DepartmentofNuclearMedicine，HunanChildren'sHospital，Changsha410007，China.

ObjectiveTo compare the serum Mycoplasma pneumoniae antibody ELISA test with indirect blood coagulation test method, and to explore the high cost-effective method in laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection.MethodsTotally 352 cases of bronchial pneumonia in children hospitalized in Department of Paediatrics of Children's Hospital of Hunan Province from December 2013 to January 2015 were included, and respiratory secretions and serum were made ELISA and indirect hemagglutination test, and serum was isolated and cultured. The separate culture was regarded as the gold standard for the detection. ELISA and indirect hemagglutination test were compared on diagnosis effect.ResultsThe sensitivity of indirect hemagglutination test method was 97.5%(159/163), significantly higher than that of ELISA(86.5%,141/163)(P<0.05); The specificity of ELISA method for the detection was 91.5%(173/189), significantly higher than indirect hemagglutination method(70.9%,134/189), the difference being statistically significant(P<0.05). The diagnostic efficiency of ELISA detection method was 89.2%, the Kappa index being 0.782; the diagnostic efficiency of indirect hemagglutination method was 83.2%, and the Kappa index was 0.670. The diagnostic efficiency of the two methods was similar, and the Kappa index was in a high degree of consistency.ConclusionELISA test and indirect blood coagulation test method have their own advantage, so the laboratory can choose the appropriate method according to the clinical diagnosis.

Mycoplasma pneumonia；Separate culture；Serology；Immune；Children

410007 湖南 長沙，湖南省兒童醫院核醫學科

李正秋(1975-)，男，副主任技師。研究方向：免疫學檢測與小兒內分泌的體外檢測

李正秋，E-mail：535106686@qq.com

10.3969/j.issn.1674-3865.2016.04.017

R725.6

A

1674-3865(2016)04-0423-04

2016-03-17)