魚肉蛋白肽在模擬胃腸消化吸收過程中的抗氧化活性和生物利用度

霍艷姣，王 波，郭珊珊，李 博，*，羅永康（.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京00083；.濱州萬嘉生物科技有限公司，山東濱州56600）

魚肉蛋白肽在模擬胃腸消化吸收過程中的抗氧化活性和生物利用度

霍艷姣1，王 波1，郭珊珊2，李 博1，*，羅永康1
（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083；2.濱州萬嘉生物科技有限公司，山東濱州256600）

以鱈魚魚肉蛋白肽為研究對象，構建體外胃腸消化模型和Caco-2細胞吸收模型，模擬連續的胃腸消化、吸收過程，測定抗氧化活性和生物利用度。結果顯示：在模擬胃腸消化過程中，魚肉蛋白肽的水溶性維生素E抗氧化能力（TEAC）變化不顯著（p＞0.05），DPPH自由基清除率在胃消化階段下降而在腸消化階段升高（p＜0.05），但低于消化前的水平（p＜0.05）。在模擬轉運2 h過程中，魚肉蛋白肽吸收產物的肽氮含量逐漸增加，TEAC和氧自由基抗氧化能力（ORAC）顯著升高（p＜0.05）。魚肉蛋白肽的生物利用度顯著高于魚肉（9.1%），且分子量最小的蛋白肽的生物利用度最高（46.2%）。魚肉蛋白肽經胃腸消化吸收后，具有一定的抗氧化活性且生物利用度較高，為鱈魚蛋白肽的開發利用提供了理論依據。

胃腸消化，Caco-2細胞模型，抗氧化活性，生物利用度

鱈魚屬于海洋深水魚，是底層冷水性群聚魚類，主要產于我國的渤海、黃海和東海北部。鱈魚肉質厚實、脂肪含量低、蛋白含量高、鮮味十足、細刺很少，氨基酸比例與人體所需氨基酸比例很接近［1］，具有很高的營養價值和經濟價值。

已有研究證實，鱈魚蛋白中存在著潛在的生物活性肽段［2］，其營養價值和功能特性明顯高于蛋白質或游離氨基酸［3］。活性肽經口服攝入，可能會受胃腸道內多種蛋白酶、肽酶的作用而發生降解，生物活性改變，生物利用度降低［4-5］。通過體外模擬胃腸消化、吸收過程，可以初步研究肽在胃腸環境下的生物活性和生物利用度。體外模擬消化技術，需要根據實際生理參數設定模擬條件［6］，常用的消化模型包括胃蛋白酶和胰酶的水解作用。Caco-2細胞具有與人體小腸上皮細胞相同的酶系統，并且細胞極性、緊密連接性和轉運系統相一致［7］，廣泛作為腸吸收模型。

鱈魚魚皮［8］、魚骨［9］、魚肉［10］等蛋白酶解物表現出較好抗氧化活性，并分離鑒定出一個具有抗氧化活性和ACE抑制活性的肽序列（Leu-Leu-Met-Leu-Asp-Asn-Asp-Leu-Pro-Pro）［11］。最近，Sabeena Farvin等［12］采用脂質評價體系研究了鱈魚蛋白肽的體外抗氧化活性。但是目前，關于鱈魚源活性肽經胃腸消化后的生物活性和生物利用度的研究還很少，未能真實地反映出活性肽的利用價值。本實驗采用體外胃腸消化、吸收模型，研究鱈魚魚肉蛋白肽在胃腸消化、吸收過程中的抗氧化活性和生物利用度，并與魚肉對比，初步評估這些肽的實際利用價值，可為鱈魚魚肉蛋白肽的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鱈魚魚肉粉（R）和魚肉蛋白肽粉（H、F1、F2） 均由山東省濱州萬嘉生物科技有限公司提供，鱈魚魚肉經清洗、絞碎、凍干所得魚肉粉R，R經動物復合酶酶解制備得到蛋白肽粉H，蛋白肽粉H經3000 u濾膜超濾分離得到分子量不同的肽組分F1（截留組分）和F2（濾過組分）；胰酶（P1750，250NF U/mg） 美國AMRESCO公司；胃蛋白酶（P7000）、2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、水溶性維生素E（Trolox）、熒光素鈉、還原性谷胱甘肽、1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH） 美國Sigma-Aldrich公司；偶氮二異丁脒鹽酸鹽（AAPH） 上海源葉生物科技有限公司；十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、過硫酸鉀、鹽酸等其他試劑 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；Transwell 6孔板（Nunc，孔徑0.4 μm，面積4.2 cm2） 北京康碧泉生物科技有限公司；DMEM（HyClone，SH30022.01B） 賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司；ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，安捷倫） 北京五洲東方科技發展有限公司；合成肽MPFPK（618.32 u）、KNQDKTEIPT（1173u）、LEQQVDDLEGSLEQEK （1859 u）、NLQQEISDLTEQLGETGK（2003 u） 上海強耀生物科技有限公司。

