PRDM1基因對非霍奇金淋巴瘤細胞增殖能力的影響

徐理華，李 璽，譚 獲廣州醫科大學附屬第一醫院血液科，廣東 廣州 5030；中山大學附屬第三醫院甲乳外科，廣東 廣州 50630

基礎研究

PRDM1基因對非霍奇金淋巴瘤細胞增殖能力的影響

徐理華1，李 璽2，譚 獲1
1廣州醫科大學附屬第一醫院血液科，廣東 廣州 510230；2中山大學附屬第三醫院甲乳外科，廣東 廣州 510630

目的 觀察PRDM1對非霍奇金淋巴瘤細胞SUDHL-4增殖能力的影響。方法 通過質粒轉染的方法在低表達PRDM1的SUDHL-4細胞中過表達PRDM1基因，通過MTT實驗、細胞周期分析檢測SUDHL-4生物學行為的變化。結果過表達PRDM1的SUDHL-4細胞的生長速度明顯下降，細胞G0/G1比例、S期比例下降；G2/M期比例升高，細胞阻滯于G2/M期，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論 PRDM1基因表達缺失可能在非霍奇金淋巴瘤的發生發展中起重要作用，可能成為判斷非霍奇金淋巴瘤預后的分子標志物及臨床治療的靶點。

非霍奇金淋巴瘤；PRDM1；SUDHL-4細胞

淋巴瘤是最常見的淋巴造血系統惡性腫瘤，起源于淋巴網狀系統，多發生于淋巴結和（或）結外淋巴組織，近年來發病率呈上升趨勢［1］。世界衛生組織將淋巴瘤分為兩類，霍奇金淋巴瘤（HL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL），其中HL僅占10.9%，NHL占89.1%。

NHL起源于B細胞和T細胞/NK（自然殺傷）細胞，是一組異質性極高的疾病，在病理、病程、治療反應等方面均存在極大差異。根據不同的細胞形態、免疫標記、遺傳學指標等可進一步分為70多種不同的亞型。近年來，隨著分子生物學的迅速發展，人們逐漸認識到惡性淋巴瘤是一個涉及多重基因事件的復雜過程。研究人員致力于探尋非霍奇金淋巴瘤發生的分子機制，進而為早期診斷及制定特定的靶向治療方案提供理論依據。

1991年，Keller等［2］發現一種β干擾素分泌抑制因子，將其命名為PRDM1。PRDM1是一種轉錄抑制子，對哺乳動物的組織發育和分化起著關鍵的作用。其在成熟B細胞的終末分化中的作用已得到廣泛共識。目前有關microRNA對PRDM1的調控的研究已漸漸成為人們關注的熱點。PRDM1在彌漫大B細胞淋巴瘤中的腫瘤抑制作用已有很多報道。Mandelbaum等［3］在約53%的DLBCL中發現了組成型活化BCL-6所介導的轉錄抑制，從而證實了PRDM1的抑癌作用。PRDM1的失活阻斷了細胞的終末分化，而促使DLBCL的發生。

PRDM1基因突變及其表達對于各種類型淋巴瘤的發生和預后都有著重要意義。但關于PRDM1對非霍奇金淋巴瘤細胞行為的影響，國內外均未見報道。本研究通過在非霍奇金淋巴瘤細胞SUDHL-4中過表達PRDM1基因的方法來觀察該基因對其增殖能力的影響，現報道如下。

1　材料與方法

1.1材料

彌漫大B細胞淋巴瘤細胞株SUDHL-4細胞株購買于ATCC（美國模式培養物研究所）；DMEM細胞培養基和胎牛血清購于美國Gibco；pcDNA3.1（+）-PRDM1表達載體由上海吉凱基因科技公司構建；鼠抗人PRDM1單克隆抗體購自美國Santa Cruz。兔抗人多克隆抗β-肌動蛋白 抗體用作內參，購自美國Cell Signaling Technolog，羊抗兔和兔抗鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 非霍奇金淋巴瘤細胞SUDHL-4細胞接種在含有10%胎牛血清、100 U/mL慶大霉素的DMEM培養基中，置于37℃、5%二氧化碳孵箱中培養，0.25%胰酶常規消化和傳代，取對數生長期且細胞活力良好的細胞用于實驗。實驗細胞分為3組，加入pcDNA3.1（+）-PRDM1載體的為SUDHL-4-PRDM1組，加入空白質粒的為SUDHL-4-vector組，不做處理的為空白對照組。

1.2.2電穿孔法轉染轉染當天配制電穿孔緩沖液［3］，置于冰箱預冷。每個樣本取2×107細胞，加40 μg載體。電穿孔條件：電壓160 mV，電阻∞；電容：950 uF，電擊1次。電穿孔后，加DMEM培養基置于37℃、5%二氧化碳孵箱中培養，24～48 h后加入puromycin 2 μg/mL進行篩選；每周換液3次，培養4周。將篩選出的細胞克隆繼續培養在含1.0 μg/mL puromycin、30%胎牛血清的DMEM培養基中。用于蛋白質提取、檢測細胞活性和細胞周期等。

