一種蛹蟲草多糖的結構特征及體外抗氧化活性

陳小麗，巫光宏，黃卓烈（.廣東海洋大學水產學院，廣東湛江54088；.華南農業大學生命科學學院，廣東廣州5064）

一種蛹蟲草多糖的結構特征及體外抗氧化活性

陳小麗1，巫光宏2，黃卓烈2
（1.廣東海洋大學水產學院，廣東湛江524088；2.華南農業大學生命科學學院，廣東廣州510642）

采用分子篩層析法從人工培養蛹蟲草子實體中分離純化得到一種多糖W-CBP80Ⅰ，進而分別采用凝膠滲透色譜（GPC）、氣-質聯用（GC-MS）、紅外光譜（IR）、核磁共振（1H NMR和13C NMR）研究其理化性質和結構特征。結果表明：W-CBP80Ⅰ含有α-糖苷鍵，并主要由甘露糖、半乳糖和葡萄糖組成。它主要成分為低分子量多糖，分子量為8.93×103。此外，W-CBP80Ⅰ具有體外清除DPPH，羥基和超氧陰離子自由基活性。

蛹蟲草，多糖，結構特征，抗氧化

越來越多的研究發現，包括癌癥、血管疾病、糖尿病和神經退行性疾病等在內的人類許多疾病具有一個共同特征，即：源自機體的自由基及其他活性氧的異常產生和/或清除［1-2］。因此，基于保健和預防疾病的目的，尋找天然抗氧化物質并開發為功能食品和藥物顯得尤為重要。目前已有許多研究發現不同來源的多糖能夠有效清除自由基［3-4］。

蛹蟲草（Cordyceps militaris）被認為是名貴的冬蟲夏草（C.sinensis）的重要替代品，這主要是由于兩者多糖具有高度相似性，且前者人工培養較為成功［5］。蛹蟲草多糖是其主要活性成分之一，具有多種功效，包括抗氧化［6］、免疫調節［7-8］、降血糖［9］、抗腫瘤［7］、抗血管生成［10］以及抗炎活性［11］等。多糖的理化性質及結構分析主要包括：溶解度、比旋光度、粘度、相對分子量、空間構象、單糖組成、構效關系等［4，12］。由于結構極其復雜，加上現階段分析手段有限，因而多糖結構的研究多不完善，仍有待繼續深入探索。

盡管多糖結構鑒定有一定難度，但是對于構效關系研究卻是必需的。一般采用氣相色譜分析單糖組成及比例，半乳糖苷酶解、1H-NMR及IR分析糖苷鍵構型，完全甲基化與GC及GC-MS、經高碘酸氧化和Smith降解分析多糖分枝情況等［12］。

本研究中探討一種蛹蟲草水溶性多糖W-CBP80Ⅰ是否具有體外抗氧化活性，并描述其結構特征，以期進一步揭示其結構、性質與功能的關系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛹蟲草C19子實體 深圳澎源生物技術有限公司提供；甲硫氨酸、氯化硝基四氮唑藍、核黃素和1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH） 購自Sigma公司，均為分析純試劑；Sephadex G-100 GE公司產品；Sephadex G-200 上海索萊寶生物科技有限公司產品；Dextran系列標準品 色譜純，分子量為738～8.35×105，共9種，Fluka公司產品。

RE52-2旋轉蒸發器、CXG-1電腦恒溫層析柜 海滬西分析儀器廠有限公司；Nicolet Magna 760型傅立葉變換紅外光譜儀 美國尼高力公司；Agilent 1100高效液相色譜儀、Agilent 6890GC/5973MS氣相色譜/質譜聯用儀 美國安捷倫公司；Bruker AVANCE III 500M NMR型超導核磁共振譜儀 瑞士Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖的分離純化 按照Chen X L［13］方法進行提取及分離純化，即采用終濃度50%的乙醇提取出多糖后，再將剩余溶液加乙醇至終濃度為80%，得80%醇析粗多糖（W-CBP80）。W-CBP80以0.4 mL/ min流速經Sephadex G-100分子篩層析進一步純化，采用硫酸-苯酚法檢測總糖含量。收集主峰部分即為W-CBP80Ⅰ，冷凍干燥備用。

