川芎嗪減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷后心肌細胞凋亡及其機制研究

呂　磊，張　潔，殷宇剛，徐　軍

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·論著·

川芎嗪減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷后心肌細胞凋亡及其機制研究

呂磊，張潔，殷宇剛，徐軍

目的觀察川芎嗪預處理對在體大鼠心肌缺血再灌注所致心肌細胞凋亡的影響，探討其可能機制。方法40只雄性SD大鼠隨機分為假手術組、缺血再灌注組、川芎嗪組、川芎嗪+渥曼青霉素組和渥曼青霉素組。結扎左前降支35 min，再灌120 min建立缺血再灌注模型。假手術組前降支近端穿線但不結扎。用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的原位缺口末端標記法(TUNEL)檢測心肌細胞凋亡，酶聯免疫吸附測定法測定缺血心肌組織半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase3)活性，實時熒光定量PCR法測定缺血心肌Bax和Bcl-2 mRNA的表達水平，Western blot法檢測心肌磷酸化Akt的表達。結果缺血再灌注增加心肌細胞凋亡指數及caspase 3活性，川芎嗪預處理明顯降低心肌細胞凋亡指數及caspase 3活性，降低Bax mRNA的表達水平，增加Bcl-2 mRNA和磷酸化Akt的表達水平，渥曼青霉素顯著抑制上述指標的變化并取消了川芎嗪所致的磷酸化Akt表達水平的增加。結論川芎嗪能減輕在體大鼠心肌缺血再灌注所致心肌細胞凋亡，PI3K/Akt信號通路可能參與這一保護作用。

缺血再灌注；凋亡；川芎嗪；Akt信號通路；心肌保護

快速完全恢復冠狀動脈血供是治療急性心肌梗死最有效的方法，但再灌注同時也可能導致嚴重的缺血再灌注(ischemia reperfusion, IR)損傷，降低患者再灌注的獲益[1]。心肌細胞凋亡是心肌IR損傷的重要病理機制，近年研究報道川芎嗪能減少心力衰竭大鼠的心肌細胞凋亡，改善心功能[2]。川芎嗪是中藥川芎的有效單體成分，化學名為四甲基吡嗪 (tetramethylpyrazine，TMP)，具有改善微循環、抗血小板聚集以及活血化淤等作用，在心、腦、腎的IR損傷模型中表現出有效的抗炎和抗氧化作用[3]，可減少活性氧簇，減輕輻射所致的細胞凋亡[4]。然而川芎嗪對在體大鼠IR后心肌細胞凋亡的影響及其機制尚不清楚。本研究通過建立在體大鼠心肌IR模型，探討川芎嗪對心肌細胞凋亡的影響及其可能機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠40只，體質量250～280 g，由江蘇省動物實驗基地南京軍區南京總醫院實驗動物中心提供，術前在標準檢疫房間中適應飼養1周，心電圖檢查陰性。術前12 h禁食，自由飲水。

1.2藥物和主要試劑川芎嗪購自中國藥品生物制品檢定所，渥曼青霉素(wortmanin)購自美國Sigma-Aldrich公司?？捡R斯亮藍蛋白測定試劑盒購自南京建成生物工程公司，TUNEL試劑盒購自德國Roche公司，caspase 3酶聯免疫吸附測定試劑盒購自美國R&D公司。Trizol裂解液和M-MLV逆轉錄酶購自美國Invitrogen公司，抗Akt和抗磷酸化Akt(serine 473)多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，蛋白酶抑制劑購自美國Thermo Scientific公司，其他試劑均為進口分裝或國產分析純。

1.3實驗動物分組大鼠隨機分為5組。①假手術組(sham組，n=8)：開胸前降支近端穿線但不結扎。②IR組(n=8)：開胸結扎冠狀動脈左前降支35 min，再灌注120 min。③川芎嗪組(n=8)：結扎前降支前5 min靜脈給予川芎嗪10 mg/kg，余同IR組。④川芎嗪+渥曼青霉素組(n=8)：再灌前15 min靜脈給予PI3K抑制劑渥曼青霉素15 μg/kg，余同川芎嗪組。⑤渥曼青霉素組(n=8)：再灌前15 min靜脈給予渥曼青霉素15 μg/kg，余同IR組。

