mir-17-5p、mir-92a、let-7b表達水平與非小細胞肺癌順鉑耐藥的關系

宋先璐，廖志偉，余宏偉，楊光平，殷 俊廣州醫科大學附屬腫瘤醫院放療科，肺癌研究室，廣東 廣州 50095

基礎研究

mir-17-5p、mir-92a、let-7b表達水平與非小細胞肺癌順鉑耐藥的關系

宋先璐1，廖志偉1，余宏偉1，楊光平2，殷 俊2
廣州醫科大學附屬腫瘤醫院1放療科，2肺癌研究室，廣東 廣州 510095

目的 探討mir-17-5p、mir-92a、let-7b表達水平與非小細胞肺癌順鉑耐藥關系。方法 以人非小細胞肺癌細胞系A549及其耐藥株A549/DDP為研究對象，采用RT-PCR法檢測mir-17-5p、mir-92a及let-7b在細胞中的表達水平，采用cck8檢測其細胞存活情況，采用細胞克隆平臺方法，檢測轉染前后細胞的增殖情況，采用流式細胞儀檢測轉染前后細胞的凋亡情況。結果（1）A549/DDP細胞mir-17-5p的表達水平是A549細胞的2.11±0.25倍（P＜0.05）；A549/DDP細胞mir-92a的表達水平是A549細胞的7.40±1.05倍（P＜0.05）；而A549/DDP細胞let-7b的表達水平是A549細胞的（26.54±2.90）%（P＜0.05）；（2）A549轉染mir-17-5pmimic，mir-92a mimic以及let-7b inhibitor后對順鉑的敏感性下降（P＜0.05）；A549/ddp轉染mir-17-5p inhibitor，mir-92a inhibitor以及let-7b mimic后對順鉑的敏感性增加（P＜0.05）；（3）A549轉染mir-17-5p mimic，mir-92a mimic以及let-7b inhibitor后，細胞形成克隆集落數量數量多于對照組（P＜0.05）；而A549/ddp轉染mir-17-5p inhibitor，mir-92a inhibitor以及let-7b mimic后，細胞形成克隆集落數量數量少于對照組（P＜0.05）；（4）A549轉染mir-17-5p mimic，mir-92a mimic以及let-7b inhibitor后，細胞凋亡率明顯低于對照組（P＜0.05）；而a549/ddp轉染mir-17-5p inhibitor，mir-92a inhibitor以及let-7b mimic后，細胞凋亡率明顯高于對照組（P＜0.05）。結論 Mir-17-5p、mir-92a表達水平升高，let-7b表達水平下降，可以促進肺癌細胞增殖，抑制其凋亡以及使肺癌細胞對順鉑敏感性下降。

肺癌；mir-17-5p；mir-92a；let-7b；順鉑；敏感性

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率都高居前列［1］。在肺癌中，非小細胞肺癌（NSCLC）是最主要的發病類型，并且70%～80%的患者被診斷為晚期NSCLC而失去了手術機會，因此，化療是最主要的治療手段［2］。但是，對化療藥物耐藥成為患者治療過程中的難題［3-5］。

越來越多的研究表明，miRNA在多種癌癥的發生發展中起到重要的作用。對腫瘤細胞的增殖、凋亡以及化療藥物耐藥現象均有影響［6-8］。我們在前期課題的基因芯片的結果中，發現A549表達譜和A549/DDP表達譜之間存在大量的miRNA表達異常，其中包括mir-17-92家族以及let-7b。目前許多文獻證實，mir-17-92家族為原癌基因，能夠促進癌癥的發生發展，let-7b則為抑癌基因，能夠抑制癌癥的發生［9-11］。本文通過細胞和分子生物學實驗，研究了mir-17-5p、mir-92a、let-7b表達水平與非小細胞肺癌順鉑耐藥關系，旨在探討導致NSCLC化療耐藥的機制，為個體化治療方案的制定提供重要的理論基礎和方法。

