響應面法優化同時蒸餾法萃取熏馬腸中揮發性風味物質的研究

高 蕾，陳 愷，周建中，孔令明，李 蓉，楊海燕（新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052）

響應面法優化同時蒸餾法萃取熏馬腸中揮發性風味物質的研究

高 蕾，陳 愷，周建中，孔令明，李 蓉，楊海燕*
（新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052）

使用同時蒸餾萃取法萃取熏馬腸中揮發性風味物質，在單因素實驗基礎上采用Box-Behnken實驗設計對提取條件進行優化。結果表明，使用二氯甲烷為提取溶劑，最佳萃取條件為提取時間156 min，溶劑用量50 mL，料液比1∶2.4，在此最優條件下提取量為875.63 mg/kg。氣相色譜質譜聯用法分析結果表明，熏馬腸揮發性風味物質主要含55種化合物，有酚類、醇類、烯烴類、烷烴類、脂類、醛酮類、含氮含硫及雜環化合物，其中酚類物質含量較高占提取總含量的52.66%，為熏馬腸主要的風味物質。

熏馬腸，同時蒸餾萃取-氣質聯用法，揮發性風味物質，響應面優化

馬肉具有較高的營養價值，其不飽和脂肪酸含量達58.5%～62.0%，蛋白質含量達20%～24%，且含有20多種氨基酸，鐵含量較高，分別是牛羊肉的8～9倍，豬肉的5～6倍，而膽固醇含量僅為2.48%［1］。熏馬腸制品主要通過干腌法進行腌制再經過低溫熏制而成，有獨特的風味，是極受歡迎的新疆特色食品之一［2］。目前對馬肉制品的研究主要集中在傳統工藝生產熏馬腸及質量控制，傳統熏馬腸及西式熏馬腸的加工工藝及營養價值，發酵馬肉中乳酸菌的分離篩選等加工工藝流程方面［3-4］，其制作工藝、風味物質種類及形成機理的系統研究相對匱乏，因此造成產品質量評價困難，生產工藝參數控制粗放，產品品質波動較大等問題，生產規模難以擴大，無法形成行業標準，使新疆馬肉制品產業的發展規模受到制約。

揮發性風味物質提取方法中應用較為廣泛的有同時蒸餾萃取法（Simultaneous Distillation Extraction，SDE）、超臨界CO2萃取法（Supercritical Carbon Dioxide Fluid Extraction，SFE）、固相微萃取（Solid Phase Microextraction，SPME），不同提取方法其優缺點不同。與SFE和SPME方法相比，SDE法通過同時加熱樣品及有機溶劑至沸騰，將揮發性風味物質的水蒸汽蒸餾與溶劑萃取同時進行。其操作簡便，分析時間短，在溶劑用量較少情況下即可得到很好的提取效果，廣泛運用于食品分析、香精香料、藥物化學等行業的樣品分析前處理中。謝章斌等［5］用同時蒸餾提取法提取鵝肥肝中的揮發性風味物質，并用氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS）與氣相色譜-嗅覺測量法（GC-O）進行檢驗。陳紅霞等［6］用同時蒸餾提取法和頂空固相微萃取法提取兔肉中的揮發性風味物質并用GC-MS進行檢驗。董智哲等［7］采用固相微萃取法和同時蒸餾萃取兩種方法對海南地區香草蘭豆莢中揮發性成分進行檢測分析。熏馬腸具有特殊的風味，高溫蒸煮為其主要食用方式，因此使用SDE法可充分提取檢測熏馬肉制品的揮發性風味物質。

