石榴花中黃酮類成分的提取與含量測(cè)定

楚紅英，羅　曉，李　瑜（.黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院 環(huán)境與化學(xué)工程系，河南 開封 475004；.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 45000；.鄭州頤和醫(yī)院 泌尿外科，河南 鄭州 450047）

石榴花中黃酮類成分的提取與含量測(cè)定

楚紅英1，羅曉2，李瑜3
（1.黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院 環(huán)境與化學(xué)工程系，河南 開封 475004；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450003；3.鄭州頤和醫(yī)院 泌尿外科，河南 鄭州 450047）

該文對(duì)石榴花中黃酮類成分進(jìn)行提取，并對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化石榴花中黃酮提取條件，并用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)504 nm處測(cè)定其吸光度值并計(jì)算其含量。用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，液料比20∶1（mL∶g），在80℃條件下，黃酮類成分提取效果較好，此時(shí)石榴花瓣及花粉中黃酮類成分的含量分別為32.7 mg/g和51.6 mg/g。

石榴花；正交試驗(yàn)；黃酮；含量測(cè)定

石榴（Punica granatumL.）是石榴科（Punicaceae）石榴屬（Punica）植物，別名安石榴、若榴、丹若、金罌［1］。石榴除食用外，其果皮、根皮、果實(shí)、花、葉均可入藥，對(duì)多種疾病都有預(yù)防和治療作用。石榴花能止鼻衄，治心熱吐血、創(chuàng)傷出血，尤其具有治療糖尿病的作用，石榴花對(duì)循環(huán)系統(tǒng)的作用還表現(xiàn)為能夠降低血壓和血脂［1-2］。石榴花中含有葡萄糖、果酸、鞣酸、多酚、黃酮類、三萜類等化合物［3］。目前提取黃酮的工藝方法有很多，包括溶劑提取法、超臨界流體萃取法、高速逆流色譜技術(shù)提取法、微波提取法、超聲提取法、酶提取法、分子烙印技術(shù)等［4-9］。超聲技術(shù)應(yīng)用于天然活性產(chǎn)物的提取，具有速度快、提取率高、節(jié)省溶劑、節(jié)約能耗、不破壞有效成分的特點(diǎn)。植物中總黃酮含量的測(cè)定方法主要有NaNO2-Al（NO3）3-NaOH體系分光光度法，高效液相色譜法，反向色譜法和三氯化鋁比色法［9-15］等幾種方法。本次試驗(yàn)采用超聲提取法，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH體系分光光度法進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)石榴花總黃酮的提取與測(cè)定進(jìn)行了探討，為石榴花的食用和藥用提供一定的理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

石榴花：采自黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院院內(nèi)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：中國(guó)藥品生物制品檢定所；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

DZKW-4電子恒溫水浴鍋：河南智誠(chéng)科技有限公司；KQ-100E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；8HZ-D（III）型循環(huán)水真空泵：河南智誠(chéng)科技有限公司；PB1502-L電子天平：瑞士梅特勒公司；TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；ZRD-8210電熱風(fēng)干燥箱：上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司。

1.3方法

1.3.1樣品處理方法

樣品：將采回的石榴花洗凈、瀝干，自然風(fēng)干，將花瓣與花粉分開，粉碎，過(guò)200目篩，最后裝于棕色瓶?jī)?nèi)儲(chǔ)藏備用。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：準(zhǔn)確稱取于105℃干燥至恒質(zhì)量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶解并定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL于10 mL的比色管中，加入0.4 mL 5%NaNO2溶液，0.4 mL 10%Al（NO3）3溶液，搖勻放置5 min后加入2 mL 4%NaOH溶液，再用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇定容，并以體積分?jǐn)?shù)30%乙醇作空白，在波長(zhǎng)為504 nm條件下［4-7］，測(cè)定每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣的吸光度值，再以吸光度值為縱坐標(biāo)（A），以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（C）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求得線性回歸方程為：A= 1.0474C+0.0014，相關(guān)系數(shù)R=0.9994（n=6），在0～20mg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