1.2.2 多糖純度檢測、分子量及單糖組成分析 多糖純度采用Sephadex G-200柱層析（2.6 cm×40 cm，蒸餾水平衡和洗脫，流速為0.4 mL/min）和凝膠滲透色譜（GPC）檢測。分子量和單糖組成根據Chen X L［13］分別采用GPC、GC-MS（DB-1石英毛細管柱，15 m×0.2 mm，0.33 μm）法分析。GPC采用0.05 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH=6.7，加0.05%NaN3）為流動相，流速0.8 mL/min，進樣量為20 μL。將9種不同分子量的多糖標樣按黃曉蘭［14］方法建立普適校正曲線，多糖樣品在同樣條件下測定，計算分子量。GC-MS色譜條件按文獻設置［13］，采用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖、核糖作為標準單糖，分析W-CBP80Ⅰ的單糖組成。

1.2.3 W-CBP80Ⅰ的IR和NMR光譜1H NMR和13C NMR的檢測：適量的W-CBP80Ⅰ加約0.6 mL氘代溶劑，按標準程序采集數據。檢測溫度采樣次數（掃描次數，NS）32，1H共振頻率500 MHz，溫度（T）293.7 K；13C共振頻率125 MHz，溫度（T）294.7 K。IR光譜采用KBr壓片法分析。

1.2.4 多糖體外清除自由基作用 多糖對DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的清除作用分別采用3.0 mL的DPPH乙醇體系、3.0 mL的Fenton體系以及4.0 mL的甲硫氨酸-氯化硝基四氮唑藍-核黃素體系進行［13］。DPPH實驗中，1.5 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液與1.5 mL不同濃度的W-CBP80或W-CBP80Ⅰ充分混合，以只含蒸餾水和DPPH的溶液體系為對照，分別以試劑空白液作為空白對照，25℃水浴30 min，測517 nm吸光值。羥自由基清除采用固定反應時間法，在相同體積的反應體系中加入一系列不同濃度的W-CBP80、W-CBP80Ⅰ，補加蒸餾水至3 mL，混勻，37℃水浴保溫30 min，以只含蒸餾水和反應試劑的體系為對照，測定510 nm吸光值。超氧陰離子清除實驗中，在反應體系中加入梯度用量的W-CBP80Ⅰ，用50 mmol/L PBS（pH7.8）補足至4 mL，以不加多糖的反應液作對照，經6500 K標準光光照30 min，測定560 nm吸光值。清除活性計算公式為：清除率（%）=［（Ac-As）/Ac］×100，其中Ac和As分別為對照和多糖處理組的吸光值。采用SPSS16.0計算IC50。

2 結果與討論

2.1 W-CBP80Ⅰ的分離純化

采用Sephadex G-100柱層析純化后得到一個多糖峰，收集主峰部分即為W-CBP80Ⅰ（圖1）。WCBP80Ⅰ經Sephadex G-200柱層析，只有一個多糖峰，且峰形窄、分布對稱，蛋白含量低，表明純度較高（圖2）。它在GPC圖譜中出現三個峰（圖3），相對含量分別為1.35%、1.93%和96.73%，表明其主要含低分子量多糖，同時有少量高分子量和中分子量多糖。

圖1 W-CBP80的Sephadex G-100柱層析圖Fig.1 Elution profile of W-CBP80 in Sephadex G-100 column chromatograph

圖2 W-CBP80Ⅰ的Sephadex G-200柱層析圖Fig.2 Elution profile of W-CBP80Ⅰin Sephadex G-200 column chromatography

圖3 W-CBP80Ⅰ的GPC圖譜Fig.3 GPC profile of W-CBP80Ⅰ

2.2 W-CBP80Ⅰ單糖組成及分子量

GC-MS結果表明（表1），W-CBP80Ⅰ的單糖成分主要為甘露糖、半乳糖和葡萄糖，含量分別為31.18%、29.58%、28.80%。同時含有少量的阿拉伯糖（5.90%）、鼠李糖（1.79%）、木糖（1.76%）以及核糖（1.00%）。盡管單糖組成與W-CBP50Ⅱ相似［13］，但是每種單糖含量有很大區別。GPC結果見表2，表明W-CBP80Ⅰ主要由小分子量多糖組成，分子量為8.93×103，這與已研究的一種水提多糖W-CBP50Ⅱ的分子量相近［13］。

表1 W-CBP80Ⅰ組成單糖的GC-MS分析結果Table1 Results of the monosaccharide composition of W-CBP80Ⅰdetermination with GC-MS