揮發性特征風味是熏馬腸特點之一，是評價質量的重要指標，也是其特征指標。本研究基于Box-Behnken法進行實驗設計并通過響應面分析法優化SDE萃取條件，以最優條件提取熏馬腸的揮發性風味物質并采用氣相色譜質譜聯用技術對其進行分析，以期為熏馬腸的生產工藝改進提供參考，對進一步鑒定熏馬腸特征風味物質具有指導作用和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬肉 新疆昭蘇縣綠源食品有限責任公司；三聚磷酸鈉、六偏磷酸鈉、焦磷酸鈉、亞硝酸鈉、二氯甲烷、石油醚、正戊烷、正己烷、無水Na2SO4等化學試劑 均為分析純，購于阜瑞生物器材公司；癸酸乙酯、二氯甲烷等化學試劑 均為色譜純，購于阜瑞生物器材公司。

AL204-IC型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BCD-219SKD型冰箱 青島海爾股份有限公司；FW-100型高速萬能粉碎機 北京市永光明醫療儀器廠；同時蒸餾萃取裝置 長城玻璃儀器公司定制；DZKW-D-2型電熱恒溫水浴鍋 北京永光明醫療儀器廠；ITQ900 GC/MS氣相色譜/質譜聯用儀 美國PE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 新疆傳統熏馬腸的制作工藝流程［2］馬肉→切塊（100 mm×30 mm×20 mm，200 g）→配料（食鹽、亞硝酸鈉等）→腌制（24 h）→切丁→灌制→煙熏（6 h）→蒸煮（2 h）→冷卻→真空包裝→殺菌冷卻→成品→常溫貯藏。

1.2.2 同時蒸餾萃取法 稱取經粉碎機粉碎熏馬腸樣品25.0 g（精確到0.1 g）置于1000 mL樣品瓶中并加入蒸餾水，量取萃取溶劑置于溶劑瓶中，萃取完畢后溶劑裝入棕色樣品瓶加入適量的無水Na2SO4靜置密封，放置于-18℃冰箱過夜，0.45 μm過濾膜過濾后冷藏。

1.2.3 單因素實驗 通過前期預實驗及資料查閱［5-8］，考察萃取溶劑種類、提取時間、溶劑用量、料液比4個因素，對SDE法提取熏馬腸揮發性風味物質提取量的影響。

1.2.3.1 溶劑種類對熏馬腸風味物質提取總量的影響 分別稱取熏馬腸25.0 g，以料液比為1∶3，提取時間為150 min，溶劑用量50 mL條件下考察石油醚、正己烷、二氯甲烷、正戊烷四種不同溶劑對熏馬腸風味物質提取總量的影響。

1.2.3.2 溶劑用量對熏馬腸特征風味物質提取總量的影響 分別稱取熏馬腸25.0 g，以料液比為1∶3，提取時間為150 min，使用溶劑為二氯甲烷，分別設定溶劑用量為40、50、60、70、80 mL，考察溶劑不同用量對熏馬腸風味物質提取總量的影響。

1.2.3.3 提取時間對熏馬腸特征風味物質提取總量的影響 分別稱取熏馬腸25.0 g，以料液比為1∶3，溶劑用量為50 mL，使用溶劑為二氯甲烷，分別設定75、90、105、120、135、150、165、180 min，考察不同提取時間對熏馬腸風味物質提取總量的影響。

1.2.3.4 料液比對熏馬腸特征風味物質提取總量的影響 分別稱取熏馬腸25.0 g，以提取時間為150 min，溶劑用量為50 mL，使用溶劑為二氯甲烷，分別設定1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 g/mL為料液比，考察不同料液比對熏馬腸風味物質提取總量的影響。

1.2.4 響應法實驗設計 在單因素實驗的基礎上，考慮各因素對熏馬腸揮發性風味物質提取量的影響，選擇提取時間（A）、溶劑用量（B）、料液比（C）為三因素，根據Box-Behnken中心組合實驗設計，通過Design-Expert 8.0.6軟件，以揮發性風味物質提取量（mg/g）為響應值，進行二次回歸分析設計實驗，確定最佳提取條件。實驗因素水平設計表見表1。

表1 響應面實驗因素水平表Table1 Factors and levels design of the response surface methodology