HZS-HA恒溫水浴振蕩器 黑龍江省哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；722S可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；Infinite 200Pro多功能酶標儀 瑞士帝肯（Tecan）公司；LGJ-18冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠；UD1000A酶標儀 北京聯眾泰科科技有限公司；LC-15C高效液相色譜 島津國際貿易（上海）有限公司；BBD6220 CO2的培養箱 美國熱電公司；Millicell-ERS跨膜電阻儀 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 氨基酸組成分析 采用HPLC-異硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生法對魚肉蛋白肽粉（H、F1、F2）和魚肉粉R進行氨基酸組成分析的測定［13］。樣品的處理和洗脫條件參考謝寧寧［14］實驗方法。以氨基酸標品洗脫得到的圖譜為標準圖譜，從而對樣品的氨基酸進行定性和定量。

1.2.2 體外模擬胃腸消化 參照王嬋［15］模擬胃腸消化的方法。樣品R、H、F1和F2先進行胃消化，其產物分別記作R-G、H-G、F1-G和F2-G；而后進入腸消化階段，其產物分別記作R-GI、H-GI、F1-GI和F2-GI。

在胃腸消化過程中，每0.5 h取2 mL消化液，置于沸水浴中滅酶15 min，冷卻室溫，并將pH調至7.0，于-4℃保存，用于測定抗氧化活性。

1.2.3 分子量分布的測定 魚肉粉R采用SDS-PAGE凝膠電泳測定其蛋白的分子量［16］。根據溶解性的差異分離提取水溶性蛋白、鹽溶性蛋白和肌基質蛋白。肌基質蛋白不溶鹽或堿溶液，因此本實驗只測定水溶性蛋白和鹽溶性蛋白的分子量。

魚肉蛋白肽樣品H、F1、F2與其對應胃腸消化產物H-GI、F1-GI、F2-GI的分子量測定采用HPLC法［13］。采用的分析柱為TSK gel G2000 SWXL（7.8 mm×300 mm）。以標準品（合成肽）洗脫時間對分子量的對數值作圖得到標準曲線y=-0.1881x+6.5867（R2=0.9954，y：log MW，x：洗脫時間）。

1.2.4 Caco-2細胞模型模擬腸吸收

1.2.4.1 Caco-2細胞培養 參考Ohsawa［17］的實驗方法。Caco-2細胞培養基是含有10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%的雙抗（100 U/mL的青霉素和0.1 mg/mL的鏈霉素）的DMEM培養液。在37℃、相對濕度90%、5%的CO2的培養箱中進行培養。待細胞狀態良好時進行消化后接種于6孔Transwell板的上側，同時下側加入3 mL培養液。通過Millicell電阻儀測定跨膜電阻以檢測細胞的完整性，當跨膜電阻達到800 Ω以上時，可作為吸收轉運模型。

1.2.4.2 模擬轉運吸收 參照Kotzé［18］的實驗方法。模擬實驗開始前，分別將胃腸消化產物H-GI、F1-GI、F2-GI和R-GI用Hank's平衡鹽溶液（HBSS）配制濃度為10 mg/mL。用37℃預溫的HBSS清洗Caco-2單層細胞上側和下側，在上側添加1.5 mL溶于HBSS的樣品，在下側添加3 mL的HBSS。置于37℃細胞培養箱中孵育。設置細胞轉運0.5、1、2 h實驗組，每組三個重復。分別收集下側吸收的溶液，冷凍干燥，-80℃低溫保存備用。以溶劑HBSS代替樣品作為空白對照，茶多酚為陽性對照。

1.2.5 抗氧化活性的測定

1.2.5.1 水溶性維生素E當量抗氧化能力（TEAC）的測定 TEAC法，即測定ABTS自由基清除率，在Re［19］的研究方法基礎上合理改進，并參照王嬋［14］的具體實驗步驟，以谷胱甘肽（GSH）為陽性對照。以水溶性維生素E（Trolox）的濃度（mmol/L）為橫坐標，ABTS自由基清除率為縱坐標，繪制標準曲線y=37.932x-0.3969 （R2=0.9971），待測樣品的ABTS自由基清除率換算成Trolox的當量。

