5-FU致小鼠腸黏膜嚴重損傷時β-catenin的表達及其意義

羅育其，于海濤，區文弢，董 棟，吳承堂廣州市第一人民醫院南沙醫院普通外科，廣東 廣州 5457；南方醫科大學南方醫院普通外科，廣東 廣州 5055

基礎研究

5-FU致小鼠腸黏膜嚴重損傷時β-catenin的表達及其意義

羅育其1，于海濤1，區文弢1，董 棟1，吳承堂2
1廣州市第一人民醫院南沙醫院普通外科，廣東 廣州 511457；2南方醫科大學南方醫院普通外科，廣東 廣州 510515

目的 探討與腸上皮干細胞增殖關系密切β-catenin蛋白在5-FU致小鼠腸黏膜嚴重損傷時的表達及其意義。方法 取成年C57/BL小鼠70只，采用隨機數字法將小鼠隨機分為對照組（30只）和實驗組（40只）。實驗組予腹腔注射大劑量5-FU［150 mg/（kg·d）×5 d］，分別于注射后1、3、5 d每天剖殺10只小鼠，取所有小鼠中段小腸組織固定，進行常規病理組織學檢查及免疫化檢查腸黏膜中β-catenin蛋白表達情況；對照組腹腔注射等體積的生理鹽水，連續注射5 d，處理方法和檢測指標與實驗組相同。結果 大劑量5-FU作用后，小鼠腸組織受到嚴重損傷，黏膜炎癥、水腫，腸絨毛脫落及腸隱窩消失，隨著時間推移，腸黏膜有少量修復；與對照組比較，實驗組腸組織β-catenin蛋白表達水平顯著增加，隨著時間推移，β-catenin蛋白表達陽性的細胞比例逐漸下降。結論 腸黏膜受到損傷后，β-catenin表達增加，促進腸上皮干細胞增殖，完成對腸黏膜的損傷修復。

β-catenin；5-FU；腸上皮干細胞；腸黏膜

腸黏膜由吸收細胞、杯狀細胞、番氏細胞及內分泌等細胞組成，發揮著營養吸收、腸屏障及免疫等功能作用。腸黏膜細胞更新速度迅速，每3～4 d即可完成細胞的更新，位于腸隱窩底部的腸上皮干細胞是腸黏膜不斷更新的原動力，腸黏膜的各種功能細胞都是由腸上皮干細胞分裂、分化而來［1］。5-FU是一種細胞周期依賴化療藥物，主要作用于分裂期細胞。腸黏膜細胞作為快速更新細胞，處于分裂期細胞比例較大，亦為5-FU作用的靶細胞。前期實驗已證實，腸上皮干細胞作為相對靜止期細胞，5-FU對其損傷作用不明顯，因此亦是腸黏膜損傷修復的原動力［2］。β-catenin是Wnt通路的核心蛋白，在調節細胞分裂、分化過程中起著重要作用［3］。因此，本研究將制備大劑量5-FU對腸黏膜嚴重損傷模型，探討此時β-catenin的表達變化及其意義。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組

成年C57/BL小鼠70只，購于南方醫科大學實驗動物中心，雌雄不拘，體質量24±3 g，采用隨機數字法將小鼠隨機分為實驗組（40只）和對照組（30只），實驗組予腹腔注射大劑量5-FU［150 mg/（kg.d）］，連續注射5 d，對照組予腹腔注射等體積的生理鹽水。兩組小鼠均在注射結束后第1、3、5天處死取材，每天處死10只。剩余10只小鼠為備用，補充實驗過程中的死亡小鼠，最終使各個時間點剖殺的小鼠數量均為10只。

1.2取材及標本處里

對照組小鼠于第5天注射結束后剖殺，取出中段小腸組織，長約2 cm，清洗腸腔后4%多聚甲醛固定；實驗組在上述時間點剖殺處死小鼠，同樣取出中段小腸組織，長約2 cm，清洗腸腔后4%多聚甲醛固定。所有標本固定后將用于常規HE染色和免疫組化檢測。

1.3免疫組化檢測腸黏膜β-catenin蛋白表達情況

切片常規脫蠟入水后，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5 min。每張切片加50：l過氧化物阻斷溶液，竄溫孵育10 min，PBS沖洗3次，微波抗原修復30 min，加BSA封閉液，室溫孵育l0 min；加入一抗兔抗大鼠β-catenin抗體，4℃過夜，PBS洗滌3次后，加入而二抗生物素標記山羊抗兔IgG抗體，4℃過夜，PBS洗滌3次后，ABC法染色。結果判定，細胞漿著色判定為β-catenin陽性細胞，在400倍視野下，每張切片隨機挑選5個視野，計數陽性細胞數，β-catenin陽性細胞比例=β-catenin陽性細胞/鏡下細胞總數。