1.2.5 GC-MS條件及分析方法 氣相色譜柱：Hp-5毛細管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；氫火焰離子化（FID）檢測器。升溫程序：起始溫度40℃，保持5 min；以5℃·min-1，上升至70℃，保持5 min；接著以2℃·min-1，上升至90℃，保持3 min；再以3℃·min-1，上升至180℃，保持3 min；最后以5℃·min-1，上升至240℃，保持10 min；不分流方式進樣，進樣量1 μL；載氣：N2。

質譜條件：離子源為EI源，離子源溫度為200℃，電子能量為70 eV，掃描范圍m/z為33.0～500.0。

根據檢測所得譜圖使用計算機檢索與NIST library對照相匹配進行初步檢索及資料分析進行定性分析。考察SDE法提取熏馬腸揮發性風味物質及其響應面優化階段，化合物定量方法為內標法［9］，采用癸酸乙酯為內標進行定量分析，公式為：化合物濃度（mg/kg）=（化合物峰面積/內標物峰面積）×內標濃度。使用GC-MS對最優方法所提取揮發性風味物質分析階段，根據峰面積歸一化法確定各個成分的相對峰面積百分含量。

1.2.6 數據處理 每次實驗設3個平行樣，取平均值，使用Excel 2010處理數據。使用Box-Behnken中心組合實驗設計方案，通過Design-Expert 8.0.6軟件及結合方差分析對數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 SDE法提取熏馬腸揮發性風味物質單因素實驗

2.1.1 溶劑種類對熏馬腸風味物質提取總量的影響

在料液比、提取時間、溶劑用量一定情況下，通過查閱相關文獻及前期預實驗選擇石油醚、正己烷、二氯甲烷、正戊烷為提取溶劑，實驗結果見圖1。二氯甲烷萃取效果最好，分析原因為二氯甲烷對極性強的化合物具有強選擇性。正戊烷雖然沸點（36.1℃）與二氯甲烷沸點相近，但提取量較低。正己烷為溶劑時，萃取量較低，效果不佳，由于正己烷的沸點比二氯甲烷高，低沸點化合物損失較大。石油醚為輕質石油產品，是相對分子質量低的烷烴類混合物，其中含有少量不飽和烴，沸點與烷烴相近，用蒸餾法無法分離。四種溶劑對熏馬腸風味物質提取總量存在顯著差異，所以采用二氯甲烷作為提取溶劑。

圖1 不同溶劑對熏馬腸風味物質提取總量的影響Fig.1 Effect of different kinds of solvent on total extraction of flavor compounds determination in smoked horsemeat

2.1.2 溶劑用量對熏馬腸特征風味物質提取總量的影響 在料液比、提取時間一定情況下，使用不同用量二氯甲烷對熏馬腸風味物質進行提取，實驗結果見圖2。由圖2可知，所提取的風味物質總量有顯著差異，二氯甲烷用量為50 mL時風味物質提取量最大，但當溶劑用量分別增加為60、70、80 mL時提取總量沒有顯著變化，因此選擇50 mL溶劑用量進行后續實驗。

圖2 溶劑用量對熏馬腸風味物質提取總量的影響Fig.2 Effect of the volume of solvent on total extraction of flavor compounds determination in smoked horsemeat

2.1.3 提取時間對熏馬腸特征風味物質提取總量的影響 在料液比、溶劑用量一定情況下，使用二氯甲烷對熏馬腸風味物質進行提取，實驗結果見圖3。隨著提取時間的增加，提取總量不斷增加，當提取時間增至150 min時，提取總量為最大值。但進一步增加提取時間至165 min時，提取總量呈下降趨勢。因此選擇最佳提取時間為150 min

圖3 提取時間對熏馬腸風味物質提取總量的影響Fig.3 Effect of time on total extraction of flavor compounds determination in smoked horsemeat

