體外模擬消化過程中大豆蛋白的熒光光譜分析及熱處理的影響

王 瑞，李 楊，王中江，隋曉楠，齊寶坤，韓飛飛，畢 爽，江連洲，2，*（.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱50030；2.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江哈爾濱50030）

體外模擬消化過程中大豆蛋白的熒光光譜分析及熱處理的影響

王 瑞1，李 楊1，王中江1，隋曉楠1，齊寶坤1，韓飛飛1，畢 爽1，江連洲1，2，*
（1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030；2.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江哈爾濱150030）

分析了不同溫度熱處理及不同時間熱處理的大豆分離蛋白體外模擬消化過程產物的熒光光譜。結果表明：不同時間熱處理及不同溫度的熱處理均對大豆蛋白的消化有一定促進作用，大豆蛋白的最佳熱處理條件為85℃、20 min，蛋白質的消化程度最大。大豆分離蛋白經不同溫度熱處理后，消化1 h，消化產物的最大吸光波長（λmax）即隨著加熱溫度的上升而紅移，在加熱90℃時達到最大值后下降，而熒光強度呈現出先上升后下降的變化趨勢。經過不同時間熱處理后消化1 h，大豆分離蛋白消化產物的λmax先上升后下降。且熒光強度隨著加熱時間的延長呈現出不同的變化趨勢，在0～20 min不斷升高時，20 min時達到最大值，而繼續加熱至60 min，熒光強度逐漸下降。

大豆分離蛋白，熒光光譜，熱處理，體外模擬消化

熒光光譜用于檢測蛋白質的內源性熒光，主要是通過三種芳香族氨基酸的激發光譜、熒光發射光譜，以及熒光光譜的峰位、強度的變化［1］，對這些參數進行定量及定性測定分析，進而了解蛋白質的幾種重要的氨基酸殘基所處的微環境［2］。一般來說，天然蛋白質中能夠產生熒光的氨基酸殘基多分布于蛋白質分子的內部，因此這種氨基酸殘基的極性小于其外部環境的極性，同一種熒光基團所處環境的極性發生改變時，其最大吸收波長也會發生變化［3］。由此推斷蛋白質分子在各種環境中或者與各種分子作用之后的構象變化，從而了解大分子的結構與功能的關系［4］。

蛋白質對人體十分重要，各種食品中蛋白質含量是否豐富固然重要，但能否被人體利用或利用多少，是決定其營養價值的一個先決條件。大豆蛋白（soy proteins）作為一種重要的食物蛋白質，具有突出的營養價值和加工功能特性，廣泛地應用于食品工業。熱處理對大豆蛋白功能特性的影響一直是大豆蛋白研究領域的熱點之一。目前已有很多研究以大豆分離蛋白、大豆7S球蛋白和11S球蛋白為對象，探討熱處理過程中蛋白的結構變化及聚集行為［5-7］。在對大豆分離蛋白進行熱處理時，可以通過調整熱處理條件控制蛋白質的聚集程度，從而控制蛋白質的功能性質［8］。研究發現，大豆蛋白分子的內部結構較復雜，多肽鏈緊密折疊，疏水性的氨基酸在其內部形成疏水區域，外部親水外殼所包裹，且亞基彼此間結合又形成復雜的蛋白質的四級結構［9］。通過分子的高度壓縮等變性作用使蛋白酶的酶解作用具有很強的抗性［10］。因此，通過各種預處理手段改性蛋白質，使大豆蛋白高度壓縮、緊密的結構松散開，暴露出分子內部的酶作用位點，以利于蛋白酶的結合［11-12］。本研究采用發射熒光光譜（內部熒光光譜）技術研究加熱處理對體外模擬消化過程的大豆蛋白消化情況的影響，從色氨酸殘基微環境極性的變化角度，探討三級結構水平上蛋白質空間構象變化情況，并為食品加工領域生產易消化、高吸收、高利用的優質蛋白產品提供進一步理論指導和應用參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆 由東北農業大學大豆研究所提供；胃蛋白酶（活力3000 U/g） Novo公司；三硝基苯磺酸（TNBS）、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、正己烷、鹽酸等試劑 國產分析純試劑。。

PHSJ-4A型實驗室pH計 中國上海雷磁公司；錘片式粉碎機 中國天津泰斯特儀器有限公司；THZ-80水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇億通電子有限公司；CR22G高速冷凍離心機 日本日立公司；F-4500熒光分光光度計 日本HITACHI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆分離蛋白制備 參考Petruccelli and A?ón［13］的方法。原料大豆經去皮、粉碎過60目篩，然后，在40℃條件下采用正己烷萃取制備脫脂豆粕。將脫脂豆粕按1∶10的質量比與水混合，用2 mol/L NaOH調節pH至8.0，攪拌l.5 h后，將其懸浮液在4℃條件下10000×g離心30 min，取上清液用2 mol/L HCl調pH至4.5。靜置后在4℃條件下6000×g離心30 min，取蛋白沉淀水洗2次，最后取沉淀分散于水中并用2 mol/L NaOH調pH至7.0。在4℃條件下10000×g離心30 min，除去少量的不溶物，將其蛋白溶液冷凍干燥后粉碎即得粉末狀大豆分離蛋白。所有步驟均在室溫條件下進行。

