NADH氧化酶表達對干酪乳桿菌LC2W胞外多糖產量的影響

李 楠，游春蘋，劉振民（光明乳業研究院，乳業生物技術國家重點實驗室，上海200436）

NADH氧化酶表達對干酪乳桿菌LC2W胞外多糖產量的影響

李 楠，游春蘋，劉振民*
（光明乳業研究院，乳業生物技術國家重點實驗室，上海200436）

為了考察NADH氧化酶基因（nox）對于干酪乳桿菌LC2W胞外多糖（EPS）產量的影響，本研究以變異鏈球菌（Streptococcus mutans）基因組為模板，PCR擴增得到1374 bp的nox序列，并構建乳桿菌重組表達質粒pIB184-nox。通過電轉化，構建得到一株過表達NADH氧化酶基因的重組干酪乳桿菌LC-nox。該重組菌在無氧發酵時，NADH氧化酶活力為0.7 U/mL，在有氧發酵時，NADH氧化酶活力達到2.65 U/mL。通過HPLC檢測發現，發酵液中的乳酸含量隨NADH氧化酶活力升高而降低。節省的碳源用于EPS合成，使得重組菌LC-nox在有氧條件下EPS產量最高達263.7 mg/L，比出發菌株提高75.4%。為乳桿菌EPS合成調控提供了新的理論基礎。

干酪乳桿菌，胞外多糖，輔因子工程，NADH氧化酶

胞外多糖（Exopolysaccharide，EPS）是微生物在生長代謝過程中分泌到細胞壁外，常滲于培養基中的一類糖類化合物［1］。這些高分子糖類聚合物因具有多種多樣的化學組成和分子結構，賦予發酵食品優良的功能特性，可作為增稠劑、乳化劑和穩定劑等在食品和非食品工業中發揮重要作用［2-3］。乳酸菌具有公認的食用安全性（Generally recognized as safe，GRAS），其在發酵過程中產生的胞外多糖除了具有增稠、乳化、保濕和穩定等作用，同時還有助于改善發酵的流變學特性，減少發酵乳乳清析出現象，改善發酵乳質地和感官品質等［4-5］。一些乳酸菌胞外多糖還具有增強黏膜吸附作用、促進免疫、降低膽固醇和抗腫瘤等生理功能［6-8］。因此，產胞外多糖乳酸菌在食品工業中具有廣闊的市場前景。然而，乳酸菌胞外多糖的產量一般來說都比較低，因此其工業化應用也受到一定的限制［9］。提高胞外多糖產量的研究，目前備受關注。通過篩選優良菌種，優化發酵條件，或對菌種進行改良，可以在一定程度上提高胞外多糖的產率［10-12］。近年來，隨著一些乳酸菌全基因組序列的報道和胞外多糖合成相關基因簇的克隆和功能分析，使得利用基因工程技術提高胞外多糖的產量成為可能。目前，已有報道將eps基因簇進行同源或異源表達、對起始糖基轉移酶和與糖核苷酸水平相關的基因進行過表達等研究，收到了一定的效果［13-16］。另外，還有研究者推測EPS合成可能與細胞內能量與輔因子代謝有關［17］，但是未見報道。

干酪乳桿菌LC2W是光明乳業股份有限公司篩選到的具有降血壓功能的專利益生菌，經體外免疫活性測試，其生理活性很可能與其所分泌的胞外多糖密切相關［18］。因此，對干酪乳桿菌LC2W胞外多糖的合成和調控機制進行研究具有重要意義。本研究對影響細胞內輔因子代謝水平的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶基因（nox）進行了克隆和過表達，從代謝工程的角度對EPS合成進行了調控，以期為乳桿菌輔因子代謝工程的開展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干酪乳桿菌LC2W（CGMCC NO.0828）、大腸桿菌DH5α 由本實驗室保藏；變異鏈球菌CGMCC 1.2499 購自中國普通微生物菌種保藏管理中心；pIB184質粒 由中國科學院上海生命科學研究院楊晟研究員惠贈；LB培養基 每升含有10 g胰蛋白胨、5 g酵母浸提物、10 g NaCl，需要時添加氨芐青霉素至終濃度為100 μg/mL，紅霉素至終濃度為200 μg/mL；MRS培養基 購自Merck公司（德國），需要時添加紅霉素至終濃度為10 μg/mL；30%聚乙二醇（PEG，分子量1500）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD） 購自上海生工生物工程有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、基因組提取試劑盒 購自天根生化科技（北京）有限公司；PrimeStar高保真酶、pGEM-T連接試劑盒、限制性內切酶BamHⅠ、SacⅠ 購自Takara寶生物工程（大連）有限公司；引物合成及基因測序