2.1.4 料液比對熏馬腸特征風味物質提取總量的影響 由圖4可知，不同料液比對風味物質提取總量的影響有明顯差異，當料液比為1∶3時提取的風味物質總量較高，進一步增加水量后提取量有一定減少。分析原因為料液比較小時，物料無法充分浸沒在水中從而形成粘稠物，影響了提取效果。當料液比過大時，提取總量有所下降，分析原因為物料大量漂浮在水面無法充分浸潤，提取初期物料吸水量過低對提取效果有一定影響，所以選擇料液比為1∶3。

圖4 料液比對熏馬腸風味物質提取總量的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on total extraction of flavor compounds determination in smoked horsemeat

2.2 響應面法優化SDE法萃取熏馬腸風味物質條件

以提取量為響應值，對熏馬腸揮發性風味物質的提取量進行響應面分析，實驗方案及結果見表2，方差分析結果見表3。

使用Design Expert 8.0軟件進行數據多元回歸擬合，可得到總峰面積對提取時間（A）、溶劑用量（B）、料液比（C）的二次多項回歸模型：

由表3可知，回歸模型極顯著（p=0.0007＜0.01）而失擬項不顯著（p=0.1912），因此該模型擬合程度良好；模型的確定系數R2=0.9823，信噪比（S/N）=17.101，

表2 實驗設計方案及結果Table2 The experimental results and response surface design arrangement

表3 回歸分析結果Table3 Results of regression analysis

說明該模型可信度較高，可使用此模型對熏馬腸樣品揮發性風味物質進行提取。同時，A、C、A2、B2、C2對結果的影響均為極顯著（p＜0.01），因此可得出對提取量影響的大小依次為：料液比、提取時間和溶劑用量。交互項的p＞0.01，表明三個因素的交互作用對于熏馬腸揮發性風味物質的提取影響不顯著。

由回歸方程并考慮實際情況修正后得到的最佳條件為提取時間156 min，溶劑用量50 mL，料液比1∶2.4。在此條件下進行三次驗證實驗，得到提取量為875.63 mg/kg，接近模型預測值894.09 mg/kg。

2.3 熏馬腸特征風味物質的定性分析

根據上述實驗獲得的最佳實驗條件及實驗方法進行熏馬腸風味物質的提取，并使用GC-MS分析得出總離子流色譜圖，如圖5所示。對質譜圖數據庫進行檢索，所確定的化合物種類、相對含量及出峰時間見表4。

圖5 熏馬腸揮發性組分的GC-MS總離子流色譜圖Fig.5 Total ion current chromatogram of smoked horsemeat extract

在熏馬腸中檢測出55種不同的化合物，其中有酚類、醇類、烯烴類、烷烴類、酯類、醛酮類、含氮含硫及雜環化合物。煙熏對提高肉制品的香氣有明顯作用，熏煙成分因所用木材種類差異而有不同，但木材燃燒時木質素的降解可形成酚類物質，此類物質是熏制食品的主要特征風味物質［10-11］。此次從熏馬腸中分離出來并經鑒定的酚類有8種，占提取物總含量的49.25%。其中2，2'-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）含量最高，占總量的39.35%、愈瘡木酚（鄰甲氧基苯酚）2.69%、4-甲基愈創木酚2.39%、4-乙基愈創木酚0.65%、苯酚1.85%、茴香腦1.47%、2，4-二甲基苯酚0.59%、2，4-二叔丁基苯酚0.26%，可見熏馬腸制品的主要特征風味物質為酚類物質。

醇類也是熏馬腸中揮發性風味物質中含量較多的化合物，其含量占總揮發性物質的16.17%。包括支鏈醇、芳香醇、二醇、烯醇等，其來源主要與脂類物質的氧化降解及熏制所用木材種類有關。醇類化合物含量比較多的是4-萜烯醇，占總揮發性成分的6.11%，其呈暖的胡椒香、較淡的泥土香及木材氣息。

表4 熏馬腸同時蒸餾樣品的揮發性組分GC-MS分析結果Table4 The result of GC-MS of identified flavor compounds of smoked horsemeat

