炭疽桿菌雙重可視化LAMP檢測方法的建立

劉　玉，陳文琦，王　平，操　敏，韓一芳，張　琪，張錦海，王長軍

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·論著·

炭疽桿菌雙重可視化LAMP檢測方法的建立

劉玉1，陳文琦2，王平1，操敏1，韓一芳1，張琪1，張錦海1，王長軍1

目的建立同時檢測炭疽桿菌capA基因、PA基因的雙重環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法，用于防范生物恐怖威脅。方法設計和合成分別針對炭疽桿菌capA基因、PA基因的引物對，通過優化參數，建立可同時檢測capA基因、PA基因的雙重LAMP方法，測試敏感性和特異性，并應用于模擬樣本和實戰檢測。結果雙重LAMP的檢測capA基因、PA基因的敏感性均可達到50模板拷貝每反應，并具有良好的特異性，在重大保障活動中得到檢驗。結論雙重LAMP方法具有可以同時篩查、簡單快速、靈敏度高等優點，在炭疽桿菌檢測方面有良好應用前景。

炭疽桿菌；環介導等溫擴增；檢測

炭疽桿菌是人畜共患致病菌，具有高度致病性，其芽胞可存活十年以上，可形成氣溶膠，且除易引發突發公共衛生事件外，還被認為是最有效的生物武器之一，以及最可能被用于制造生物恐怖的主要病原之一[1]。

目前的炭疽檢測方法還面臨兩個關鍵問題：一是如何在條件較簡陋的事發現場快速確定是否存在炭疽桿菌；二是如何快速鑒定出炭疽強毒株，以挽救吸入性感染炭疽強毒株的病人生命，同時確定針對目標人群的強制性隔離防疫措施等。炭疽桿菌與枯草芽胞桿菌等其它蠟樣菌群的序列有很高的同源性，但重要區別在于它有2個與毒力密切相關的特異性質粒(pX01和pX02)。pX01質粒上包含分別編碼保護性抗原PA、致死因子、水腫因子的基因，為炭疽桿菌侵襲及毒力所必需；pX02質粒上則包含與莢膜、芽胞形成有關的基因如capA、capB、capC等，為炭疽桿菌在體內抗吞噬、繁殖擴散相關。如炭疽桿菌丟失pX01質粒、pX02質粒中任何一個質粒，也就失去了相應的毒力因素，將成為難以致病的弱毒株[2]。

本研究選擇炭疽桿菌的編碼保護性抗原的PA基因(在pX01毒力質粒上)，以及與莢膜合成相關的capA基因(在pX02毒力質粒上)作為檢測靶基因，建立了一種能實現不開蓋，無需濁度儀即能實現肉眼可視化檢測，又同時能區分強毒株、弱毒株或無毒株(即可初步判定毒力)的雙重環介導恒溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)檢測方法。

1　材料與方法

1.1菌株與樣本本研究使用了26株菌株來建立、優化LAMP反應，以及評估LAMP反應的靈敏性和特異性。其中8株炭疽桿菌強毒株核酸，還有4株僅含pX01質粒的炭疽弱毒株，1株僅含pX02質粒的炭疽弱毒株，以及鼠疫耶爾森菌核酸由(解放軍軍事醫學科學院微生物檢驗中心)提供。部分非致病或機會致病的芽胞桿菌由本實驗室保存。模擬樣本為選擇奶粉、面粉、小蘇打粉、配制培養基的蛋白胨粉，與培養的炭疽桿菌混合。實毒實樣：1株含pX02質粒的炭疽桿菌弱毒株，為第三方機構提供的盲樣實毒標本。

1.2主要試劑及設備LAMP擴增所需的Bst DNA聚合酶購自美國NEB(New England Biolabs)公司。羥基萘酚藍(hydroxy naphthol blue, HNB)，甜菜堿(Glycine betaine)，為美國Sigma公司產品。炭疽桿菌培養所需的PLET瓊脂基礎、溶菌酶、乙酸亞銨購自青島海博生物公司。Premix Ex Taq (Probe qPCR)和MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0購自大連寶生物(Takara)公司。所用其它試劑均為進口或國產分析純試劑；實驗用水均為超純水(MiiliPore Direct-Q 5 超純水系統)。主要設備為：迷你型SC25恒溫金屬浴(美國Torrey Pines公司)、ABI 7500 FAST型實時熒光定量PCR儀(美國賽默飛世爾公司)、Loopamp實時濁度儀LA-320C(日本EIKEN公司)。

1.3引物設計根據炭疽桿菌pX01質粒上PA基因、pX02質粒上capA基因保守序列，利用Primer Explorer V4 software(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)進行設計。為了加快反應速度，額外設計了環(Loop)引物LB和LF[3]。設計10組引物，經實驗篩選出擴增速率快、起峰時間早、未見非特異擴增的1組引物作為優選[4]。

