牛胰脂肪酶交連酶聚體的制備及性能研究

崔建東，劉容麟（河北省發酵工程技術研究中心，生物科學與工程學院，河北科技大學，河北石家莊050018）

牛胰脂肪酶交連酶聚體的制備及性能研究

崔建東，劉容麟
（河北省發酵工程技術研究中心，生物科學與工程學院，河北科技大學，河北石家莊050018）

以牛胰脂肪酶（cattle pancreatic lipase，CPL）為研究對象，采用交聯酶聚體技術，研究交聯酶聚體脂肪酶（CPLCLEAs）的制備條件、催化性能和酶促反應動力學參數。結果表明，交聯酶聚體脂肪酶制備的最優制備條件為：硫酸銨飽和度80%，戊二醛終濃度1.5%，交聯時間1 h，在此條件下，所得CPL-CLEAs最高酶活回收率為90%。CPL-CLEAs的最適催化溫度是60℃，與游離脂肪酶相比，CPL-CLEAs的最適催化溫度提高了10℃，且溫度穩定性、儲存穩定性和操作穩定性均有所提高。重復使用7次后，CPL-CLEAs仍能保持初始酶活的43%。

交聯酶聚體技術，脂肪酶，固定化酶

脂肪酶作為一種天然的、綠色的生物催化劑，不僅能催化酯合成、酯交換、聚合物合成等，而且可用于催化多肽的合成以及手性化合物的拆分等反應，如可以利用某些脂肪酶的立體專一性催化某些化學方法難以完成的旋光異構體拆分和手性藥物合成反應［1］。在食品領域，脂肪酶也有廣泛的應用，如在食用油脂工業上，脂肪酶可以催化酯交換、酯轉移、水解等反應；在乳品工業中脂肪酶可用于乳酯水解，包括奶酪和奶粉風味的增強、奶酪的熟化、代用奶制品的生產、奶油及冰淇淋的酯解改性等［2］。在食品添加劑工業中主要用于酯類添加劑的合成［2］。

但游離的脂肪酶在應用過程中，表現出不穩定、易失活以及難以回收利用的問題，限制了該酶的應用，為了提高脂肪酶的工業適用性，脂肪酶的固定化已經受到極大的關注。例如，通過將豬胰脂肪酶固定在離子液體修飾的介孔二氧化硅上，所得的固定化脂肪酶的酶活力和穩定性比游離酶均得到顯著提高［3］。梁靜鵑等［4］將脂肪酶固定在硅膠上，并研究了該固定化脂肪酶在離子液體中催化合成生物柴油的性能，結果表明，固定化脂肪酶的穩定性比游離酶顯著提高，且離子液體的添加有效提高了生物柴油的轉化率。盡管將脂肪酶固定到載體上能有效改善脂肪酶的催化穩定性。但是載體的存在不但增加了固定化的成本，而且易產生傳質擴散阻礙，降低酶的催化效率［5］。近年來，無載體固定化酶技術成為研究的熱點。交聯酶聚體（CLEAs）是一種研究最多的無載體固定化技術，其制備過程包括沉淀和交聯兩步，即：將酶蛋白進行沉淀后，利用戊二醛使酶分子交聯成酶聚體形式。CLEAs具有操作簡便、酶回收率高、成本低廉等特點，極具開發價值［6-8］。

因此，本研究利用CLEAs技術制備穩定性好、酶活回收率高、能重復使用的牛胰脂肪酶CLEAs，優化了制備參數；并研究了脂肪酶CLEAs的催化性能。旨為脂肪酶的工業化應用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛胰脂肪酶（CPL，15～25 U/mg）、對硝基苯酚、對硝基苯酚乙酸酯 阿拉丁試劑（上海）有限公司；50%戊二醛（v/v） 北京百靈威科技有限公司；聚乙二醇辛基苯基醚（Ttiton X-100） 天津博迪化工股份有限公司；其他試劑 均為分析純。