2.3 W-CBP80Ⅰ的結構特征

W-CBP80Ⅰ的結構特征采用紅外光譜（IR）和核磁共振NMR進行分析。W-CBP80Ⅰ的IR結果見圖4，顯示：樣品在4000～400 cm-1區具有多糖類物質的一般特征。其紅外光譜與W-CBP50Ⅱ的紅外光譜相似，只是少量吸收峰強度和峰位有小范圍變化。羥基的伸縮振動吸收峰3422 cm-1附近，峰強度低于W-CBP50Ⅱ；2888 cm-1附近的吸收峰是C-H的伸縮振動峰，是糖類的特征吸收峰；1413 cm-1附近的吸收峰是C-O的伸縮振動或者C-H及O-H的彎曲振動；1060 cm-1和1112 cm-1為吡喃糖環的醚鍵（C-O-C）的C-O伸縮振動，是吡喃糖環羥基的變角振動吸收峰，說明其中的單糖以吡喃糖苷的形式存在。在842 cm-1處的吸收峰是α型端基差向異構體的C-H變角振動引起，表明α-構象環的存在［15-16］。在1655 cm-1附近的峰是C=O伸縮振動峰。

圖4 W-CBP80Ⅰ的紅外圖譜Fig.4 IR spectrum of W-CBP80Ⅰ

由圖5可知，W-CBP80Ⅰ1H NMR譜中有兩個異頭質子信號5.122、5.115 ppm，表明其含有α型糖苷鍵。4.688 ppm的強信號是溶劑共振峰或β型糖苷鍵的信號［12，17］，因此W-CBP80Ⅰ可能既有α糖苷鍵，又有β糖苷鍵。

圖5 W-CBP80Ⅰ的1H NMR圖譜Fig.51H NMR spectra of W-CBP80Ⅰ

由圖6可知，W-CBP80Ⅰ的13C NMR譜有96.441 和92.256 ppm兩個異頭碳信號，表明其含有α糖苷鍵［12］，這與1H NMR譜結果以及IR中842 cm-1出現吸收峰結果吻合［18］。據此推斷W-CBP80Ⅰ中主要含有α糖苷鍵。但是，其他四種單糖信號未得到，可能是由于它們含量很低的原因。

圖6 W-CBP80Ⅰ的13C NMR圖譜Fig.613C NMR spectra of W-CBP80Ⅰ

國內外研究者已從蛹蟲草中分離得到幾種具有抗氧化活性的多糖［6-7］，包括P70-1［19］、CPS-1［11］、CM-jd-CPS2和CM-jd（Y）-CPS2［20］。W-CBP80Ⅰ與它們在單糖組成、糖苷鍵及分子量方面存在較大區別。CM-jd-CPS2和CM-jd（Y）-CPS2均主要含甘露糖、葡萄糖和半乳糖［20］，但三者含量差異大，有別于W-CBP80Ⅰ的情況。W-CBP80Ⅰ含有少量阿拉伯糖和核糖，而CPS-1［11］、P70-1［19］、CM-jd-CPS2和CM-jd（Y）-CPS2［20］中不含此兩種單糖。CPS-1和P70-1都含有β糖苷鍵，它們的IR譜中分別在890、893 cm-1出現吸收峰［11，19］，而W-CBP80Ⅰ的IR譜中842 cm-1的吸收峰表明其主要含α糖苷鍵，它的1H NMR和13C NMR也支持此結論。

表2 W-CBP80Ⅰ分子量測定結果Table2 Result of molecular weight of W-CBP80Ⅰ

另外，盡管W-CBP80Ⅰ與此前報道的W-CBP50Ⅱ［13］在分子量上具有相似性，但二者在單糖含量、IR吸收特征及1H NMR譜信號方面有諸多不同。鑒于二者分子量相近，暗示前者可能含有更多分支［21］。

2.4 自由基清除活性

DPPH法已成為體外研究天然產物抗氧化活性廣泛使用的方法。目前普遍認為的機理是：抗氧化物質清除DPPH自由基是由于它們的氫貢獻能力。超氧陰離子是機體中產生的第一種自由基，氧化性較弱。它能夠通過歧化反應產生包括羥自由基在內的較強的活性氧種類。而羥自由基是機體中最活躍的活性氧，能夠造成多種損傷［16，22］。

由圖7和圖8可知，W-CBP80和W-CBP80Ⅰ都具有自由基清除活性，且具有劑量依賴性。W-CBP80能夠清除DPPH·和羥自由基：0.366 mg/mL的W-CBP 80對DPPH·的清除率為84.18%，IC50為0.106 mg/mL；0.575 mg/mL的W-CBP80對羥自由基的清除率為34.23%（圖7）。W-CBP80Ⅰ能夠清除DPPH·、羥自由基和超氧陰離子自由基：0.243 mg/mL的W-CBP80Ⅰ對DPPH自由基的清除率為89.14%，IC50為0.103 mg/mL；0.596 mg/mL的W-CBP80Ⅰ對羥自由基的清除率為44.69%；0.177 mg/mL的W-CBP80Ⅰ對超氧陰離子自由基的清除率為50.40%（圖8）。由此可見，W-CBP80Ⅰ對羥自由基清除活性強于W-CBP80，而二者對DPPH清除能力相當。W-CBP80Ⅰ對三種自由基清除順序為：DPPH自由基＞超氧陰離子自由基＞羥自由基，這與之前報道的多糖W-CBP50Ⅰ的活性一致［13］。