1.4LAMP反應對鎂離子濃度、反應溫度、反應時間、引物配比等參數進行優化[5]最終確定的反應溫度為60 ℃，PA-LAMP和capA-LAMP反應體系總體積均為25 μL，包括20 mmol/L Tris-HCl (pH8.8)，10 mmol/L KCl，10 mmol/L的(NH4)2SO4，0.1% Triton X-100，8 mmol/L MgSO4，0.8 mmol/L betaine，1.4 mmol/L dNTPs，8U Bst DNA polymerase，對應的引物FIP和BIP各1.6 μM，F3和B3各0.2 μM，LF或LB為0.8 μM，以及模板2 μL。反應條件均為60 ℃ 30 min，最后85 ℃ 2 min終止反應。每次反應均設定以蒸餾水為模板，其它條件一致的陰性對照。

1.5LAMP產物檢測使用可視化HNB法(Hydroxynaphthol blue)進行終點檢測[6]。恒溫孵育前在LAMP體系中加入終濃度為120 mM 的HNB，即加入HNB溶液(3 mM)1 μL，總體積仍為25 μL，然后進行恒溫擴增。反應結束后觀察反應管溶液顏色變化，顯天藍色提示有擴增反應，為陽性判定；而紫羅蘭色為陰性判定。以實時熒光定量PCR方法作為參比方法,參見文獻[7]。

2　結　果

2.1優選引物為優化LAMP反應，使用LA-320c濁度儀(Eiken Chemical)對加入不同引物組的LAMP反應進行了測試。在合成的10套引物中，針對PA基因的引物的擴增速率最快，出峰時間最早(17 min)；而針對capA基因的引物出峰時間最早為19 min。見表1。

2.2炭疽桿菌雙重LAMP檢測體系的建立對炭疽強毒株(株編號17003-10)、炭疽弱毒株(株編號17003-42)、蠟狀芽胞桿菌(編號CMCC63301)、質粒標準品的可視化檢測結果如圖1所示，每套體系共A、B兩管，分別檢測炭疽桿菌的pX01質粒、pX02質粒。反應液顏色紫羅蘭色為陰性，天藍色為陽性。反應時間30 min。從圖1中，可直接根據顏色判斷是否炭疽桿菌及其毒力，如1A陽性(提示含炭疽桿菌pX01質粒)、1B陽性(提示含炭疽桿菌pX02質粒)，根據“炭疽桿菌毒力與其菌內特異性的pX01、pX02質粒相關，缺一即為弱毒或無毒株”[1]的判定規則，可判斷1號樣本為同時含pX01質粒和pX02質粒的炭疽桿菌強毒株。而2A陽性(提示含炭疽桿菌pX01質粒)，2B陰性(提示不含炭疽桿菌pX02質粒)，可判斷2號樣本為含pX01質粒，不含pX02質粒的炭疽桿菌弱毒株。

表1　本研究測試優選的LAMP引物

引物組及名稱位置長度(bp)序列(5'-3') 靶基因PA-LAMPB31126-114520CGGTTATGTCTTTCCCTTGAF3909-92618GGGTGGATACAGGCTCGABIP1087-11081027-105147TCCTAGTGATCCATTAGAAACGACT-CGGTTCGTTAAATCCAAATGCTFIP930-949988-101245CCGCCTTTCTACCAGATTTAAATCT-GGAGTGAAGTGTTACCGCAALB1056-107924CGGATATGACATTAAAAGAAGCCCLF952-97322GATACGTGCAGTTGTTTCTTGA炭疽桿菌pX01質粒的PA基因capA-LAMPB3256-27621CCCACTTACGTAATCTGAGTTF345-6622TGTAGCAATCGTATTACCTCTTBIP213-235152-17547CGATGACGATGGTTGGTGACATTA-GACGAAAAACATAATCTGTACCGFIP71-94112-13447CGATGACGATGGTTGGTGACATTA-GACGAAAAACATAATCTGTACCGLB176-19116TGATGGGACGTCACGT炭疽桿菌pX02質粒的capA基因

1 為炭疽強毒株，2 為炭疽弱毒株，3 為陰性對照(蠟樣芽胞桿菌)，4 為標準品陽性對照(構建質粒)圖1　炭疽桿菌雙重可視化LAMP檢測體系

2.3雙重 LAMP反應特異性為測試LAMP方法特異性，使用建立的炭疽桿菌雙重LAMP反應體系，檢測了26株實毒菌株，包括11株炭疽桿菌，9株其它芽胞桿菌，6株其它細菌，并使用實時熒光定量PCR進行復核。在檢測的11株炭疽芽胞桿菌中，均準確鑒定出強毒株和弱毒株，在其它芽胞桿菌中和其它細菌中，均未檢出任何目的片段，表明特異性良好(見表2)。在對已知毒株檢測方面，炭疽桿菌雙重LAMP的檢測結果與相應的雙重實時熒光定量PCR檢測結果一致。