由上海英濰捷基生物有限公司完成。

UV-2450型紫外分光光度計 日本Shimadzu公司；ZHWY2102C恒溫培養搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；PowerPac Basic電泳儀、DYCP-31D水平電泳槽、GelDoc凝膠成像儀、電擊杯 美國Bio-Rad公司；Veriti梯度基因擴增儀 美國Applied Biosystems；Eporator電轉化儀、5424R冷凍離心機 德國Eppendorf公司；JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；A35厭氧工作站 英國Don Whitley Scientific公司；1260系列高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 nox基因的克隆 使用基因組提取試劑盒抽提變異鏈球菌（Streptococcus mutans）的基因組DNA。根據NCBI數據庫公布的nox基因序列，設計引物。上游引物為nox-F：GGATCCatgagtaaaatcgttattgttggagc（下劃線為BamHⅠ酶切位點）；下游引物為nox-R：GAGCTC tcatttagcttttaatgctgctttgg（下劃線為SacⅠ酶切位點）。

PCR反應以變異鏈球菌基因組為模板，采用高保真聚合酶PrimeStar進行擴增。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓100 V，電泳時間30 min；用膠回收試劑盒純化PCR產物；將已純化的PCR產物與pGEM-T載體以5∶1的摩爾比混合，在T4連接酶的作用下，室溫連接6 h；取5 μL連接產物，加入100 μL大腸桿菌DH5α感受態，冰浴30 min；42℃熱激90 s；冰上放置5 min后，加入900 μL LB培養基，37℃搖床復蘇45 min；取100 μL涂布氨芐青霉素抗性平板，37℃培養12 h；挑取單菌落至5 mL LB液體培養基，37℃培養12 h后，用試劑盒提取質粒；所得質粒用限制性內切酶BamHⅠ、SacⅠ進行雙酶切，37℃酶切3 h；酶切條帶大小正確的質粒送測序鑒定，陽性質粒命名為T-nox。

1.2.2 表達載體的構建 含有正確插入片段的重組質粒T-nox，與表達質粒pIB184進行雙酶切（BamHⅠ、SacⅠ），采用膠回收試劑盒純化酶切產物。將pIB184線性化載體和插入片段nox按1∶4的摩爾比混合，室溫連接6 h。連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態，涂布于含有紅霉素的LB平板上37℃培養16 h，提取質粒后進行雙酶切驗證和測序鑒定，得到正確的目標重組表達載體命名為pIB184-nox。

1.2.3 干酪乳桿菌LC2W感受態制備 按文獻［19］的方法進行。將MRS平板培養基上新鮮活化的干酪乳桿菌LC2W單菌落挑至5 mL MRS液體培養基，37℃靜置過夜（約16 h）；按2%的接種量轉接至100 mL含1%甘氨酸的MRS培養基，37℃靜置培養至OD600約為0.8（約4.5 h）；將菌液冰浴15 min，然后4℃、5000×g離心10 min收集菌體；用100 mL冰冷的30%PEG洗滌三次；用1 mL冰冷的30%PEG重懸菌體，分裝成每管100 μL，-80℃保存待用。

1.2.4 電轉化 按文獻［19］的方法進行。取5 μL pIB184-nox重組質粒與100 μL感受態細胞混合，轉移到預冷的0.1 cm電擊杯中，冰浴5 min，使用電轉化儀在1 kV電壓下進行電擊。電擊完畢后迅速加入1 mL復蘇培養基（MRS+500 mmol/L蔗糖+20 mmol/L MgCl2+2 mmol/L CaCl2），37℃靜置3 h；取100 μL菌液，涂布于含10 μg/mL紅霉素的MRS平板。37℃厭氧培養約48 h，至長出單菌落。提取乳桿菌中質粒作為模板，用引物nox-F、nox-R進行PCR驗證，并用限制性內切酶BamHⅠ、SacⅠ進行對質粒雙酶切，37℃酶切3 h，PCR擴增條帶及酶切片段大小均正確的陽性重組菌株命名為LC-nox。

1.2.5 發酵產EPS 從MRS平板上，挑取新鮮培養的干酪乳桿菌LC2W及其重組菌LC-nox的單菌落，分別接種于5 mL MRS液體培養基，37℃靜置過夜（約16 h）。按3%的接種量轉接至100 mL MRS培養基，無氧發酵置于厭氧箱靜置培養，有氧發酵置于37℃搖床220 r/min振蕩培養，重組菌株需加入紅霉素至終濃度為10 μg/mL，發酵時間為36 h。期間每隔6 h取1 mL菌液測OD600，制作生長曲線。發酵結束后，收集發酵液進行EPS濃度測定。