圖7 W-CBP80對DPPH和羥自由基清除活性Fig.7 Scavenging effect of W-CBP80 on DPPH and hydroxyl radical

圖8 W-CBP80Ⅰ對DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的清除活性Fig.8 Scavenging effect of W-CBP80Ⅰon DPPH，hydroxyl and superoxide radical

粗多糖W-CB80和純化的多糖W-CBP80Ⅰ對DPPH的清除活性均強于羥自由基清除活性，這與W-CBP50Ⅱ的活性一致。然而，二者對羥自由基的清除活性比P70-1和CMP-1的都弱［19，23］。此外，盡管有許多抗氧化的文獻報道，機理卻并不清楚。清除DPPH和羥自由基的可能機理是，多糖W-CBP80和W-CBP80Ⅰ中的羥基能夠提供氫原子給DPPH和羥自由基，從而將它們轉變成非自由基產物或對機體無毒的產物，終止自由基介導的反應［18］。多糖超氧陰離子自由基的清除機理仍未充分了解。它可能與酚類化合物對超氧陰離子自由基的清除機理相似，即還原活性對清除自由基起作用，且可能與酚羥基數量有關［24］。

3 結論

采用乙醇分級沉淀結合分子篩層析法從蛹蟲草中分離多糖W-CBP80Ⅰ。W-CBP80Ⅰ多糖經Sephadex G-200和GPC鑒定純度較高，主要含分子量較小的多糖（96.73%），分子量為8.93×103，含少量大分子（1.35%）和中分子多糖（1.93%）。W-CBP80Ⅰ的單糖組分主要為葡萄糖（28.80%）、甘露糖（31.18%）和半乳糖（29.58%），少量阿拉伯糖（5.90%），微量的核糖（1.00%）、鼠李糖（1.79%）及木糖（1.76%）。W-CBP80Ⅰ中的單糖主要以α型異頭結構體的環形結構存在，也可能有β型，糖苷鍵為α型。W-CBP80和W-CBP80Ⅰ都具有體外自由基清除活性：W-CBP80清除DPPH自由基的IC50為0.106 mg/mL；0.575 mg/mL的W-CBP80對羥自由基的清除率為34.23%。W-CBP80Ⅰ清除DPPH的IC50為0.103 mg/mL；0.596 mg/mL的W-CBP80Ⅰ對羥自由基的清除率為44.69%；0.177 mg/mL的WCBP80Ⅰ對超氧陰離子的清除率為50.40%，顯示出其具有作為抗氧化劑在功能食品中應用的潛力。

［1］Domann F E.Aberrant Free Radical Biology is a Unifying Theme in the Etiology and Pathogenesis of Major Human Diseases ［J］.International Journal of Molecular Sciences，2013，14（4）：8491-8495.

［2］Gutowski M，Kowalczyk S.A study of free radical chemistry：their role and pathophysiological significance［J］.Acta Biochim Pol，2013，60（1）：1-16.

［3］Stachowiak B，Regula J.Health-promoting potential of edible macromycetes under special consideration of polysaccharides：a review［J］.Eur Food Res Technol，2012，234（3）：369-380.

［4］Hu D J，Cheong K L，Zhao J，et al.Chromatography in characterization of polysaccharides from medicinal plants and fungi［J］.Journal of Separation Science，2013，36（1SI）：1-19.

［5］Wu D，Xie J，Wang L，et al.Characterization of bioactive polysaccharides from Cordyceps militaris produced in China using saccharide mapping［J］.Journal of Functional Foods，2014，9：315-323.

［6］Chen R，Jin C，Li H，et al.Ultrahigh pressure extraction of polysaccharides from Cordyceps militaris and evaluation of antioxidant activity［J］.Sep Purif Technol，2014，134：90-99.

［7］Jing Y S，Cui X L，Chen Z Y，et al.Elucidation and biological activities of a new polysaccharide from cultured Cordyceps militaris［J］.Carbohyd Polym，2014，102：288-296.