續表

烯烴和烷烴分別占揮發性總成分的6.25%和6.97%。烴類化合物主要來源于組織脂肪酶對脂肪的水解，生成游離脂肪酸。游離脂肪酸進一步氧化降解，生成大量烴類、烯烴類物質。熏馬腸風味物質中的脂肪烴類物質所占的比例較大，但由于其呈味閾值較高，一般認為此類物質對肉制品的風味貢獻不大［12］。芳香烴類物質、烯烴類則有一定風味貢獻，如檢出的萜品烯具有柑橘香味，α-蒎烯有松木、針葉及樹脂樣的氣息等。

含氮含硫及雜環化合物占3.78%，主要是由于熏馬腸為自然發酵型肉制品，加工過程中由于細菌和酶的作用，使蛋白質分解產生氨以及胺類等堿性含氮物質［13-14］。少量的多環芳烴主要來源于煙熏過程中木材的不完全燃燒并在熏馬腸表面沉積的物質。

熏馬腸是通過自然發酵并熏制而成的肉制品，其揮發性風味物質的形成受熏制木材種類、熏制工藝的影響較大［2］。此次檢測出的含量較高的酚類物質及烯烴類物質的種類均與熏制木材有一定相關性。同時，SDE法萃取的揮發性風味物質主要為低揮發性、高沸點的成分，在萃取過程中樣品經過長時間高溫蒸煮，使部分結構不穩定的物質不能被檢出，經分析得出的風味物質種類僅為55種。因此結合頂空固相微萃取法（HS-SPME）可進一步對熏馬腸揮發性風味物質進行全面分析。

3 結論

同時蒸餾萃取法（SDE）將蒸餾與萃取同時進行，操作簡便、高效，對熏馬腸中揮發性風味物質的提取效果較好。實驗結果表明：料液比對熏馬腸特征風味物質提取的影響最顯著，二氯甲烷用量影響最小。確定最優提取條件為：提取時間156 min，溶劑用量50 mL，料液比1∶2.4，得到提取量為875.63 mg/kg，通過氣相色譜-質譜聯用法對熏馬腸中揮發性風味物質進行分析和鑒定，共分析得55種化合物，占提取總含量的52.66%的酚類物質含量較高，為熏馬腸主要的風味物質。

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Optimization of SDE extraction conditions for the flavor compounds in smoked horsemeat by response surface analysis

GAO Lei，CHEN Kai，ZHOU Jian-zhong，KONG Ling-ming，LI Rong，YANG Hai-yan*
（College of Food Science and Pharmaceutics，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，Chian）

The flavor compounds in smoked horsemeat were extracted by simultaneous distillation extraction （SDE），the extraction technology was optimized by Box-Behnken central design on the basis of single factor experiment.The results showed that when dichloromethane was used as extraction solvent，the optimal extraction conditions as follows：extraction time 156 min，volume of solvent 50 mL，material-liquid ratio 1∶2.4，using the optimal conditions，the extracting yield of flavor compounds in smoked horsemeat was 875.63 mg/kg.The gas chromatography-mass spectrometer（GC-MS）analysis showed that total 55 volatile flavor compounds were identified in smoked horsemeat，including phenols，alcohols，alkenes，alkanes，and lipid，aldehydes and ketones，and N-，S-containing and heterocyclic compounds.The major flavor compound in smoked horsemeat was phenols，the content of which was 52.66%.

smoked horsemeat；SDE/GC-MS；flavor compounds；response surface methodology

TS201.1

A

1002-0306（2016）06-0052-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.002

2015-05-06

高蕾（1980-），女，碩士，講師，研究方向：農產品加工及綜合利用，E-mail：lei_gao17@163.com。

楊海燕（1962-），女，博士，教授，主要從事農產品加工及綜合利用方面的研究，E-mail：yanghaiyan163@163.com。

新疆農業大學校前期資助課題（XJAU201207）；自治區重大專項子課題［201130101-4（2）］。