1.3 測定方法

1.3.1 NADH氧化酶酶活測定 取1 mL發酵液，離心收集菌體（10000×g，10 min，4℃）。用50 mmol/L pH7.0的磷酸鉀緩沖液洗滌菌體并重懸，冰浴超聲（200 W，工作3 s，停5 s，60次循環），離心收集上清液，作為粗酶液。

NADH氧化酶酶活測定根據De Felipe等［20］的方法進行。酶活測定反應體系為1 mL，其中含有50 mmol/L pH7.0的磷酸鉀緩沖液、0.3 mmol/L的NADH和0.3 mmol/L 的EDTA。反應在25℃進行，以加入100 μL粗酶液作為起始，觀察340 nm處吸光值的下降情況。酶活單位定義：在上述反應條件下，每分鐘催化1 μmol的NADH氧化為NAD，定義為一個酶活單位U。

1.3.2 EPS濃度測定 收集發酵液在沸水浴中放置10 min，冷卻至室溫后，離心（20 min，10000×g，4℃）。收集上清液，加入3倍體積無水乙醇，4℃放置12 h。離心（20 min，10000×g，4℃）后，沉淀溶于發酵液1/10體積的去離子水，加入三氯乙酸至終濃度為8%，4℃放置12 h。離心（20 min，10000×g，4℃），上清液在去離子水中利用透析袋（截留分子量為12～14 ku）進行透析，4℃放置3 d，每8 h換一次水。用硫酸-苯酚法［21］，進行粗多糖的測定。

1.3.3 乳酸測定 取1 mL發酵液，離心（10000×g，10 min，4℃）收集上清液，采用高效液相色譜法測定發酵液中乳酸的含量，色譜條件如下：Sepax Bio-C18反相柱（4.6 mm×150 mm，3 μm），檢測波長為210 nm，流動相為乙腈∶0.1%磷酸（5∶95），流速為0.5 mL/min，柱溫為30℃，進樣量為20 μL。乳酸標準品按常規方法配制［22］，用相同流動相進行測定并制作工作標準曲線（y=1.3316x-17.271，R2=0.9992），采用面積外標法以對樣品進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 nox基因的克隆

以變異鏈球菌基因組DNA為模板進行擴增后，PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；經切膠回收后，與pGEM-T載體連接、轉化；從大腸桿菌中提取重組質粒T-nox，進行雙酶切驗證，結果如圖1。成功得到大小為1374 bp的序列，進行測序，在NCBI上與變異鏈球菌的nox基因序列進行比對，同源性為100%。

圖1 nox基因克隆瓊脂糖凝膠電泳分析圖Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification and double digestion of nox gene from S.mutans

2.2 干酪乳桿菌重組質粒pIB184-nox的構建

用BamHⅠ和SacⅠ限制性內切酶，將目的基因片段nox從重組質粒T-nox上切下，回收片段后，與同樣酶切、回收的pIB184線性化載體進行連接，構建得到重組表達載體pIB184-nox，如圖2所示。該表達質粒含有P23組成型啟動子，在乳酸菌中能夠廣泛識別［23］，目的基因位于其下游，能夠隨菌體生長得到表達。

圖2 干酪乳桿菌重組表達載體pIB184-noxFig.2 The map of recombinant expression plasmid pIB184-nox in L.casei

2.3 重組干酪乳桿菌LC-nox的構建及鑒定

通過電轉化的方法，將重組表達質粒pIB184-nox轉入干酪乳桿菌LC2W中，經紅霉素抗性平板的篩選，從重組菌中抽提質粒后進行驗證。經過質粒PCR驗證和酶切鑒定，結果如圖3所示，所得片段大小在1374 bp左右，證實重組干酪乳桿菌LC-nox已成功構建。2.4 發酵產EPS比較

圖3 重組干酪乳桿菌酶切鑒定和PCR驗證圖Fig.3 Identification of recombinant L.casei with double digestion and PCR amplification

圖4 菌體在不同條件下的生長曲線Fig.4 Growth curve of L.casei under different conditions

將干酪乳桿菌LC2W出發菌株與其重組菌LC-nox同時進行發酵產EPS實驗，菌株生長情況如圖4所示。干酪乳桿菌LC2W本身屬于兼性厭氧微生物，在無氧條件下生長時，36 h OD600能達到10.18，明顯好于其有氧條件下生長。其重組菌LC-nox同樣如此，36 h OD600為6.69，而在有氧條件下生長時，OD600僅為3.95，說明氧氣對于該菌體的生長具有一定抑制作用。