1.2.5.2 DPPH自由基清除率 參照Li等［20］的實驗方法。

1.2.5.3 氧自由基抗氧化能力（ORAC）的測定 ORAC測定方法采用Ou［21］提出的以熒光素鈉鹽作為熒光物質的方法，并經Dávalos［22］進行了改進。采用黑色96孔酶標板，先將20 μL吸收產物（20 μg/mL）和120 μL熒光工作液（70 nmol）加入每個小孔內，于37℃條件下孵育12 min，之后采用排槍添加60 μL的AAPH溶液（12 mmol），迅速將酶標板放入多功能酶標儀內，進行測定。采用PBS代替樣品作為空白對照。酶標儀參數設置：熒光模式，激發光485 nm，發射光520 nm，溫度37℃，檢測時間120 min，每1 min讀數一次。凈面積Net AUC=AUC樣品-AUC空白。

以Trolox濃度（mmol/L）為橫坐標，凈面積Net AUC為縱坐標繪制Trolox標準曲線y=18358x+14443（R2=0.9918）。待測樣品的Net AUC值均換算成Trolox的當量。

1.2.6 總氮與肽氮含量的測定 總氮與氨基氮的測定參照Xie［23］的實驗方法。肽氮含量等于樣品總氮含量減去氨基氮的含量。生物利用度為轉運吸收產物總氮含量與對應樣品總氮含量的百分比。魚肉和蛋白肽粉樣品經消化后，魚肉樣品仍有沉淀物，而肽處于全部溶解狀態，它們的消化率有很大差異。消化率為去沉淀的消化產物質量與原樣品質量的百分比。

1.2.7 數據處理與統計分析 采用SPSS 17.0軟件進行相關性分析，利用Duncan進行數據顯著性差異分析，顯著水平（α=0.05）。其他圖表制作與數據分析均采用Excel 2010處理。

2 結果與分析

2.1 魚肉蛋白肽及魚肉樣品的氨基酸組成分析

鱈魚魚肉蛋白肽H、F1、F2和魚肉R的氨基酸組成結果見表1。由表1可知，H、F1和F2與R的氨基酸組成存在不同程度的差異。F2與H、F1相比，酸性氨基酸、甘氨酸、脯氨酸含量明顯減少，堿性氨基酸、亮氨酸含量增多。H、F1、F2和R四個樣品中酸性氨基酸含量均較高，占氨基酸總量的20%以上（除F2外，18.91%），而半胱氨酸含量很少，這與鄧放明［1］測定鱈魚肌肉氨基酸組成的結果相似。氨基酸的疏水性、電荷性等因素都可能與抗氧化活性和胃腸耐受能力有關。

天冬氨酸、谷氨酸是呈鮮味類氨基酸，絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸等是主要呈甜味類氨基酸［24］，鱈魚魚肉呈鮮味和甜味氨基酸含量約占總量的50%。鱈魚魚肉中必需氨基酸含量也很高，占30%以上，尤其是賴氨酸較為豐富，而賴氨酸是人體第一必需氨基酸。從氨基酸上來看，鱈魚魚肉蛋白肽的營養價值很高。

2.2 模擬胃腸消化前后分子量分布

魚肉蛋白肽H、F1、F2與其對應的胃腸消化產物H-GI、F1-GI、F2-GI的分子量測定結果如表2所示。由表2可知，在模擬消化前，魚肉蛋白肽樣品（H、F1、F2）的分子量主要分布在3 ku以下。樣品H、F1分子量主要分布在500～1000 u范圍內；樣品F2主要由低于500 u的肽組成，占54.74%。經過胃腸消化后，魚肉蛋白肽樣品胃腸消化產物（H-GI、F1-GI、F2-GI）分子量分布有些變化，分子量大的肽比例減少，低于500 u肽部分的比例增加，但變化程度不大。魚肉蛋白R經SDS-PAGE凝膠電泳測得蛋白分子量在60～200 ku，經胃腸消化的產物R-GI的分子量范圍較廣（200 u～8 ku），主要集中在1～3 ku，占59.27%。

魚肉蛋白肽樣品本身的分子量較小（1 ku以下為主），可能受胃蛋白酶、胰酶水解作用的影響較小，更耐受胃腸的消化。而魚肉蛋白則在胃腸消化過程發生強烈的水解作用，生成很多肽類和氨基酸。活性肽通常由2～20個氨基酸殘基組成，分子量在6 ku以下［25］。分子量的大小往往與活性肽的抗氧化活性有關［26］。