1　材料與方法

1.1實驗材料

本研究使用的肺癌細胞株A549及其被誘導成順鉑耐藥細胞株A549/DDP由廣州醫科大學附屬腫瘤研究所實驗室提供。

1.2細胞培養

A549、A549/DDP細胞采用含10%胎牛血清、含雙抗的RPMI 1640培養基，于37℃、5%CO2、飽和濕度85%條件下培養，細胞采用0.25%胰蛋白酶消化傳代或離心去掉培養液加凍存液（DMSO與血清1∶9的比例配置）凍存細胞。其中A549/DDP培養基含有2 μg/mL的順鉑以維持細胞的耐藥性。取對數生長期細胞為實驗對象。

1.3細胞總RNA的提取及完整性檢測

A549和A549/DDP細胞分別接種于培養瓶中，加入5 mL RPMI 1640完全培養基培養，待細胞生長達到85%左右融合生長時，采用Trizol試劑提取總RNA。

1.4實時熒光定量PCR（Real-time PCR，qRT-PCR）

對轉染處理前后A549和A549/DDP細胞mir-17，mir-92，let-7表達水平的驗證。

1.5轉染效率測試

Mir-17，mir-92，let-7模擬物，mir-17，mir-92，let-7抑制物和陰性對照NC（negative control）分別用lipofectamine RNAimax進行轉染。

1.6Cck8檢測A549、A549/ddp細胞株的ic50

按照細胞計數試劑盒（cck-8）操作說明進行，將細胞接種至96孔板內，密度約為2000～3000/孔，細胞貼壁24 h后每孔加入100 μL含ddp的完全培養基，A549細胞系DDP濃度梯度為0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0 μg/mL；A549/DDP的DDP濃度梯度為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、16 μg/mL。同時設置只加培養基的調零孔和只加單細胞懸液的對照孔，每組設置3個輔孔，培養48 h后將培養基換成含有10%cck-8的完全培養基繼續培養3～6 h，酶標儀檢測450 nm波長的吸光值，細胞活力%=（A加藥-A空白/A0加藥-A空白）*100%，使用SPSS軟件probit回歸模型計算出細胞的ic50。

1.7細胞克隆平臺實驗

取對數生長期的單層培養細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，加入含血清的1640培養基制備成單細胞懸液。將細胞懸液進行稀釋，以每孔1000個細胞接種在6孔板中，并輕輕轉動6孔板，使細胞分散均勻。置37℃5%CO2及飽和濕度的環境下，靜置培養1～2周。經常觀察，出現肉眼可見的克隆時，終止培養。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。6孔板中每孔加純甲醇1 mL，固定15 min。然后去固定液，每孔加適量Giemsa應用染色液1ml，靜置30 min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。將6孔板倒置并疊加一張帶網格的透明膠片，用肉眼直接計數克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）計數大于10個細胞的克隆數。

1.8細胞凋亡分析

樣本數據用流式分析軟件Flowjo7.6.1進行分析。凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。實驗均重復3次。

1.9統計學方法

采用SPSS 13.0以及GraphPad Prism 6 Demo軟件進行統計分析，實驗數據以均數±標準差表示，定量資料組間比較采用t檢驗分析，檢驗水準僅=0.05。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1實時熒光定量PCR檢測轉染前后細胞株mir-17，mir-92，let-7表達

2.1.1miRNA完整性檢測 Trizol試劑提取的A549細胞和A549/DDP細胞總RNA，并經紫外分光光度計檢測其純度和濃度，A260/A280的比值分別為1.99和1.98，A260/ A230的比值分別為1.57和1.54。說明總RNA純度較高，無蛋白及DNA的污染。瓊脂糖凝膠電泳試驗顯示（圖1），條帶清晰，28S/18S亮度比值均在2以上，說明提取細胞總RNA完整性好，無明顯降解。