1.4統計方法

實驗數據均數±標準差表示，采用SPSS20.0統計分析軟件進行統計分析，組間比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2　結果

2.1小鼠一般狀況

對照組小鼠狀態良好，實驗過程中無死亡。實驗組小鼠一般狀況較差，表現為進食量及活動量減少、出現嚴重腹瀉及體質量下降；實驗過程中，注射結束后第1天有1只小鼠死亡，第3天有3只小鼠死亡，第5天有3只死亡，所有死亡的小鼠由后備小鼠補充，使各時間點剖殺小鼠數量均為10只。

2.2病理組織改變

對照組小鼠腸組織結構正常，腸黏膜絨毛排列整齊、規律，腸隱窩深淺均勻。而實驗組腸組織受到嚴重損傷，肉眼可見腸壁變薄，腸腔積液；鏡下觀察可見注射大劑量5-FU后小鼠腸組織肌層萎縮，腸絨毛、隱窩結構消失，腸腔覆蓋一層單層上皮細胞。處理后第3天小鼠腸上皮開始修復，隱窩結構開始形成，絨毛結構仍未形成。處理后第5天小鼠腸黏膜進一步修復，可見短而粗的腸絨毛形成（圖1）。

2.3β-catenin蛋白表達情況

對照組β-catenin蛋白主要表達于腸隱窩中上2/3位置，腸絨毛部分幾乎不表達β-catenin蛋白；受到大劑量5-FU作用后，B組小鼠腸腔中的單層上皮細胞幾乎都表達β-catenin蛋白，隨著損傷修復的進行，β-catenin蛋白逐漸往隱窩方向集中（圖2）。與對照組比較，各組小鼠腸黏膜細胞β-catenin蛋白表達陽性率均有統計學差異（P＜0.01，表1）。

3　討論

腸黏膜保持旺盛的自我更新能力，有研究表明，每3～4 d全部腸黏膜功能細胞完成一次更新，位于腸隱窩底部的腸上皮干細胞是腸黏膜自我更新的原動力，腸上皮干細胞通過不對稱分裂產生一個腸上皮干細胞及過度細胞（TA），TA不斷分裂、分化，最終產生各種功能細胞，位于腸絨毛的各種功能細胞不斷凋亡、脫離，新生細胞不斷從腸隱窩往腸絨毛方向將脫離細胞替代［4］。5-FU即氟尿嘧啶，是一種細胞周期依賴化療藥物，主要作用于快速分裂期細胞，為結腸癌化療首選藥物之一，而化療過程中，患者常出現腹瀉，嚴重者可發生偽膜性腸炎，表明5-FU對腸黏膜損傷作用明顯。前期實驗表明，腸隱窩中上2/3位置細胞表達豐富的PCNA，而“干細胞區”的PCNA表達較弱，表明腸黏膜中TA保持旺盛的分裂能力，是5-FU殺傷的主要對象，TA受損后，導致腸絨毛各種功能細胞無法補充，最終導致腸絨毛脫落［5-6］。本研究常規病理證實改變進一步證實了上述觀點，大劑量5-FU作用后，腸絨毛脫落，腸腔只剩下一單層上皮細胞覆蓋，前期實驗亦證實，這些單層上皮細胞幾乎都表達腸上皮干細胞標志物—musashi-1（msi-1），表明這些單層上皮細胞含有豐富的腸上皮干細胞，發揮著腸黏膜損傷修復作用［6］。隨著修復的進行，腸隱窩逐漸形成，腸上皮干細胞逐漸往腸隱窩聚集，并逐漸分裂、分化出各種功能細胞，逐漸形成粗短的腸絨毛。