表1 魚肉蛋白肽及魚肉氨基酸組成Table1 The amino acid composition of protein peptides and fish meat

表2 魚肉蛋白肽胃腸消化前后分子量分布Table2 The molecular weight distribution of fish protein peptides before and after gastrointestinal digestion

2.3 模擬胃腸消化過程中抗氧化活性的變化

2.3.1 TEAC活性 魚肉蛋白肽（H、F1、F2）在胃腸消化過程中的TEAC活性變化結果如圖1所示。由圖1 （A、B）可知，H、F1、F2（10 mg/mL）在消化過程中，TEAC活性強弱始終為F2＞H＞F1，并具有顯著性差異（p＜0.05）。在胃消化（0.5～2 h）、腸消化（0～2 h）過程中，H、F1、F2的TEAC活性變化不顯著（p＞0.05）。在胃腸消化結束時，魚肉蛋白H的胃腸消化產物（10 mg/mL）的TEAC活性與0.2 mg/mL GSH抗氧化水平相當。樣品魚肉R從腸消化階段才具有TEAC活性，并顯著低于魚肉肽消化物的TEAC活性（p＜0.05）。魚肉蛋白肽（H、F1、F2）在模擬胃腸消化過程中，TEAC活性保持穩定，這說明樣品可能比較耐受胃蛋白酶、胰酶的水解作用，未能影響ABTS+自由基的清除能力。魚肉R經胃蛋白水解后仍無抗氧化活性，而在胰酶的水解作用下，生成具有抗氧化活性的肽，TEAC活性急劇升高。

圖1 魚肉蛋白肽及魚肉胃腸消化過程中TEAC活性的變化Fig.1 Change of TEAC activity of protein peptides and fish meat during gastrointestinal digestion

2.3.2 DPPH自由基清除率 魚肉蛋白肽（H、F1、F2）在胃腸消化過程中，DPPH自由基清除率的測定結果如圖2所示。由圖2（A）可知，在未消化前即0 h時，H、F1、F2（10 mg/mL）的DPPH自由基清除率分別為62.21%、53.50%、43%，且數據間具有顯著性差異（p＜0.05）。與0 h相比，經胃消化2 h后，H、F1、F2各自的DPPH自由基清除顯著下降（p＜0.05）。由圖2（B）可知，在腸消化0.5 h內，H、F1、F2對應的胃消化物H-G、F1-G、F2-G（10 mg/mL）的DPPH自由基清除能力顯著降低（p＜0.05），并在腸消化0.5～2 h過程中顯著升高（p＜0.05），但低于消化前樣品的水平。最后在腸消化2 h結束時，H-G、F1-G、F2-G腸消化物DPPH自由基清除率分別為30.01%、28.47%、26.31%，并無顯著性差異（p＞0.05）。魚肉R在胰酶作用下發生強烈水解，DPPH自由基清除率顯著升高（p＜0.05），但低于魚肉蛋白肽（H、F1、F2）。經過胃腸消化，魚肉蛋白肽樣品中的某些肽發生降解，導致對DPPH自由基的清除率降低，但還是高于魚肉蛋白的抗氧化活性。

圖2 魚肉蛋白及肽組分胃腸消化過程中DPPH清除率的變化Fig.2 Change of DPPH scavenging capacity of protein peptides and fish meat during gastrointestinal digestion

分別采用DPPH和TEAC法測定抗氧化性，三個魚肉蛋白肽樣品（H、F1、F2）的活性強弱結果并不一致，未能比較哪個樣品抗氧化活性最好，這是因為這兩種抗氧化活性測定方法的原理不同。通常評價物質的抗氧化活性，會采用多種方法來綜合評價。

2.4 模擬吸收過程中肽氮含量和抗氧化活性的變化

2.4.1 肽氮含量的變化 魚肉蛋白肽的胃腸消化物（H-GI、F1-GI、F2-GI）在模擬轉運過程中，肽氮含量的測定結果如圖3所示。隨著轉運時間的延長，各吸收產物的肽氮含量均升高。在模擬轉運2 h結束時，H-GI、F1-GI、F2-GI的吸收產物中肽氮含量無顯著性差異（p＞0.05）。

圖3 模擬吸收過程中肽氮含量的變化Fig.3 Change of peptide nitrogen content during simulated intestinal absorption

機體不僅存在氨基酸轉運系統，還有肽轉運系統［27］，吸收的氨基酸來補充體內氨基酸，起到補充營養的作用；而以肽形式被吸收，則主要與生理活性有關。肽氮含量是通過檢測多肽的氨基端來定量的，本實驗肽氮含量的結果可以大致反映出肽含量。經吸收的肽，可能有潛在的生理活性，這將在機體健康保護方面具有重要的意義。