1.2.2 大豆蛋白體外模擬消化工藝 將適量大豆分離蛋白分散于蒸餾水中配制成5%的大豆蛋白溶液，并取調配后樣品溶液100 mL，分別密封于加熱套管中在控溫水浴鍋中，首先進行70、80、85、90、100℃不同加熱溫度的熱處理，加熱15 min，然后，另取調配好的樣品溶液100 mL，樣品溶液置于85℃水浴條件，分別加熱10、20、30、60 min。樣品經熱處理完成后，迅速放入冰水浴降溫。

將上述經過不同加熱時間，不同加熱溫度熱處理的蛋白以及未處理的蛋白樣品溶液分別于37℃水浴保溫5 min，取胃蛋白酶（酶活力為3000 U/g，酶與底物的比為1∶100）加入人工模擬胃液緩沖液（35 mmol/L NaCl，84 mmol/L HCl，pH1.2）［14］，37℃水浴持續攪拌5 min，加入到大豆蛋白溶液中進行消化反應，反應過程中保持pH恒定。消化1 h后，調節消化液pH至7.0終止反應，冷凍干燥后在4℃條件下保存用于測定水解度（DH）及熒光光譜分析。

1.2.3 水解度的測定 水解度（DH）的測定采用三硝基苯磺酸法，參照Adler-Nissen［15］的方法，TNBS能與游離的氨基酸反應生成能在340 nm處有吸收峰的物質。反應是在弱堿性環境中，在酸性中終止。

水解度的計算：

式中：AN1指蛋白水解前氨基氮的含量，mg/g蛋白；AN2指蛋白水解后氨基氮的含量，mg/g蛋白；Npb指蛋白底物中肽鍵的氮含量，Npb對于大豆球蛋白來講為109.2 mg/g。

1.2.4 熒光光譜分析 采用熒光分光光度計測定大豆分離蛋白的內源性熒光光譜（色氨酸熒光光譜）。將大豆分離蛋白樣品用0.01 mol/L磷酸緩沖液（pH為7.0）配制成濃度為0.15 mg/mL的溶液。熒光發散光譜分析：以蛋白質分子內部的色氨酸熒光基團為探針，熒光光譜激發波長為290 nm，發散光譜掃描范圍為300～400 nm，激發狹縫和發射狹縫寬均為5 nm。

1.2.5 數據統計方法 用SAS 8.12進行相關分析和方差分析，如果方差分析效應顯著，使用Duncan multiple range test進行多重比較（p＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 熱處理大豆分離蛋白體外模擬消化DH曲線

圖1 不同熱處理溫度下大豆分離蛋白體外模擬消化的DH曲線Fig.1 DH curve of soy protein isolate in vitro digestion at different heat treatment temperature

從圖1可以看出，不同溫度15 min熱處理對大豆蛋白的消化有一定促進作用，從DH曲線來看，隨著熱處理溫度的不斷增高，DH曲線呈現先上升后下降的變化趨勢，在85℃時達到最大值。

圖2 不同熱處理時間大豆分離蛋白體外模擬消化的DH曲線Fig.2 DH curve of soy protein isolate in vitro digestion at different heat treatment time

而從圖2可知，85℃不同熱處理時間的DH曲線在熱處理20 min后，DH開始呈現下降的趨勢。這是由于熱處理可以使蛋白質變性，使整個蛋白的結構展開，一些深埋在蛋白質內部的側鏈可以暴露出來，提高表面疏水性和酶作用敏感性。但過度的加熱也會引起蛋白的聚集［16］，暴露出分子內部的酶作用位點被部分包埋，不利于蛋白酶的結合，DH出現下降的現象。上述研究結果可以得知經過熱處理后的大豆蛋白繼續體外模擬消化，蛋白質的DH即水解程度較未處理的原樣均有所提高，而在85℃、20 min熱處理的條件下，再進行體外模擬消化，大豆蛋白的DH最高，消化程度及效果最好。