HZX-110型電子天平 福州華志科學儀器有限公司；恒溫多頭磁力攪拌器 金壇市榮華儀器廠；HC-2064型高速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；742型紫外分光光度計 上海光譜儀器有限公司；DK-98-II型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；S-4800-I型場發射掃描電子顯微鏡日本HITACHI。

1.2 實驗方法

1.2.1 交聯酶聚體脂肪酶（CPL-CLEAs）的制備 取0.561 g硫酸銨加入到含有1 mL 0.1 g/mL的牛胰脂肪酶溶液的7 mL離心管中，使硫酸銨的飽和度為80%，之后加入50%戊二醛溶液，使體系戊二醛終質量濃度為1.5%，常溫下分別交聯1 h，然后7000×g離心5 min，棄去上清，用50 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.5）洗滌3次，7000×g下離心5 min，沉淀重新均勻懸浮在50 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.5）中，4℃保存備用。

1.2.2 對硝基苯酚標準曲線的制作 分別在410 nm下測定質量濃度為1.2、2.4、3.6、4.8、6.0 mg/L的對硝基苯酚的吸光值，以吸光值為橫坐標，質量濃度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.3 游離牛胰脂肪酶和CPL-CLEAs酶活測定 利用對硝基苯酚法（紫外分光光度法）測定游離牛胰脂肪酶酶活［9］。取4 mL 0.09 g/L的對硝基苯酚乙酸酯（含有50 mmol/L，pH7.5磷酸緩沖液，體積分數0.2% Triton X-100），加入1 mL 0.1 g/L牛胰脂肪酶酶液，37℃恒溫水浴5 min，用分光光度計在410 nm測定吸光值，空白對照為含有等量滅活酶液的上述體系。根據對硝基苯酚標準曲線計算酶活。CPL-CLEAs的酶活測定條件與游離脂肪酶相似，只是把游離酶換成CPL-CLEAs。一個酶活力單位定義為每分鐘催化對硝基苯酚乙酸酯生成1 μmol對硝基苯酚所用的酶量，酶活回收率及酶活殘留率計算公式如下［10］：

酶活回收率（%）=交聯酶聚體酶活/制備交聯酶聚體所用游離酶酶活×100

酶活殘留率（%）=處理后殘留的酶活/處理前酶活×100

相對酶活（%）是在考察最適催化溫度時，將某一溫度下測定的脂肪酶酶活最高值記為100%，其他溫度下測定的酶活與最高酶活的比值。

1.2.4 CPL-CLEAs的形態觀察 CPL-CLEAs樣品被真空冷凍干燥后，在真空條件下噴鉑金后利用電子掃描顯微鏡檢測。

1.2.5 統計分析 所有實驗重復進行3次，利用SAS軟件（v8.0）進行統計分析。

1.2.6 牛胰脂肪酶交聯酶聚體制備條件的優化CLEAs的制備包括沉淀和交聯兩步，制備工藝參數的優化如下。

1.2.6.1 沉淀劑硫酸銨飽和濃度優化 分別取0.313、0.390、0.472、0.561、0.662 g硫酸銨加入到5只含有1 mL 0.1 g/mL的牛胰脂肪酶溶液（用pH7.5的50 mmol/L磷酸緩沖液配制）的7 mL離心管中，使硫酸銨的飽和濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%，之后加入質量濃度為50%的戊二醛10 μL，常溫下交聯1 h，7000×g下離心5 min，棄去上清，7000×g下離心5 min，沉淀重新均勻懸浮在50 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.5）中，用紫外分光光度法測定酶活，計算酶活回收率。

1.2.6.2 交聯劑戊二醛質量濃度優化 向5只含有1 mL 0.1 g/mL牛胰脂肪酶溶液（用50 mmol/L磷酸緩沖液配制）的7 mL離心管中分別加入0.561 g硫酸銨，使硫酸銨飽和濃度為80%，然后分別加入質量濃度為50%的戊二醛10.1、20.4、30.9、41.7、52.6 μL，使得體系中戊二醛的質量濃度分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，常溫下交聯1 h，7000×g下離心5 min，棄去上清，沉淀用50 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.5）洗滌3次，7000×g下離心5 min，沉淀重新均勻懸浮在50 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.5）中，用紫外分光光度法測定酶活，計算酶活回收率。