1.2.3Western-blotting法檢測PRDM1在轉染細胞中的表達 取對數生長期的SUDHL-4-PRDM1、SUDHL-4-vector，及空白對照組SUDHL-4細胞，加入細胞裂解液后，4℃下靜置1 h低溫高速離心（4℃，12 000 r/min，30 min），提取上清即為總蛋白。經12%的SDS-PAGE電泳、轉印，脫脂奶粉封閉，抗β-actin（1∶500）和抗PRDM1（1∶50）4℃下孵育過夜；二抗室溫下孵育2 h，ECL顯色，經自動電泳凝膠成像分析儀采集圖像。實驗重復3次。

1.2.4四甲基偶氮唑藍比色法（MTT法）檢測細胞活性分別將5×103個/孔SUDHL-4-PRDM1、SUDHL-4-vector，及空白對照組SUDHL-4細胞接種于96孔細胞培養板中。37℃、5%CO2環境培養，分別于第1～7天加入5 mg/mL的甲基噻唑基四唑（MTT法）工作液20 μL，繼續培養4 h，棄上清液，每孔加入100 μL二甲基亞砜（DMSO）溶液，于微量震蕩器震蕩15 min后用酶標儀測定波長490 nm的吸光度值，試驗重復3次，每個觀察點設5個復孔，取均值進行計算。以時間為橫坐標，A490值為縱坐標作圖，觀察細胞的增殖情況。

1.2.5細胞周期測定取對數生長期SUDHL-4-PRDM1、SUDHL-4-vector，及空白對照組SUDHL-4細胞，離心去上清，用冷PBS（4℃）洗滌細胞后，800 r/min離心5 min，共洗滌2次。用含有10%胎牛血清的PBS溶液300 μL重懸3組細胞，加入700 μL無水乙醇固定30 min。冷PBS（4℃）洗滌后，300 r/min離心5 min后，加入5 μg/L碘化丙啶染色20～30 min。室溫下避光放置15 min待測。記錄細胞周期的分布并計算細胞凋亡比率。全部數據經FACSCalibur流式細胞儀和CELLQuest軟件獲取。

1.3統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析處理，計量資料用均數±標準差表示，組建比較采用t檢驗，計數資料采用卡方檢驗，所有實驗重復3次，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1非霍奇金淋巴瘤細胞SUDHL-4中PRDM1蛋白表達情況

以β-actin為對照，非霍奇金淋巴瘤細胞SUDHL-4中轉染pcDNA3.1（+）-PRDM1、pcDNA3.1（+）及不做處理后PRDM1蛋白相對表達量分別為0.76±0.04，0.46± 0.01，0.38±0.02。與空白對照組及空質粒組相比，轉染pcDNA3.1（+）-PRDM1后非霍奇金淋巴瘤細胞SUDHL-4中PRDM1蛋白相對表達量明顯上升（t= 4.365，P＜0.05；t=4.319，P＜0.05，圖1）。

2.2MTT檢測結果

通過MTT法繪制SUDHL-4-PRDM1、SUDHL-4-vector，及空白對照組SUDHL-4細胞的生長曲線以研究PRDM1的表達對細胞增殖的影響。與空質粒組及空白對照組細胞相比，轉染PRDM1的SUDHL-4細胞其生長速度明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05，圖2）。

2.3細胞周期檢測結果

SUDHL-4-PRDM1、SUDHL-4-vector，及空白對照組SUDHL-4細胞的G0/G1比例、S期比例，G2/M期比例見表1，SUDHL-4-PRDM1組的G0/G1比例、S期比例，低于空質粒組及空白對照組；G2/M期比例高于空質粒組及空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，表1）。

3　討論

1991年，Keller等［2］發現一種β干擾素分泌抑制因子，該蛋白可特異性結合β干擾素基因的啟動子陽性調控區I，遂將其命名為PRDM1。Turner等［5］發現IL-2和IL-5可以誘導小鼠淋巴瘤細胞株BCL-1中Blimp1表達，而過表達Blimp1可促使B細胞向漿細胞分化。后續的研究顯示，小鼠的Blimp1蛋白與人類的PRDM1蛋白具有高度同源性［4］。

人PRDM1基因定位于染色體6q21-22.1，而該區域在多種惡性腫瘤中均存在缺失突變，故此推測PRDM1基因是抑癌基因［6］。PRDM1基因有2種轉錄本：PRDM1α和PRDM1β。PRDM1α由PRDM1基因的正常啟動子啟動編碼，含789個氨基酸，由5個結構域組成，即氨基端酸性區、PR結構域、脯氨酸富集區、5個鋅指結構和羧基端酸性區［7］。PRDM1β缺失了1～3號外顯子，由4號外顯子上游的新啟動子啟動編碼，含687個氨基酸。由于PRDM1β的功能缺陷，喪失了對多個靶基因的調控作用［8］，因此可能具有與PRDM1α相反的功能。而傳統意義上PRDM1蛋白指的是PRDM1α。