2.2 不同加熱溫度的預處理對大豆蛋白體外模擬消化的特點及特性的影響

在295 nm激發的大豆分離蛋白樣品熒光發射光譜主要是由色氨酸（Trp）所發射的，和其他含色氨酸和酪氨酸（Tyr）殘基的球蛋白一樣，由于其分子中從酪氨酸殘基到色氨酸殘基之間發生了能量轉移，從而導致了酪氨酸殘基的熒光熄滅和色氨酸殘基的熒光增加［17］。分析其熒光強度的變化可能與大豆分離蛋白中Trp殘基的量子產率及Tyr→Trp能量傳遞有關［18］。當大豆分離蛋白的λmax分布在331.2～338.4 nm范圍內，有研究表明λmax與Trp殘基所處的微環境有關，λmax小于330 nm表示Trp殘基位于蛋白質分子內部的非極性環境中，λmax大于330 nm表明Trp殘基位于蛋白質分子外部的極性環境中［19］。

圖3所示為使用內源熒光掃描測定大豆蛋白經不同溫度15 min加熱預處理后，消化1 h所得產物的熒光光譜及最大吸收波長圖譜。由圖3可知，大豆分離蛋白在經過不同溫度的加熱預處理后消化1 h，λmax分布在345.17～348.67 nm范圍內，大豆分離蛋白消化產物的λmax即隨著加熱溫度的上升，不斷增長紅移，在加熱90℃時達到最大值后開始下降，而熒光強度隨著加熱時間的延長而呈現出先上升后下降的變化趨勢。

圖3 熱處理溫度對體外模擬消化過程中大豆分離蛋白熒光光譜的影響Fig.3 Effect of heat treatment temperature on Fluorescence spectrum of soy protein isolate in vitro digestion

當蛋白分子內部的發色基團暴露時，λmax會發生紅移而增大；當蛋白分子發生聚集，結構趨向緊密時，發色基團被包埋在分子內部，λmax發生藍移而變小［20］。通過實驗結果得知，大豆分離蛋白在經過不同溫度的加熱預處理后，消化1 h，大豆分離蛋白的熒光光譜形狀幾乎無變化（如圖3所示），而其λmax及熒光強度有改變。這可能是因為隨著加熱溫度的不斷增加，7S球蛋白及11S球蛋白變性。100℃熱處理后，11S球蛋白完全變性，在反應開始時，胃蛋白酶作用于球蛋白（11S）時，而胃蛋白酶對β-伴大豆球蛋白（7S）的作用較弱。在經過80℃加熱處理，β-伴大豆球蛋白（7S）已完全變性，酶作用位點又暴露出，有利于蛋白酶的結合，發色基團的暴露程度增大，λmax增長紅移，而在90～100℃持續加熱時，有研究指出當大豆11S球蛋白在100℃下熱處理時，大部分球蛋白分子快速形成可溶性聚集體［21］，導致部分蛋白質底物不易于與酶結合，蛋白質的消化程度降低，發色集團的暴露程度降低，導致λmax下降。而熒光強度的變化受λmax紅移的影響，分析原因與蛋白質疏水性集團的暴露有關。低溫加熱預處理對大豆蛋白的消化有一定的促進作用，疏水性集團的暴露程度增加，而在溫度85～100℃加熱處理后，蛋白質的變性程度加劇，暴露出來的分子內部的酶作用位點有部分又被包埋，消化程度有所降低，疏水性集團的暴露程度降低，且色氨酸殘基趨近于“包埋態”，熒光強度有所降低，并逐漸呈下降趨勢［22］。Yang等［23］研究指出，蛋白質的熒光猝滅與分子內芳香族氨基酸殘基附近的環境變化密切相關。色氨酸殘基熒光強度的變化暗示著由于空間結構變化，分子間疏水作用和由二硫鍵連接的聚集體增加，蛋白分子相互作用導致熒光猝滅［24］，致使熒光強度下降。

2.3 不同加熱時間的預處理對大豆蛋白體外模擬消化的特點及特性的影響

熒光光譜可以有效地用于測試蛋白質微環境體系的變化，在大豆蛋白中，兩種芳香族氨基酸會表現出熒光性，即酪氨酸和色氨酸［25］。因此大豆分離蛋白的熒光峰實際上是色氨酸殘基的熒光峰，其峰位在325～350 nm波長之間。

圖4 熱處理時間對體外模擬消化過程中大豆分離蛋白熒光光譜的影響Fig.4 Effect of heat treatment time on fluorescence spectrum of soy protein isolate in vitro digestion

圖4所示為使用內源熒光掃描測定大豆蛋白經在不同的時間85℃加熱預處理后，消化1 h所得產物的熒光光譜及最大吸收波長圖譜。從圖4可以看出，大豆分離蛋白在經過60 min的加熱預處理后消化1 h，λmax分布在345.16～346.67 nm范圍內，大豆分離蛋白消化產物的λmax經歷了先上升后下降的過程，即隨著加熱時間的延長，λmax不斷增長紅移，而在加熱處理20 min時，λmax出現了最小值，短暫的縮短藍移后繼續增長紅移。而熒光強度隨著加熱時間的延長，呈現出不同的變化趨勢，先升高，在20 min時達到最大值，繼續加熱，熒光強度呈下降趨勢。