發酵結束后，測定發酵液中EPS含量，結果如圖5所示。通過表達NADH氧化酶，重組干酪乳桿菌LC-nox在無氧發酵時，EPS產量為202.7 mg/L，比出發菌株LC2W提高34.9%；而重組菌LC-nox在有氧發酵時，EPS產量最高，為263.7 mg/L，比其無氧條件下EPS產量提高30.0%，比出發菌株提高75.4%。通過上述實驗結果可以看出，EPS產量提高并非是由于氧氣脅迫引起的，因為在出發菌株LC2W發酵中并未觀察到這一現象。

圖5 不同菌株EPS發酵產量比較Fig.5 Comparison of EPS yield between different strains

2.5 NADH氧化酶酶活及乳酸產量比較

表1為不同菌株在有氧及無氧發酵時NADH氧化酶酶活及乳酸產量比較。由表1可知，與干酪乳桿菌LC2W出發菌株相比，重組菌株LC-nox的NADH氧化酶活力明顯提高，無氧條件下提高了14倍，而有氧條件下提高了44倍以上。乳酸產量則與NADH氧化酶呈負相關，重組菌株LC-nox比出發菌株有不同程度的減少，這與實驗設計的目的是一致的。在菌體糖酵解過程中，丙酮酸到乳酸的轉化過程需要提供NADH作為還原力，而NADH氧化酶負責催化NADH轉變為NAD，減少了細胞內還原力的供應，因而導致乳酸產量的減少。而氧氣的存在，可以進一步消耗NADH，減少乳酸產生，節省的碳源能夠用于促進EPS合成，提高其產量。

表1 NADH氧化酶酶活及乳酸產量比較Table1 Comparison of NADH oxidase activity and lactate concentration in L.casei

3 結論

本研究利用輔因子代謝工程的手段，構建了一株過表達NADH氧化酶的重組干酪乳桿菌。研究結果表明，通過提高菌體內的NADH氧化酶活力，能夠競爭性的減少乳酸產生，節省的碳源用于EPS合成，使得產量有大幅度的提高。另外，在有氧發酵條件下，重組干酪乳桿菌的NADH氧化酶酶活能夠得到進一步提高，使得EPS產量最高達263.7 mg/L，比出發菌株提高75.4%。由此可見，利用代謝工程技術，提高乳酸菌胞外多糖產量，具有很大的可行性和應用前景。

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Impact of overexpression of NADH oxidase on exopolysaccharide production in Lactobacillus casei LC2W

LI Nan，YOU Chun-ping，LIU Zhen-min*
（Dairy Research Institute，Bright Dairy&Food Co.，Ltd.，State Key Laboratory of Dairy Biotechnology，Shanghai 200436，China）

To investigate the effect of NADH oxidase gene（nox）on the production of exopolysaccharide from Lactobacillus casei LC2W，nox gene was obtained by PCR amplification with the genomic DNA of Streptococcus mutans as template.It was subcloned into a lactobacilli vector to construct the recombinant expression plasmid pIB184-nox.By electroporation，pIB184-nox was introduced into Lactobacillus casei LC2W，resulting in the recombinant strain designated as LC-nox.Under anaerobic condition，LC-nox overexpressed NADH oxidase to a level of 0.7 U/mL，while it was elevated to 2.65 U/mL under aerobic condition.Detected by HPLC，the lactate concentration in the fermentation broth showed negative correlation with NADH oxidase activity.The carbon source saved was used for the biosynthesis of exopolysaccharide（EPS）.The highest yield of EPS was reached at 263.7 mg/L under aerobic fermentation，which was increased by 75.4%compared to that of the starting strain.A novel theoretical basis was provided for the regulation of EPS biosynthesis in lactobacillus.

Lactobacillus casei；exopolysaccharide；cofactor engineering；NADH oxidase

TS252.4

A

1002-0306（2016）06-0182-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.029

2015－08－24

李楠（1983-），男，博士研究生，研究方向：益生菌改造和代謝機理研究，E-mail：linan@brightdairy.com。

劉振民（1974-），男，博士，高級工程師，研究方向：乳酸菌、發酵乳、干酪和功能性乳品，E-mail：liuzhenmin@brightdairy.com。

上海市科研計劃項目（14R21420100）；國家“十二五”科技支撐計劃（2013BAD18B01）；國家“十二五”863項目（2011AA100901）。