2.4LAMP檢測方法靈敏度分別使用雙重LAMP法、雙重實時熒光定量PCR方法，對同一套梯度稀釋的炭疽桿菌強毒株核酸(菌株編號“17003-10”)進行測試。雙重LAMP方法對PA基因、capA基因檢出限均為50拷貝每反應，而雙重實時熒光定量PCR方法對PA基因、capA基因檢出限分別為50拷貝每反應和5拷貝每反應，即熒光定量PCR對capA基因的檢測相對較敏感些，見表2。

2.5模擬樣本檢測本研究選擇奶粉、面粉、小蘇打粉、配制培養基的蛋白胨粉，作為模擬樣本的白色粉末，以及土壤細粉作為環境樣品，混入50、100、200、300，直至1000 CFU的炭疽桿菌芽胞，使用DNA簡易提取液[8]提取核酸，然后進行雙重LAMP的可視化檢測，并用實時熒光定量PCR進行對比。檢測結果如表3所示，在約3 mg混合樣品(約單管抽提量)中，雙重LAMP法對土壤細粉或面粉為模擬實際樣品的檢出率分別為500 CFU、300 CFU/每管樣品，而對其余模擬實際樣品更為靈敏，達到100或200 CFU/每管樣品。實時熒光定量PCR對模擬樣品的檢查，在同樣使用簡易核酸抽提法時，靈敏度相對較差，特別是對于土壤細粉的混合物，為800-900 CFU/每管樣品時。

2.6實毒實樣檢測在某次重大保障任務中，對一份“可疑白色粉末”(實毒實樣的考核樣本)進行現場快速檢測(人員“三級防護”，檢測后進行現場可疑污染區域的消殺滅以及人員自我洗消工作)。檢測實驗的每測試分為A、B兩管，A管為PA-LAMP，B管為capA-LAMP。編號1為未知標本(即1A管為未知標本的PA-LAMP，1B管為該未知標本的capA-LAMP)，編號2為陰性對照，編號3為已知的炭疽弱毒株核酸對照，4號為質粒標準品。30 min內判定結果，見圖2，由顏色變化可判定該未知樣品檢測出炭疽桿菌capA基因(陽性)，但未測出PA基因(陰性)，因此判斷為炭疽桿菌弱毒株或疫苗株。上報此次實戰偵檢的結果后，最后得到的反饋信息為正確無誤。

未知樣品檢測1A、1B；陰性對照檢測2A、2B；已知質控對照檢測3A、3B；陽性對照標準品檢測4A、4B；其中A管對應PA-LAMP檢測，B管對應capA-LAMP檢測圖2　雙重可視化LAMP方法檢測白色粉末標本

菌株(亞型)菌株信息LAMP方法RealtimePCRPAcapAPAcapA炭疽桿菌 17003-10強毒株,含pX01和pX02質粒++++ 17003-11強毒株,含pX01和pX02質粒++++ 17003-19強毒株,含pX01和pX02質粒++++ 17003-28強毒株,含pX01和pX02質粒++++ 17003-32強毒株,含pX01和pX02質粒++++ 17003-54強毒株,含pX01和pX02質粒++++ 17003-42弱毒株,含pX01質粒+-+- 170044弱毒株,含pX01質粒+-+- 170045弱毒株,含pX01質粒+-+- 170046弱毒株,含pX02質粒-+-+未編號某考核菌株,含pX02質粒-+-+蠟樣芽胞桿菌 CMCC63301---- CMCC63303---- CMCC63305---- ATCC11778----蘇云金芽胞桿菌ATCC10792----巨大芽胞桿菌ATCC14581----枯草芽胞桿菌ATCC663----嗜堿芽胞桿菌ATCCBAA-125----鼠疫耶爾森菌----嗜肺軍團菌----惡臭假單胞菌----銅綠假單胞菌----大腸桿菌O157:H7----大腸桿菌ATCC25922----注:“+”為檢測陽性;“-”為檢測陰性;LAMP終點判定方法為HNB可視法;RealtimePCR的Ct值在39以內且擴增曲線呈S型判定為陽性

表3　LAMP方法檢測靈敏度

表4　LAMP方法對模擬粉末標本中混入炭疽芽胞桿菌的檢出限(CFU)

3　討　論

我國自然疫源地分布廣泛，炭疽病時有發生，嚴重威脅人類健康和生命安全；此外，炭疽粉末等生物恐怖己成為我國社會安全和群眾健康的巨大威脅之一，其現場檢測和防御一直倍受重視?？焖儆行У奶烤覘U菌的現場檢測，對炭疽疫情的預防、控制及應急反應決策中起著極其關鍵的作用[9]。LAMP法具有特異、敏感、快速及不需要特殊儀器的優點[10]，可為炭疽桿菌的核酸檢測提供一個更簡便、更快速、更有效的手段，尤其適用于疫情現場、野外工作、臨時備勤地點及基層單位等條件相對簡陋的環境，在對炭疽桿菌的現場快速檢測方面，具有良好的應用前景。