這可能是由于反應開始時，蛋白質的熱變性導致酶作用位點暴露出，蛋白質的消化程度程度增大，蛋白分子內部的色氨酸、酪氨酸等發色基團暴露時，最大吸收波長λmax會發生紅移而增大［22］。當蛋白分子發生聚集，結構趨向緊密導致蛋白質消化程度降低，發色基團部分被包埋在分子內部，最大吸收波長λmax會發生藍移而變小。而在20 min左右蛋白質的消化產物的λmax及熒光強度出現了極端變化點，繼續加熱，發色集團在暴露的同時也伴隨著聚集的包埋，在這個動態變化過程中，加熱預處理60 min的大豆分離蛋白樣品的λmax有所縮短，但相對未處理原樣要高些，且呈下降趨勢。長時間加熱使得蛋白質發生過度熱變性，結構的遭到破壞，加熱產生的大量聚集體，導致暴露出分子內部的酶作用位點有部分又被包埋，消化程度有所減低，疏水性集團的暴露程度降低但相對未處理原樣要高些，色氨酸殘基趨近于“暴露態”的數量減少［22］，熒光強度有所降低，并逐漸呈下降趨勢，色氨酸殘基熒光強度的變化暗示著由于空間結構變化。

3 結論

不同時間熱處理及不同溫度的熱處理均對大豆蛋白的消化有一定促進作用，從消化效果即DH曲線來看，可以得出大豆蛋白的最佳熱處理溫度是85℃，在此溫度保溫20 min后再進行體外模擬消化，大豆蛋白的DH最高，消化程度及效果最好。

大豆分離蛋白在經過不同的加熱溫度預處理后，消化1 h，大豆分離蛋白的熒光光譜形狀幾乎無變化，而其λmax及熒光強度有改變。大豆分離蛋白在經過不同溫度的加熱預處理后消化1 h，λmax分布在345.17～348.67 nm范圍內；大豆分離蛋白消化產物的λmax即隨著加熱溫度的上升，不斷增長紅移；在加熱90℃時達到最大值后開始下降。而熒光強度隨著加熱時間的延長而呈現出先上升后下降的變化趨勢。

大豆分離蛋白在經過不同時間的加熱預處理后，消化1 h，大豆分離蛋白消化產物的λmax呈現先上升后下降的趨勢，即隨著加熱時間的延長，λmax不斷增長紅移，而在加熱處理20 min時，λmax出現了最小值，短暫的縮短藍移后繼續增長紅移。而熒光強度隨著加熱時間的延長而呈現出不同的變化趨勢，0～20 min內不斷增加，在20 min時達到最大值，繼續加熱至60 min，熒光強度呈下降趨勢。

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Fluorescence spectra analysis of soybean protein in vitro under heat treatment

WANG Rui1，LI Yang1，WANG Zhong-jiang1，SUI Xiao-nan1，QI Bao-kun1，HAN Fei-fei1，BI Shuang1，JIANG Lian-zhou1，2，*
（1.Food College，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.National Soybean Engineering Technology Research Center，Harbin 150030，China）

The characters of fluorescence spectra of soy protein isolate（SPI）solution in vitro of different heat treatment temperature and different heat treatment time.The results showed that heat treatment had a certain effect on the digestion of soybean protein at different heat treatment temperature and different heat treatment time.The best heat treatment condition of soybean protein was 85℃，20 min，which was the best degree and effectiveness of the vitro digestion.The soy protein isolate was heat-treated at different temperatures，digested 1 h.With the rise of heating temperature，digested products of λmaxincreasing redshift，then it started to decrease when the maximum value was reached at 90℃.And the fluorescence intensity increased with the heating time，and showed a trend of decline after the first rise.The in vitro simulated digestion of soybean protein isolate 1 h at different heating time，the isolated soy protein digested products of λmaxexperienced a process，which was first increased，then decreased.And the fluorescence intensity with the increase of heating time and showed different trends.Growing within 0～20 min，reaching maximum at 20 min，continuing to heat up to 60 min，the fluorescence intensity decreased.

soybean protein isolated；fluorescence spectrum；heat treatment；in vitro digestion

TS214.2

A

1002-0306（2016）06-0128-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.017

2015－07－06

王瑞（1990-），女，碩士研究生，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程，E-mail：wrname@163.com。

江連洲（1960-），男，博士，教授，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程，E-mail：jlzname@yeah.net。

黑龍江省自然科學基金項目重點項目（ZD201302）；黑龍江博士后科研啟動金（LBH-Q13018）；黑龍江省青年科學基金（QC2013C014）；黑龍江省教育廳科學技術研究項目面上項目（12531049）。