1.4在體大鼠IR模型的建立大鼠氯胺酮(150 mg/kg)腹腔注射麻醉后仰臥位固定，同時給予肝素(500 IU/kg)，記錄II導聯心電圖。氣管切開接小動物呼吸機機械通氣(潮氣量8 mL/kg，頻率60次/min)。自胸骨左緣3～4肋間開胸，暴露心臟，打開心包，于左心耳與肺動脈圓錐之間找出前降支，左心耳下方3 mm處前降支貫穿6-0無損傷縫線，結扎前降支，結扎后心電圖提示ST段明顯抬高，QRS波增寬以及結扎線以下左室前壁出現紫紺為結扎成功。持續缺血35 min后剪斷結扎線使血流再通，復灌時左室前壁紫紺消失，抬高的ST段下降1/2以上、增高的R波振幅降低，伴有心律失常出現或者Q波出現，術中全程監測心電圖。再灌注120 min后心臟快速放血處死動物，取出心臟，切取左室缺血區心肌快速液氮冷凍，隨后移入-80 ℃冰箱凍存待用。

1.5測定指標

1.5.1TUNEL法檢測心肌細胞凋亡嚴格按TUNEL試劑盒說明書操作。4%多聚甲醛固定大鼠新鮮左室心肌組織，石蠟包埋，常規脫蠟水化，按試劑盒說明進行心肌細胞凋亡原位檢測。光學顯微鏡下正常心肌細胞呈藍色，凋亡心肌細胞細胞核呈棕褐色(TUNEL陽性)。每張切片分別隨機選取10個非重疊200高倍鏡視野，分別計數凋亡心肌細胞和心肌細胞總數，心肌細胞凋亡指數=凋亡心肌細胞數/心肌細胞總數×100%。

1.5.2ELISA法檢測心肌組織caspase3嚴格按說明書操作步驟進行，考馬斯亮藍蛋白測定法測定心肌組織的蛋白含量，計算每mg蛋白中的caspase3含量。

1.5.3實時PCR測定心肌組織中Bax和Bcl-2 mRNA表達Trizol提取左室缺血心肌細胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度及260 nm和280 nm的吸光度值。所有樣本波長260/280比值均在1.8～2.0。用M-MLV逆轉錄酶逆轉錄為cDNA。進行實時 PCR反應。從NCBI數據庫選取大鼠心肌Bcl-2、Bax和GAPDH引物序列，用Primer 5.0軟件設計引物，由南京金斯瑞科技有限公司合成。GAPDH為內參。Bcl-2上游引物5-ACTTCTCTCGTCGCTACCGT-3，下游引物5-TCCCTGAAGAGTTCCTCCAC-3，產物大小為112 bp。Bax上游引物5-TAGCAAACTGGTGCTCAAG G-3，下游引物5- TCTTGGATCCAGACAAGCAG-3，產物大小為111bp。內參GAPDH上游引物5-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3，下游引物5- AGGTGGAAGAATGGGAGTTG-3，產物大小為133 bp。反應參數：預變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃15 s，退火及延伸60 ℃20 s，40個循環。采用2-△△Ct公式[5]計算Bcl-2和Bax mRNA的表達水平。將目的基因與內參基因進行比較，得到相對表達量。

1.5.4心肌組織中磷酸化Akt和Akt含量測定用Western blot法檢測各組心肌組織中磷酸化Akt和Akt含量。用含蛋白酶抑制劑的裂解液提取心肌組織總蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，加樣總蛋白40 μg，聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定樣品，轉膜后用一抗(磷酸化Akt和Akt抗體，1∶1000稀釋)封閉，4 ℃過夜。加入辣根過氧化酶標記的二抗(1∶5000稀釋)封閉液中，室溫孵育2 h。采用Bio-Rad公司的Gel Doc2000凝膠圖像專用軟件分析目標條帶的積分吸光度值，以磷酸化Akt/Akt值反映Akt的相對活化水平。

2　結　果

2.1心肌細胞TUNEL染色TUNEL染色后凋亡陽性心肌細胞核呈棕黃色，正常細胞核呈藍色。凋亡細胞主要位于心肌梗死邊緣區。除假手術組外，各組均可見凋亡細胞。IR組凋亡指數為(24.7±3.6)%，川芎嗪組凋亡指數最低，為(15.8±3.0)%。川芎嗪+渥曼青霉素組和渥曼青霉素組分別為(21.3±3.9)%和(25.0±4.2)%，與IR組相比，差異均無統計學意義(P>0.05，圖1)。

2.2各組大鼠心肌組織caspase3含量IR組大鼠心肌caspase3含量較假手術組顯著升高(P<0.05)。川芎嗪預處理后，caspase3含量為(13.930±4.672)pg/mg，與IR組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。川芎嗪+渥曼青霉素組caspase3為(24.770±7.767)pg/mg，與IR組相比，無顯著統計學差異(P>0.05)，見表1，提示渥曼青霉素減弱了川芎嗪降低caspase3的作用。