2.1.2細胞株mir-17、mir-92、let-7轉染前后表達水平檢測 由圖2、圖3顯示，RT-PCR檢測轉染前后mir-17、mir-92以及let-7在NSCLC細胞株A549與A549/DDP中的表達水平，結果顯示，轉染前mir-17、mir-92在A549/DDP細胞中的表達水平顯著高于其在A549細胞中的表達水平，A549/DDP細胞mir-17的表達水平是A549細胞的（2.11±0.25）倍（P＜0.05）。A549/DDP細胞mir-92的表達水平是A549細胞的（7.40±1.05）倍（P＜0.05）。而let-7在A549/DDP細胞中的表達水平顯著低于其在A549細胞中的表達水平，A549/DDP細胞let-7的表達水平是A549細胞的（26.54±2.90）%（P＜0.05）。提示相比于a549細胞株，mi-17、mir-92在a549/ddp細胞株存在高表達現象，let-7在a549/ddp細胞株中存在低表達現象。因而我們選擇a549以及a549/ddp作為我們進一步研究的細胞株。在轉染48 h后，A549細胞mir-17 mimic組的mir-17表達水平是mir-NC細胞的10.64±1.17倍（P＜0.05）。A549細胞mir-92 mimic組的mir-92表達水平是mir-NC細胞的10.17±1.55倍（P＜0.05）。A549細胞let-7 inhibitor組的let-7表達水平是mir-NC細胞的（19.90±1.67）%（P＜0.05）。A549/DDP細胞mir-17 inhibitor組的mir-17表達水平是mir-NC細胞的（23.13±1.50）%（P＜0.05）。A549/DDP細胞mir-92 inhibitor組的mir-92表達水平是mir-NC細胞的（17.12± 2.26）%（P＜0.05）。A549/DDP細胞let-7 mimic組的let-7表達水平是mir-NC細胞的12.78±1.65倍（P＜0.05）。提示細胞轉染成功，細胞轉染效率高。

2.2Mir-17、mir-92、let-7對細胞順鉑藥物敏感性的影響

Cck-8試劑盒檢測顯示：a549轉染mir-17b mimic后，細胞IC50值為0.606 μg/mL，95%可信區間為0.403～0.784 μg/mL；轉染mir-92a mimic后，細胞IC50值為0.634 μg/mL，95%可信區間為0.424～0.817 μg/mL；轉染let-7 inhibitor后，細胞IC50值為0.607 μg/mL，95%可信區間為0.408～0.782 μg/mL。而對照組a549細胞IC50值為0.402 μg/mL，95%可信區間為0.358～0.444 μg/mL。a549分別轉染mir-17mimic、mir-92a mimic以及let-7inhibitor后細胞IC50值與對照組a549細胞IC50值相比明顯升高，提示a549細胞株對順鉑的敏感性下降（P＜ 0.05）；而a549/ddp轉染mir-17b inhibitor后，細胞IC50值為4.400 μg/mL，95%可信區間為3.990～4.793 μg/mL；a549/ddp轉染mir-92a inhibitor后，細胞IC50值為4.231 μg/mL，95%可信區間為3.824～4.621 μg/mL；a549/ddp轉染let-7 mimic后，細胞IC50值為4.430 μg/mL，95%可信區間為4.049～4.797 μg/mL。對照組a549/ddp細胞株IC50值為5.770，95%可信區間為5.392～6.136 μg/mL。a549/ddp細胞株分別轉染mir-17b inhibitor、mir-92a inhibitor以及let-7 mimic后，細胞IC50值與對照組a549/ ddp細胞IC50值相比明顯降低，提示a549/ddp細胞株對順鉑的敏感性增加（P＜0.05，圖4）。

2.3Mir-17、mir-92、let-7對細胞增殖的影響

細胞平板克隆實驗結果顯示：a549轉染mir-17b，92a mimic以及let-7 inhibitor后，細胞形成克隆集落數量數量多于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。提示a549細胞株細胞增殖性增強。而a549/ddp轉染mir-17b，92a inhibitor以及let-7 mimic后，細胞形成克隆集落數量數量少于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，圖5）。提示a549/ddp細胞株細胞增殖性減弱。

2.4Mir-17、mir-92、let-7對細胞凋亡的影響：

圖5～7顯示，a549轉染mir-17b，92a mimic以及let-7 inhibitor后，細胞凋亡率明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。提示順鉑導致的細胞凋亡受到一定的抑制。而a549/ddp轉染mir-17b，92a inhibitor以及let-7 mimic后，細胞凋亡率明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3　討論

晚期NSCLC患者標準一線化療方案為含鉑雙藥化療方案，但是其有效率僅僅約為30%，主要的原因為患者對化療藥物產生原發性或者繼發性耐藥。尤其是對鉑類藥物耐藥更為常見［12-14］。如何準確的識別患者對鉑類藥物治療的敏感性以及如何逆轉鉑類藥物的耐藥情況是未來急需要解決的問題。