1.3.3黃酮類成分的提取

樣品每次精確稱取1.000 0 g，加入一定提取液、一定的液料比，在一定的溫度條件下進(jìn)行超聲輔助提取，超聲時(shí)間為每15min一次，過(guò)濾定容至50 mL，可得黃酮提取液，低溫保存?zhèn)浞治鲇谩?/p>

1.3.4黃酮類成分含量以及提取率的測(cè)定

準(zhǔn)確移取黃酮提取液0.20 mL于10 mL比色管中，按照測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值的方法測(cè)定樣品的吸光度值。將吸光度值代入線性回歸方程求得黃酮類成分含量。黃酮提取率的計(jì)算公式如下：

式中：ρ為黃酮類物質(zhì)提取率，mg/g；C為從線性回歸方程中計(jì)算出的黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V為總黃酮提取液體積，mL；m為樣品總質(zhì)量，g。

1.3.5黃酮提取條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

為考察各單因素對(duì)石榴花瓣中黃酮提取率的影響，分別考察不同液料比（5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1）（mL∶g）、提取溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（0、10%、30%、50%、70%、90%）對(duì)黃酮提取率的影響。

1.3.6黃酮提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步考察各因素對(duì)黃酮提取率的影響，以提取液料比、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)為評(píng)價(jià)因素，黃酮類物質(zhì)提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，以尋求石榴花中提取黃酮的最佳工藝參數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1石榴花中黃酮類成分提取及含量測(cè)定的分析

2.1.1液料比對(duì)石榴花黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g石榴花瓣，在液料比為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1（mL∶g），乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，超聲提取時(shí)間為15 min，提取溫度為70℃的條件下進(jìn)行提取，提取次數(shù)為3次，下同。測(cè)定并計(jì)算黃酮提取率，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，提取率隨液料比的增大逐漸提高，在液料比為20∶1（mL∶g）時(shí)提取率達(dá)到最高，再增高液料比提取率趨于穩(wěn)定。溶劑太少，不能保證溶劑與樣品充分接觸，所以提取率較低。故選擇液料比為20∶1（mL∶g）。

圖1　液料比對(duì)提取率的影響Fig.1 Effect of liquid-material ratio on flavonoids extraction rate

2.1.2提取溫度對(duì)石榴花黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g石榴花瓣，在液料比為20∶1（mL∶g），乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，超聲提取時(shí)間為15 min，提取溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃的條件下進(jìn)行提取，測(cè)定并計(jì)算黃酮提取率，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　提取溫度對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on flavonoids extraction rate

由圖2可以看出，起初提取率隨溫度的升高逐漸增大，在提取溫度為70℃時(shí)提取率達(dá)到最高，再提高溫度、提取率反而有所下降。溫度超過(guò)70℃提取率下降的原因可能是，乙醇揮發(fā)較快，石榴花中黃酮類物質(zhì)不能被充分溶解，提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。故選擇提取溫度為70℃。

2.1.3乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)石榴花黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g石榴花瓣，在液料比為20∶1（mL∶g），乙醇體積分?jǐn)?shù)為0、10%、30%、50%、70%、90%，超聲提取時(shí)間為15 min，提取溫度為70℃的條件下進(jìn)行提取，測(cè)定并計(jì)算黃酮提取率，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可以看出，提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加逐漸增大，在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%時(shí)提取率達(dá)到最高，再提高乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取率反而下降。這可能是因?yàn)樵谝掖俭w積分?jǐn)?shù)較高時(shí)，原料中的一些其他物質(zhì)也被乙醇所溶解，干擾了黃酮的提取效果。

圖3　乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on flavonoids extraction rate

2.1.4穩(wěn)定性試驗(yàn)

任意取一黃酮提取液，按標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定方法，每20 min測(cè)一次吸光度值，共測(cè)定6次，分析其穩(wěn)定性。結(jié)果表明，提取液在2 h內(nèi)吸光度值無(wú)明顯變化，測(cè)定結(jié)果比較穩(wěn)定，表明該方法穩(wěn)定性好。