2.3大鼠心肌組織中Bax和Bcl-2 mRNA的表達IR組Bcl-2 mRNA的相對表達水平較假手術組明顯下降，而Bax mRNA的表達水平上升。川芎嗪組的Bcl-2 mRNA為(0.657±0.075)，Bax mRNA為(4.053±0.791)，與IR組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，提示川芎嗪上調了大鼠心肌組織中Bcl-2 mRNA的表達，抑制了Bax mRNA的表達。合用渥曼青霉素后，Bcl-2 mRNA的相對表達水平明顯下降，Bax mRNA表達水平顯著上升(與川芎嗪組比，P均<0.05)，提示渥曼青霉素能部分阻斷川芎嗪升高Bcl-2 mRNA、降低Bax mRNA的作用。與IR組相比，單用渥曼青霉素對Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的表達水平無顯著差異(P<0.05)，見表1。

凋亡細胞核光鏡下呈棕褐色，正常細胞核呈藍色(TUNEL染色 ×200)圖1　各組大鼠心肌組織TUNEL染色結果

組別caspase3(pg/mg)Bcl-2Bax假手術組3.916±1.922*△1.042±0.134*△1.038±0.219*△IR組26.550±5.733△0.304±0.056△8.465±1.514△川芎嗪組13.930±4.672*0.657±0.075*4.053±0.791*川芎嗪+渥曼青霉素組24.770±7.767*△0.382±0.073△7.255±1.235*△渥曼青霉素組25.846±6.981△0.401±0.093△8.198±1.492△注:與IR組比較,*P<0.05;與川芎嗪組比較,△P<0.05

1為假手術組，2為IR組，3為川芎嗪組，4為川芎嗪+渥曼青霉素組，5為渥曼青霉素組;與IR組相比，*P<0.05；與川芎嗪組相比，#P<0.05圖2　心肌組織中磷酸化Akt的蛋白表達

2.4大鼠心肌組織中磷酸化Akt蛋白的表達結果川芎嗪組磷酸化Akt蛋白表達水平顯著高于IR組(2.14±0.32 vs 0.68±0.14，P<0.05)，川芎嗪+渥曼青霉素組磷酸化Akt蛋白表達水平低于川芎嗪組(1.21±0.24 vs 2.14±0.32，P<0.05)，提示川芎嗪上調了大鼠心肌組織中磷酸化Akt 蛋白的表達，而渥曼青霉素能部分抑制川芎嗪導致的磷酸化Akt蛋白表達增加。單用渥曼青霉素對Akt的磷酸化表達(0.59±0.15)無明顯影響，與IR組相比，P>0.05，見圖2。

3　討　論

心肌細胞凋亡是IR后心肌細胞損失的重要方式，也是心肌IR后心肌梗死的促進因素。再灌注能加速心肌細胞凋亡，抑制或減少凋亡是減輕IR損傷的關鍵措施之一[6]?，F普遍認為細胞凋亡是一系列高度調控的caspase級聯反應的結果。caspase3處于caspase級聯反應的下游，通過降解細胞內相應底物使細胞死亡，是凋亡的啟動蛋白和凋亡事件的執行者。一旦caspase-3被激活，凋亡將不可避免，是凋亡發生的標志酶[7]。用TUNEL法對凋亡細胞進行原位染色，能準確反映出細胞凋亡的典型形態特征，靈敏度高，廣泛用于細胞凋亡檢測[1]。本研究通過TUNEL染色來觀察川芎嗪對心肌IR后心肌細胞凋亡的影響并測定IR心肌組織中caspase-3含量，結果表明與IR組相比，川芎嗪組凋亡指數明顯降低，caspase-3活性降低，兩者一致，提示川芎嗪能減少IR后心肌細胞凋亡，對心肌產生保護作用。這與Lin等[8]的報道一致。合用PI3K抑制劑渥曼青霉素后，凋亡指數和caspase3含量與IR組無顯著差異，提示渥曼青霉素減弱了川芎嗪抗心肌細胞凋亡的作用。

B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)家族與細胞凋亡密切相關。Bcl-2家族參與細胞凋亡的線粒體通路，是該通路的關鍵調節因素。Bcl-2家族可以分為抑制凋亡的Bcl-2亞族(包括Bcl-2、Bcl-xL等)和促進凋亡的Bax亞族(包括Bax、Bak等)。Bcl-2分布于線粒體外膜上，是第一個被確認的抗凋亡基因，能抑制線粒體通透性轉化孔的開放，阻斷內質網釋放鈣離子，降低鈣離子依賴性的核酸內切酶活性，提高線粒體的鈣緩沖能力，減少細胞色素C等凋亡因子釋放，從而減少caspase級聯反應所致細胞凋亡[9]，在調節病理和生理凋亡中起關鍵作用。Bax是Bcl-2的同源基因，可促進線粒體通透性轉化孔開放，增加細胞色素C及凋亡因子的釋放，拮抗Bcl-2的保護效應而使細胞趨于凋亡。Bax與Bcl-2的蛋白水平與凋亡調控直接相關，Bax升高可促進細胞凋亡，Bcl-2升高則抑制細胞凋亡[10-11]。本研究結果表明，IR組大鼠心肌缺血組織的Bcl-2 mRNA相對表達水平較假手術組明顯下降，而Bax mRNA水平上升。川芎嗪預處理后，Bcl-2 mRNA水平上升，Bax mRNA水平下降，提示IR促進大鼠心肌細胞凋亡，而川芎嗪減少了細胞凋亡。合用渥曼青霉素后，Bcl-2 mRNA的相對表達水平明顯下降，Bax mRNA顯著上升，提示渥曼青霉素能部分阻斷川芎嗪升高Bcl-2 mRNA和降低Bax mRNA的作用。