腫瘤組織或者細胞內存在大量的miRNA表達異常，miRNA參與基因轉錄后的調節，因而能夠抑制目標基因的表達從而間接影響細胞信號通路內的各種分子，導致腫瘤細胞存活通路的異常和腫瘤細胞凋亡通路的異常［9，11，15］。

本課題中，我們通過前期課題基因芯片數據分析了A549和A549/DDP之間miRNA表達譜的變化，選出存在表達差異的其中3個miRNA（mir-17、mir-92a以及let-7b）。通過RT-PCR驗證，與A549相比，發現A549/ DDP存在mir-17和mir-92a高表達現象以及let-7b低表達現象。這結果跟國外部分研究基本一致，mir-17-92家族在多種惡性腫瘤中充當著原癌基因的作用，let-7b充當抑癌基因的作用［11］。進一步的細胞毒性實驗結果顯示，使A549內的mir-17高表達或者mir-92a高表達或者let-7b低表達會導致A549對順鉑的敏感性下降，細胞的IC50值升高，使A549對順鉑產生耐藥現象。而相反使A549/DDP內的mir-17低表達或者mir-92a低表達或者let-7b高表達會導致A549/DDP對順鉑的敏感性升高，細胞IC50值下降。細胞克隆平臺實驗表明了A549內的mir-17高表達或者mir-92a高表達或者let-7b低表達均會導致細胞增殖能力增強，細胞克隆數目增多。而相反A549/DDP的mir-17低表達或者mir-92a低表達或者let-7b高表達均會導致細胞增殖能力減弱，細胞克隆數目減少。順鉑主要的作用機制是與腫瘤細胞核內的DNA結合引起細胞內的DNA損傷，從而誘導細胞發生凋亡現象。本研究顯示，在A549/DDP中高表達的mir-17、mir-92a和低表達的let-7b可導致細胞增殖能力增強，抗凋亡能力增強。以上的實驗表明了mir-17、mir-92a可作為原癌基因，促進細胞增殖。let-7b作為抑癌基因，能夠抑制細胞增殖；細胞內mir-17、mir-92a以及let-7b表達水平的變化影響細胞增殖、細胞凋亡以及細胞對順鉑的敏感性；抗凋亡能力增強有可能直接減弱順鉑對腫瘤細胞的殺傷作用，而導致細胞對順鉑產生耐受作用。

通過以上研究，我們探索了NSCLC化療過程中出現耐藥的分子機制，這將為提高NSCLC的整體療效、建立合理的個體化治療方案提供新的理論基礎和技術途徑。

［1］Jemal A，Thun MJ，Ries LA，et al.Annual report to the nation on the status of cancer，1975-2005，featuring trends in lung cancer，tobacco use，and tobacco control［J］.J Natl Cancer Inst，2008，100（23）:1672-94.

［2］Parkin DM，Pisani P，Ferlay J.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，1999，49（1）:33-64，1.

［3］Xing L，Todd NW，Yu L，et al.Early detection of squamous cell lung cancer in sputum by a panel of microRNA markers［J］.Mod Pathol，2010，23（8）:1157-64.

［4］Xie Y，Todd NW，Liu Z，et al.Altered miRNA expression in sputum for diagnosis of non-small cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2010， 67（2）:170-6.

［5］Shen J，Todd NW，Zhang H，et al.Plasma microRNAs as potential biomarkers for non-small-cell lung cancer［J］.Laboratory Investigation，2011，91（4）:579-87.

［6］Yanaihara N，Caplen N，Bowman E，et al.Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis［J］. Cancer Cell，2006，9（3）:189-98.

［7］Patnaik SK，Kannisto E，Knudsen S，et al.Evaluation of MicroRNA expression profiles that May predict recurrence of localized stage I Non-Small cell lung cancer after surgical resection［J］.Cancer Res，2010，70（1）:36-45.

［8］Lebanony D，Benjamin H，Gilad S，et al.Diagnostic assay based on hsa-miR-205expression distinguishes squamous from nonsquamous non-small-cell lung carcinoma［J］.J Clin Oncol，2009，27（4）:2030-7.