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果分析

為準(zhǔn)確而快速提取石榴花中黃酮類成分并測(cè)定其含量，采用正交試驗(yàn)方法進(jìn)行提取，確定提取最佳條件。準(zhǔn)確稱取干石榴花瓣1.000 0 g共9份，按照表1正交試驗(yàn)安排，在相應(yīng)的條件下加入溶劑，進(jìn)行超聲提取，得黃酮提取液，測(cè)定其吸光度值并計(jì)算黃酮提取率。其正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)方差分析見(jiàn)表2。

表1　黃酮提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for flavonoids extraction conditions optimization

極差分析結(jié)果表明，各因素對(duì)黃酮類成分提取率的影響次序是A＞C＞B，即液料比＞提取溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。最佳方案為A2B2C3，即液料比為20∶1（mL∶g），乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度80℃。此方案是正交試驗(yàn)中的5號(hào)試驗(yàn)。為最終確定該方案是否為最佳方案，按該條件重復(fù)測(cè)定5次。石榴花瓣黃酮提取率分別為32.6 mg/g、33.2 mg/g、33.0 mg/g、31.0 mg/g、33.4 mg/g，平均值為32.7 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.95%。平均值高于正交試驗(yàn)中其他試驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明此方案可靠。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experiments results

正交試驗(yàn)的方差分析旨在研究各因素對(duì)黃酮提取率結(jié)果的影響程度。通過(guò)計(jì)算各因素偏差平方和、自由度、均方、F值等數(shù)據(jù)，列出試驗(yàn)結(jié)果方差分析見(jiàn)表2。由表2可知，F(xiàn)B=0.51＜F0.10（2，2）=9.00＜FC=10.23＜FA=11.47＜F0.05（2，2）=19.00，說(shuō)明液料比、提取溫度對(duì)石榴花中黃酮提取率起主要作用，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取率沒(méi)有顯著影響，即乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取率的影響最小。

2.3石榴花粉總黃酮的測(cè)定

精確稱取石榴花粉粉末1.000 0 g。在A2B2C3條件下對(duì)石榴花粉提取黃酮類成分，然后測(cè)定其含量。重復(fù)測(cè)定5個(gè)樣品，石榴花粉中黃酮的提取率分別為51.3 mg/g、52.2 mg/g、50.3 mg/g、53.4 mg/g、50.9 mg/g，平均值為51.6 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.35%。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)以石榴花為研究對(duì)象，采用正交試驗(yàn)方法進(jìn)行對(duì)石榴花瓣黃酮類成分的提取及含量測(cè)定進(jìn)行探討，確定最佳提取條件。試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)中選取因素的主次關(guān)系為液料比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度，最佳條件為液料比20∶1（mL∶g），乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度80℃，石榴花瓣中黃酮類成分的提取率為32.7 mg/g，石榴花粉中的黃酮提取率為51.6 mg/g。由此可以確定，石榴花中黃酮類成分含量豐富，我國(guó)石榴資源豐富，為開發(fā)食用、藥用石榴花資源提供一定的參考價(jià)值。

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Extravtion and content determination of flavonoids in pomegranate flower

CHU Hongying1，LUO Xiao2，LI Yu3
（1.Department of Environment and Chemical Engineering，Yellow River Conservancy Technical Institute，Kaifeng 475004，China；2.Henan University of Chinese Medicine，Zhengzhou 450003，China；3.Department of Urology，Zhengzhou Yi He Hospital，Zhengzhou 450047，China）

The flavonoids components were extracted from pomegranate flower and the contents were determined.The optimum extraction conditions of flavonoids from pomegranate flower were optimized by orthogonal experiments and the contents were determined at 504 nm by ultraviolet spectrophotometer.The results showed that the optimal extraction condition were alcohol concentration 70%，liquid-solid ratio 20∶1（ml∶g），temperature 80℃，under these conditions，the flavonoid extraction rate from pomegranate flower and pollen were 32.7 mg/g and 51.6 mg/g，respectively.

pomegranate flower；orthogonal experiment；flavonoids；content determination

R284

0254-5071（2016）02-0127-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.029

2015-11-11

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（13B150125）；河南中醫(yī)藥大學(xué)博士啟動(dòng)基金（BSJJ2011-15）

楚紅英（1973-），女，講師，碩士，主要從事有機(jī)化工教學(xué)科研工作。