本研究建立了一種能實現不開蓋，無需濁度儀即能實現肉眼可視化檢測，又同時能區分強毒株、弱毒株或無毒株(即可初步判定毒力)的雙重環介導恒溫擴增檢測方法。雙重LAMP方法通過炭疽桿菌所特有的2個毒力質粒，可將其與近源的蠟樣芽胞桿菌等區分開來，并準確鑒定出了26株菌株中的炭疽桿菌強毒株、弱毒株，表明所建立的檢測方法具有良好特異性。對實驗室制備的標準株核酸的檢測中，對PA基因、capA基因檢出限均為50拷貝每反應，比實時熒光定量定量PCR(對PA基因、capA基因檢出限分別為50拷貝每反應和5拷貝每反應)相似或略低，對于病原檢測來說，靈敏度已經足夠。而炭疽桿菌的LAMP方法擴增時間更短，最多只需要30 min，且只需一個普通水浴箱或者一臺小型的迷你恒溫金屬浴，甚至是一杯開水即可，無需貴重精密的設備，對于現場應急檢測更有優勢[11]。

在對于模擬現場樣品的檢測中，使用簡易核酸抽提法時，LAMP的檢測敏感性為100～300 CFU/管抽提量，卻比實時熒光定量PCR具有更好的敏感性，特別是對于土壤細粉混合物等，這可能是因為LAMP反應的抗干擾能力更強，多數學者認為LAMP對于樣品中原有或污染的其它無關或干擾片段不敏感，而其他核酸檢測方法則無法做到這一點，甚至有人認為，LAMP擴增使用的樣品可以是未經提純處理的，即一定程度上可以省略核酸抽提步驟，并不影響檢測的靈敏度和特異性[12]。

本研究建立了快速檢測炭疽桿菌PA基因、capA基因的雙重LAMP方法，具有快速準確、高靈敏度的特點，可提高檢測速度和效率，尤其適合野外、現場檢測，對于應對反生物恐怖襲擊預警、突發傳染病疫情或突發公共衛生事件應急處置和流行病學調查等具有一定的意義，可能為野外現場檢測或基層單位應用提供更良好的平臺。

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(本文編輯：張仲書；英文編輯：王建東)

Development of a duplex loop-mediated isothermal amplification assay for detection of bacillus anthracis

LIU Yu1, CHEN Wen-qi2，WANG Ping1,CAOming1，HANYi-fang1,ZHANGQi1,ZHANGJin-hai1,WANGChang-jun1.

1.CenterforDiseaseControlandPreventionofNanjingCommand,Nanjing,Jiangsu210002,China; 2.DepartmentofDermatology,NanjingFirstHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu210016,China

ObjectiveTo develop a dupplex loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for the detection of specific structural genes and virulence genes in bacillus anthracis. MethodsTwo sets of specific primers were designed and synthesized according to CapA and PA genes of bacillus anthracis. The reaction parameters were optimized to develop the dupplex LAMP assay for the rapid detection of bacillus anthracis. This study also tested the sensitivity and specificity of the LAMP assay, and applied it to test simulated and actual samples. ResultsA double LAMP assay for rapid detection of bacillus anthracis PA gene (plasmid pX01) and capA gene (pX02 plasmid) on visualization methods had been established. The detectable sensitivity of the duplex LAMP was 50 template copy per reaction, and it had good specificity, stability and reproducibility. ConclusionConsidering LAMP’s simplicity in operation and high sensitivity, there is potential use in clinical diagnosis and surveillance of bacillus anthracis.

bacillus anthracis; loop-mediated isothermal amplification assay; detection

國家科技重大專項(2013ZX10004103004)；全軍十二五重點項目(AWS11C001，AWS11C009)；軍隊后勤科研重點項目(BWS14J025)；國家自然科學基金青年基金(81402619)；江蘇省科技支撐計劃社會發展項目(BE2013603)；江蘇省自然科學基金青年基金(BK20130083)

1. 210002江蘇南京，南京軍區疾病預防控制中心疾控所；2. 210006江蘇南京，南京醫科大學附屬南京第一醫院皮膚科

王長軍，E-mail：science2008@hotmail.com；張錦海，E-mail：ahoi@163.com

R378.72

A

10.3969/j.issn.1672-271X.2016.04.002

2016-05-30；

2016-06-20)

引用格式：劉玉，陳文琦，王平，等.炭疽桿菌雙重可視化LAMP檢測方法的建立[J].東南國防醫藥，2016,18(4):341-345.