表1　細胞周期分析結果（%）

PRDM1對哺乳動物的組織發育和分化起著關鍵的作用。在小鼠的胚胎發育過程中，多種組織中都可以檢測到Blimp1蛋白表達，如胎盤、心臟、前肢和感覺器官和等。但在Blimp1基因敲除小鼠的胚胎中，妊娠10.5 d后胚胎即死亡，且胎盤、支氣管不能正常發育，血管結構也不完整［9］。PRDM1在B細胞終末分化中所發揮的重要作用已經被多個研究證實。已知有4種轉錄因子及其靶基因與B細胞分化密切相關，分別是PRDM1、BCL-6、PAX5和XBP-1。在成熟B細胞階段，PRDM1表達被BCL-6抑制；到生發中心后期，BCL-6的表達下調，而PRDM1表達增強，并可通過抑制PAX5，誘導XBP-1表達，以促進B細胞向漿細胞分化［10-11］。目前關于microRNA對PRDM1的調控的研究已漸漸成為人們關注的熱點。

PRDM1在彌漫大B細胞淋巴瘤中的腫瘤抑制作用已有很多報道，近年來的多個實驗結果為該理論提供了新的依據。Tam等［12］對DLBCL細胞系進行了PRDM1基因的分析，發現了一些集中于第2外顯子/第2內含子處剪接供體位點的點突變，從而導致剪接錯誤，致使野生型PRDM1α和PRDM1β均表達缺失。Mandelbaum等［3］發現導致PRDM1基因失活的機制包括了純合子缺失、截短或錯義突變，并且在約53%的DLBCL中發現了組成型活化BCL-6所介導的轉錄抑制，從而證實了PRDM1的抑癌作用。PRDM1的失活阻斷了細胞的終末分化，而促使DLBCL的發生。但關于PRDM1對非霍奇金淋巴瘤細胞行為的影響，國內外均未見報道。

為了研究PRDM1基因在非霍奇金淋巴瘤中的作用，我們采用在非霍奇金淋巴瘤細胞SUDHL-4中過表達PRDM1基因的方法來觀察該基因對其增殖能力及細胞周期的影響，研究結果顯示，SUDHL-4細胞轉染PRDM1后，細胞生長速度較空載體組及空白對照組明顯下降，細胞周期分析發現，轉染PRDM1的SUDHL-4細胞G0/G1比例、S期比例，低于空載體組；G2/M期比例高于空載體組，細胞阻滯于G2/M期，由此推測PRDM1基因過表達引起SUDHL-4細胞細胞周期分布改變可能是影響細胞增殖及凋亡的重要原因之一，與Tam及Mandelbaum報道的PRDM1在DLBCL中表達缺失及PRDM1可發揮抑癌作用相一致，并進一步闡明了其發揮抑癌作用的可能機制，對明確非霍奇金淋巴瘤的生物學行為具有重要意義，有助于了解非霍奇金淋巴瘤的生物學特性，預測腫瘤的復發、轉移，為針對PRDM1的靶向治療提供理論依據。

針對PRDM1表達缺失引起的非霍奇金淋巴瘤發生發展而設計的特異靶向藥物具有重要的治療價值，不僅有助于非霍奇金淋巴瘤發生發展機制的研究，且也為腫瘤的治療提供了有希望的靶點。但其調控細胞增殖能力的確切機制和路徑仍有待于進一步研究。

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［4］Grund EM，Muise-Helmericks RC.Cost efficient and effective gene transfer into the human natural killer cell line，NK92［J］.J Immunol Methods，2005，296（1/2）:31-6.

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Effects of PRDM1gene expression on the reproductive ability of non-Hodgkin lymphoma cells

XU Lihua1，LI Xi2，TAN Huo1
1Department of Hematology，the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510230，China；2Department of thyroid surgery，the Third Affiliated Hospital of Zhongshan University，Guangzhou 510630，China

Objective To explore the effects of PRDM1gene expression on the reproductive ability of Non-Hodgkin Lymphoma cells SUDHL-4.Methods Non-Hodgkin Lymphoma cells SUDHL-4 was chosed to show the biology behavior changes after overexpressing PRDM1 gene，through the MTT test，and cell cycle analysis.Results After overexpressing PRDM1 gene，the proliferation of SUDHL-4 cell were significantly decreased，and cell cycle arrested at G2/M（P＜0.05）.Conclusion The loss of PRDM1 gene may be related to the occurrence and development of lymphoma，and it may become the molecular diagnostics and new therapy target of lymphoma.

non-Hodgkin lymphoma；PRDM1；SUDHL-4 cell

2016-04-15

徐理華，博士，E-mail:xlhua325@126.com

譚 獲，E-mail:xlhua325@126.com