［8］Zhu L，Tang Q，Zhou S，et al.Isolation and Purification of a Polysaccharide from the Caterpillar Medicinal Mushroom Cordyceps militaris（Ascomycetes） FruitBodies and Its Immunomodulation of RAW 264.7 Macrophages［J］.International Journal of Medicinal Mushrooms，2014，16（3）：247-257.

［9］Li S P，Zhang G H，Zeng Q，et al.Hypoglycemic activity of polysaccharide，with antioxidation，isolated from cultured Cordyceps mycelia［J］.Phytomedicine，2006，13（6）：428-433.

［10］Zeng Y，Han Z，Qiu P，et al.Salinity-induced anti-angiogenesis activities and structural changes of the polysaccharides from cultured cordyceps militaris.［J］.PLOS ONE，2014，9（9）：e103880.

［11］Yu R，Song L，Zhao Y，et al.Isolation and biological properties of polysaccharide CPS-1 from cultured Cordyceps militaris［J］.Fitoterapia，2004，75（5）：465-472.

［12］張惟杰.糖復合物生化研究技術［M］.第二版.杭州：浙江大學出版社，1999.

［13］Chen X L，Wu G H，Huang Z L.Structural analysis and antioxidant activities of polysaccharides from cultured Cordyceps militaris［J］.Int J Biol Macromol，2013，58：18-22.

［14］黃曉蘭，吳惠勤，黃芳，等.破壁與不破壁靈芝孢子粉多糖的分析［J］.中草藥，2006，37（6）：813-816.

［15］Ding X，Hou Y，Hou W.Structure elucidation and antioxidant activity of a novel polysaccharide isolated from Boletus speciosus Forst［J］.Int J Biol Macromol，2012，50（3）：613-618.

［16］Yao L，Zhao Q，Xiao J，et al.Composition and antioxidant activity ofthe polysaccharides from cultivated Saussurea involucrata［J］.Int J Biol Macromol，2012，50（3）：849-853.

［17］Bock K，Pedersen C，Pedersen H.Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Data for Oligosaccharides［M］.Academic Press，1984.

［18］Niu Y，Yan W，Lv J，et al.Characterization of a Novel Polysaccharide from Tetraploid Gynostemma pentaphyllum Makino ［J］.J Agr Food Chem，2013，61（20）：4882-4889.

［19］Yu R M，Yang W，Song L Y，et al.Structural characterization and antioxidant activity of a polysaccharide from the fruiting bodies of cultured Cordyceps militaris［J］.Carbohyd Polym，2007，70（4）：430-436.

［20］Wu F Y，Yan H，Ma X N，et al.Comparison of the structural characterization and biological activity of acidic polysaccharides from Cordyceps militaris cultured with different media［J］.World J Microb Biot，2012，28（5）：2029-2038.

［21］Cheng H N，Neiss T G.Solution NMR Spectroscopy of Food Polysaccharides［J］.Polymer Reviews，2012，52（2）：81-114.

［22］Zhou C，Yu X，Zhang Y，et al.Ultrasonic degradation，purification and analysis of structure and antioxidant activity of polysaccharide from Porphyra yezoensis Udea［J］.Carbohyd Polym，2012，87（3）：2046-2051.

［23］Jing Y，Cui X，Chen Z，et al.Elucidation and biological activities of a new polysaccharide from cultured Cordyceps militaris［J］.Carbohyd Polym，2014，102：288-296.

［24］Liu F，Ooi V E C，Chang S T.Free radical scavenging activities of mushroom polysaccharide extracts［J］.Life Sci，1997，60（10）：763-771.

Structural characterization of a polysaccharide from cultured Cordyceps militaris with antioxidant activity

CHEN Xiao-li1，WU Guang-hong2，HUANG Zhuo-lie2
（1.Fisheries College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China；2.College of Life Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

A polysaccharide W-CBP80Ⅰ was isolated from the fruiting bodies of cultured Cordyceps militaris and characterized using GPC，GC-MS，IR，1H NMR and13C NMR.The results indicated that it contained α-type glycosidic linkages and was mainly composed of α-mannose，α-galactose and α-glucose.Its main component was low molecular weight polysaccharide with Mwof 8.93×103.In addition，W-CBP80Ⅰ exhibited scavenging capacities against DPPH，hydroxyl and superoxide radicals in the antioxidant assay in vitro.

Cordyceps militaris；polysaccharide；structure characterization；antioxidation

TS201.1

A

1002-0306（2016）06-0155-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.023

2015-08-24

陳小麗（1978-），女，博士，研究方向：多糖生物化學，E-mail：lilychen77@163.com。