［9］Zhao J，Fu WF，Liao HY，et al.The regulatory and predictive functions of miR-17 and miR-92 families on cisplatin resistance of non-small cell lung cancer［J］.BMC Cancer，2015，15（7）:731.

［10］Jiang ZY，Yin J，Fu WF，et al.miRNA 17 family regulates Cisplatin-Resistant and metastasis by targeting TGFbetaR2 in NSCLC［J］. PLoS One，2014，9（4）:e94639.

［11］Sarkar FH，Li Y，Wang Z，et al.Implication of microRNAs in drug resistance for designing novel cancer therapy［J］.Drug Resist Updat，2010，13（3）:57-66.

［12］Fennell DA，Summers Y，Cadranel J，et al.Cisplatin in the modern era:The backbone of first-line chemotherapy for non-small cell lung cancer［J］.Cancer Treat Rev，2016，44（5）:42-50.

［13］郗照勇，劉揚中.順鉑耐藥的分子機制［J］.中國科學:化學，2014（04）: 410-22.

［14］Dasari S，Tchounwou PB.Cisplatin in cancer therapy:Molecular mechanisms of action［J］.Eur J Pharmacol，2014，740（5）:364-78.

［15］Galasso M，Sana ME，Volinia S.Non-coding RNAs:a key to future personalized molecular therapy［J］.Genome Med，2010，42（2）:12.

The relationship between the expression level of mir-17-5p、mir-92a、let-7b and the cisplatin-resistant

SONG Xianlu1，LIAO Zhiwei1，YU Hongwei1，YANG Guangping2，YIN Jun2
1Department of Radiotherapy；2Lung Cancer Institute，Cancer Center of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510095，China

Objective To discuss miR-17，miR-92 and let-7 expression in non small cell lung cancer and cisplatin resistance and clinical application.To provide experimental data for prediction of lung cancer patients as a sign of cisplatin chemotherapy sensitivity.Method Non small cell lung cancer cell line A549 and its resistant strain A549/DDP were used as the cell research object.The expression level of miR-17，miR-92 and let-7 in the cell was detected by RT-PCR method.CCK8 was used to detect the survival of the transfected cells after Cisplatin maintenance culture compare to untransfected cells.After transfection，cell proliferation was detected by Cell plate cloning experiments and apoptosis rate was measured by Flow cytometry.Result（1）The expression level of miR-17 in A549/DDP cells was（2.11±0.25）times（P＜0.05）of A549 cells，and the expression level of miR-92 in A549/DDP cells was（7.40±1.05）times of A549 cells（P＜0.05）.However，the expression of let-7 in A549/DDP cells was（26.54±2.90）% （P＜0.05）of A549 cells；（2）A549 cells transfected with mir-17b，92a mimic and let-7 microRNA inhibitor，compared to control group，showed a lower sensitivity to cisplatin（P＜0.05）；while the sensitivity to cisplatin of A549/DDP cells transfected with mir-17b，92a inhibitor and let-7 miRNA increased（P＜0.05）；（3）A549 transfected with mir-17b，92a mimic and let-7 microRNA inhibitor，the cells formed colony number is greater than that of the control group，the difference is statistically significant（P＜0.05）；and A549/DDP transfectd with mir-17b，92a inhibitor and let-7 miRNA，the cells formed clones colony quantity less than that of the control group，the difference is statistically significant（P＜0.05）；（4）The apoptosis rate of A549 cells transfected with mir-17b，92a mimic and let-7 microRNA inhibitor，apoptosis rate was significantly lower than the control group，the difference has statistical significance（P＜0.05）；For A549/DDP cells transfected with mir-17b，92a inhibitor and let-7 miRNA，the apoptosis rate was significantly higher than that of the control group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion Mir-17，miR-92 expression level increased，let-7 expression level decreased，can promote the proliferation of lung cancer cells，inhibit apoptosis，as well as the decrease of lung cancer cell sensitivity to cisplatin.

lung cancer；miR-17；miR-92；let-7；cisplatin；sensitivity

2016-05-06

廣東省科技計劃項目（2016A020215175）；廣東省醫學科研基金（A2016555）

宋先璐，副主任醫師，E-mail:songxianlu@tom.com

殷俊，博士，助理研究員，E-mail:153144068@qq.com