表1　各個時間點實驗組與對照組腸年黏膜細胞β-catenin蛋白表達陽性率（n=10）

腸上皮干細胞的分裂、分化受到一系列復雜的細胞信號通路調節。β-catenin是一種胞內糖蛋白，為Wnt/ β-catenin信號通路核心蛋白，越來越多證據表明，該通路在維持干細胞穩定及自我更新方面起著重要作用［7］。經典Wnt/β-catenin信號通路Wnt受體主要為Frizzled或低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6（LRP5/6）。Wnt與細胞受結合后，使LRP5/6磷酸化，磷酸化的LRP5/6與Axin結合，后者可使β-catenin從結合體變成游離體，游離的β-catenin進入細胞核，結合TCF轉錄因子，最終使Wnt的目標基因得到表達。即細胞核內，形成β-catenin/ Tcf4復合體，直接上調c-Myc基因的表達，使細胞進入分裂周期［8-9］。本實驗亦證實，在正常對照組腸黏膜中，β-catenin主要表達于腸隱窩中上2/3位置，即TA的位置，表明這部分細胞處于旺盛的分裂期。腸黏膜受到損傷后，腸上皮干細胞啟動Wnt/β-catenin信號通路，對損傷進行修復。從本實驗可以發現，當腸黏膜受到大劑量5-FU作用后，注射5-FU完成后第1天剖殺的小鼠小腸腸腔中的單層上皮細胞幾乎都表達β-catenin蛋白，前期實驗證實這部分細胞亦表達msi-1，表明腸上皮干細胞啟動細胞分裂周期，以修復損傷的腸黏膜，隨著修復的進行，β-catenin蛋白的表達主要位于新生腸隱窩中，且比例逐漸降低，表明終末功能細胞不斷生成，干細胞比例亦隨之降低，最終完成對腸黏膜的重塑。

本實驗證實了在腸黏膜受到大劑量5-FU損傷后，β-catenin蛋白在腸黏膜中表達顯著升高，表明其在腸黏膜損傷修復過程中的重要作用，但其調控腸上皮干細胞分裂、分化的機制仍有待進一步研究。

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［3］Zani A，Cananzi M，Fascetti-Leon F，et al.Amniotic fluid stem cells improve survival and enhance repair of damaged intestine in necrotising enterocolitis via a COX-2 dependent mechanism［J］. Gut，2014，63（2）:300-9.

［4］羅育其，吳承堂，聞英，等.大劑量5-FU致腸黏膜嚴重損傷時腸上皮msi-1的表達及其意義［J］.中華普通外科雜志，2007，22（12）:939-42.

［5］Ogaki S，Shiraki N，Kume K，et al.Wnt and notch signals guide embryonic stem cell differentiation into the intestinal lineages［J］. Stem Cells，2013，31（6）:1086-96.

［6］羅育其，吳承堂，聞英，等.大劑量5-FU致腸黏膜嚴重損傷時PCNA的表達［J］.南方醫科大學學報，2007，27（12）:1860-2.

［7］Krausova M，Korinek V.Wnt signaling in adult intestinal stem cells and cancer［J］.Cell Signal，2014，26（3）:570-9.

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Expression of β-catenin in mouse intestinal mucosa siverely dameged by 5-FU

LUO Yuqi1，YU Haitao1，OU Wentao1，DONG Dong1，WU Chengtang2
1Department of General Surgery，Nansha Hospital，Guangzhou First People's Hospital，Guangzhou 510180，China；2Department of General Surgery，Nanfang Hospital，Southern Medical Univercity，Guangzhou 510515，China

Objective To discusse the expression of β-catenin proten and its significance in mouse intestinal mucosa，and β-catenin was colse related to the proliferation of intestinal stem cells.Methods A total of 70 C57/BL mice were divided two goups randomly，30 of them were in control group（group A），and other 40 mice were in experimental group.The mice in experimental group were treated with introperitoneal injection of large dose of 5-FU（150 mg/kg body weight for 5 consecutive days），the 30 mice were divied 3 groups，10 of them were kill at the 1st the 3rd day and the 5th day after the injection was finished.The middle of intestine from these mice was fixed for HE straining and immunohistochemical techniques.The experession of β-catenin in the intestinal sample was detected by immunohistochemical techniques.The mice in control group were introperitoneal injected saline for five days as control，and them were treated as the mice in experimental group.Results After injectin hight dose of 5-FU，the intestine of the mice suffered severe damage:the mucosa was shown as inflammatory oedema，the villi and cryptes disappared，and the mucosa repaired minimally with time.The expression of β-catenin proten in intestianl mucosa of the mice after injecting hight dose of 5-FU increased significantly comparied with control the mice in control group，and percentage of β-catenin proten positive cells in intestinal mucosa gradually decreased with time in mice of experimental group.Conclusion The expression of β-catenin in intestinal mucosa increased when the mice were injected hight dose of 5-FU，meaning the proten could promote the proliferation of intestinal stem cells and finish the regeneration of intestinal mucosa.

β-catenin；5-FU；intestinal stem cells；intestinal mucosa

2016-05-17

廣州市醫藥衛生科技項目（2014A010009）；廣東省中醫強省科研項目（20152040）

羅育其，博士，副主任醫師，E-mail:henry216@fimmu.com