PI3K/Akt信號通路是信號轉導酶的一個保守家族。近年研究發現，PI3K/Akt信號通路可能是細胞在遭受有害刺激時，限制炎癥反應和凋亡事件的內源性負反饋調節子和代償機制，在細胞的凋亡、存活、炎性反應以及細胞增殖活動中發揮了重要的生物學功能。蛋白激酶B(又稱為Akt)處于PI3K信號通路的中心環節。Akt屬于Ser/Thr蛋白，是PI3K下游直接和最主要的靶酶，能調控多個與細胞凋亡相關的基因，促進細胞存活。Akt激活能抑制Bcl-2形成的線粒體跨膜通道，保證線粒體通透性轉換孔的穩定性，減少細胞色素C的釋放和caspase級聯反應，從而抑制凋亡[12-13]。

本研究通過Western blot法測定心肌組織中磷酸化Akt的表達，結果表明川芎嗪組磷酸化Akt水平較IR組明顯增加，而川芎嗪與PI3K抑制劑渥曼青霉素合用時，Akt的磷酸化水平下降，說明川芎嗪激活了Akt通路，而渥曼青霉素部分阻斷了川芎嗪減輕IR后心肌細胞凋亡的作用。

綜上所述，川芎嗪能減少在體大鼠心肌IR后心肌細胞凋亡，其機制可能與激活PI3K/Akt信號通路有關。本研究初步探討了川芎嗪減輕心肌IR損傷所致心肌細胞凋亡及其可能機制，而川芎嗪與線粒體凋亡通路的關系如何，川芎嗪對凋亡的影響有無時間依賴性等具體機制及影響因素仍有待進一步研究。

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(本文編輯：齊名；英文編輯：王建東)

An investigation on the effects of ligustrazine in attenuating apoptosis of myocardial ischemia reperfusion injury in rats and its mechanism

LV Lei, ZHANG Jie, YIN Yu-gang, XU Jun.

DepartmentofGeriatricCardiology,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,PLA,Nanjing210002,Jiangsu,China

ObjectiveTo observe the effect of ligustrazine (tetramethylpyrazine, TMP) pretreatment on apoptosis caused by myocardial ischemia reperfusion (IR) in ratsinvivoand to investigate the possible mechanism. MethodsForty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham, IR, TMP, TMP+wortmannin (TMP+wort) and wort group. All hearts except those in the sham group were subjected to 35 min ischemia followed by 120 min reperfusion. Apoptosis of myocardial cell was measured by TUNEL staining and caspase-3 activity. The expression of Bax and Bcl-2 mRNA was detected by real time PCR. The expression of phosphorylated Akt and total Akt were detected by Western blot. ResultsCompared to the IR group, the myocardial tissues of the TMP group showed a decrease in the apoptosis index, caspase 3 activity and the expression of Bax mRNA. The expression of Bcl-2 mRNA and phosphorylation Akt in the TMP group increased significantly compared to that in the IR group. However, these effects could be significantly reversed by wortmannin which abolished the decrease of caspase 3, apoptosis index and Bax mRNA and increase of Bcl-2 mRNA and phosphorylation Akt brought by TMP. ConclusionPretreatment of ligustrazine attenuated the apoptosis of myocardial IR in ratsinvivo. PI3K/Akt pathway may be involved in the protective mechanism of ligustrazine.

ischemia reperfusion; apoptosis; ligustrazine; Akt signaling pathway; myocardial protection

南京軍區南京總醫院科研基金(2014061)

210002江蘇南京，南京軍區南京總醫院心臟內科干部病區

徐軍，E-mail: xxujun305@sina.com

R541.4

A

10.3969/j.issn.1672-271X.2016.04.007

2016-04-12；

2016-04-29)

引用格式：呂磊，張潔，殷宇剛，等.川芎嗪減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷后心肌細胞凋亡及其機制研究[J].東南國防醫藥，2016,18(4):361-364,367.