2.4.2 抗氧化活性的變化 H-GI、F1-GI和F2-GI （10 mg/mL）經單層Caco-2細胞模擬轉運吸收，其吸收產物的抗氧化活性測定結果如圖4所示。隨著轉運時間的延長，吸收產物的TEAC、ORAC活性顯著升高（p＜0.05）；在轉運2 h結束時，F2-GI吸收產物的TEAC活性顯著高于H-GI、F1-GI（p＜0.05），但它們的ORAC活性無顯著性差異（p＞0.05）。陽性對照茶多酚在轉運60 min內，TEAC、ORAC活性接近最高水平。魚肉的消化率很低（29.2%），所以同等質量的魚肉蛋白肽和魚肉經胃腸消化吸收，魚肉蛋白肽比魚肉抗氧化活性高。

圖4 模擬吸收過程中TEAC、ORAC活性的變化Fig.4 Change of antioxidant activity（TEAC、ORAC）during simulated intestinal absorption

魚肉蛋白肽吸收產物的抗氧化活性隨時間延長而升高，這可能是由于具有抗氧化活性的肽增加（圖4肽氮含量增加），提高了抗氧化能力。本實驗收集的吸收產物，大部分是緩沖鹽，實際的肽和氨基酸的濃度很低，必須用靈敏的抗氧化活性測定方法。TEAC 和ORAC方法比較靈敏，對抗氧化物的濃度要求很低，所以很適合吸收產物抗氧化活性的測定。

2.5 生物利用度

魚肉蛋白肽與魚肉的生物利用度的測定結果如圖5所示，魚肉蛋白肽H、F1和F2的生物利用度均高于魚肉（9.1%），且F2的生物利用度最高（46.2%），并具有顯著差異（p＜0.05）。魚肉經胃腸消化后，離心去掉不溶物，導致消化得率低，而蛋白肽為全溶解狀態，視為100%。由此可知，魚肉蛋白肽更易被機體吸收利用。

圖5 魚肉蛋白肽及魚肉的生物利用度Fig.5 The bioavailability of protein peptides and fish meat

3 結論

魚肉蛋白肽經胃腸消化、吸收后，仍具有一定的抗氧化活性，生物利用度也顯著高于魚肉（p＜0.05）。實驗中的三個魚肉蛋白肽樣品的分子量較小（＜1 ku為主），經胃腸消化吸收后，抗氧化活性差異小，但生物利用度有顯著差異（p＜0.05），分子量最小（＜500 u為主）的魚肉蛋白肽的生物利用度最高。與魚肉相比，魚肉蛋白肽更容易被機體吸收利用，在體內的抗氧化活性相對更高，營養價值也更高。本研究結果為鱈魚魚肉蛋白肽的開發利用提供了理論基礎。

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Antioxidant activity and bioavailability of the Pacific cod meat peptides during simulated gastrointestinal digestion and absorption

HUO Yan-jiao1，WANG Bo1，GUO Shan-shan2，LI Bo1，*，LUO Yong-kang1
（1.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China；2.Binzhou Wan Jia Biological Science and Technology Co.，Ltd.，Binzhou 256600，China）

Antioxidant activity and bioavailability of the Pacific cod（Gadus macrocephalus）protein peptide were determined during in vitro gastrointestinal digestion model and Caco-2 cell monolayer model simulated the process of gastrointestinal digestion and absorption.The results showed that TEAC activity of fish protein peptide had no obvious variation during gastrointestinal digestion，while DPPH scavenging capacity significantly （p＜0.05）reduced after pepsin digestion and obviously picked up but below（p＜0.05）the level of before digestion after intestinal digestion.The peptide nitrogen content and antioxidant activity of the absorption components increased（p＜0.05）during absorption.The bioavailability of protein peptides was higher than fish meat（9.1%），especially，low-molecular-weight fraction of protein peptides had the highest bioavailability （46.2%）.The cod protein peptide had antioxidant activity and pretty bioavailability after gastrointestinal digestion and absorption，which provided theoretical evidence for the cod protein peptide development.

gastrointestinal digestion；Caco-2 cell model；antioxidant activity；bioavailability

TS201.1

A

1002-0306（2016）06-0174-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.027

2015－07－29

霍艷姣（1990-），女，碩士研究生，研究方向：功能食品，E-mail：huoyjiao@cau.edu.cn。

李博（1970-），女，博士，副教授，研究方向：功能食品，E-mail：libo@cau.edu.cn。