1.2.6.3 交聯時間的優化 將0.561 g硫酸銨分別加入到5只含有1 mL 0.1 g/mL的牛胰脂肪酶溶液（用pH7.5的50 mmol/L磷酸緩沖液配制）的7 mL離心管中，使硫酸銨的飽和濃度為80%，之后加入質量濃度為50%的戊二醛溶液，使體系戊二醛質量濃度為1.5%，常溫下分別交聯0.5、1、1.5、2、2.5 h，7000×g離心5 min，棄去上清，用50 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.5）洗滌3次，7000×g下離心5 min，沉淀重新均勻懸浮在50 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.5）中，用紫外分光光度法測定酶活，計算酶活回收率。

1.2.7 最適催化溫度的測定 分別測定游離酶和CPL-CLEAs在30、40、50、60、70℃下的酶活，酶活測定方法同1.2.3。

1.2.8 動力學常數的測定 取一定量的酶樣品測定不同底物濃度（120、110、100、90、80 μmol/L對硝基苯酚乙酸酯）下的酶促反應速率，利用雙倒數法得到Km和Vmax。

1.2.9 CPL-CLEAs穩定性的研究 CPL-CLEAs的穩定性研究主要包括pH穩定性、溫度穩定性、儲藏穩定性和操作穩定性，以游離酶作為對照。

1.2.9.1 溫度穩定性的測定 將游離酶和CPL-CLEAs 在60℃水浴處理，每隔1 h，分別取出1 mL游離酶和1 mL懸浮的CPL-CLEAs，游離酶直接測酶活，CPLCLEAs先在7000×g離心5 min，然后用1 mL磷酸緩沖液懸浮，測定酶活。計算不同處理時間的酶活殘留率［8］。

1.2.9.2 儲存穩定性測定 將游離酶，CPL-CLEAs懸浮液分別儲存在25℃，每隔3 d測定一次酶活，計算酶活殘留率。

1.2.9.3 操作穩定性測定 分別將游離酶、CPLCLEAs懸浮液在25℃，200 r/min振蕩條件下，每隔3 d測定一次酶活，計算酶活殘留率［11］。

1.2.9.4 CPL-CLEAs重復使用性的測定 取1 mL CPL-CLEAs懸浮液，在37℃條件下催化底物對硝基苯酚乙酸酯生成對硝基苯酚，反應5 min后，離心分離出固定化酶，用50 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.5）洗滌3次后，7000×g離心5 min，在沉淀（CPL-CLEAs）中加入新的底物溶液進行第二輪反應，依此分批催化，每次催化反應后分別檢測固定化酶剩余的酶活。

2 結果與分析

2.1 CPL-CLEAs制備條件的優化

2.1.1 對硝基苯酚標準曲線 所得對硝基苯酚標準曲線方程為：Y=8.7457X-0.1607，R2=0.9999。

2.1.2 硫酸銨飽和濃度對CPL-CLEAs酶活回收率的影響 從圖1中可以看出，隨著硫酸銨飽和濃度的增大酶活回收率逐漸增加，當飽和濃度達80%時，牛胰脂肪酶的回收率達到最高，之后小幅度降低。這可能是由于隨著硫酸銨飽和濃度的增加，越來越多的鹽離子與酶蛋白競爭溶液中的水分子，破壞酶蛋白表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來，當大部分酶蛋白析出后，再繼續增加硫酸銨，析出的酶蛋白就越來越少，并且高濃度的硫酸銨使得溶液pH酸性增強，導致部分酶蛋白會變性失活，因而又開始出現下降趨勢［12］。

圖1 硫酸銨飽和濃度對CPL-CLEAs酶活回收率影響Fig.1 The effect of（NH4）2SO4concentration on activity recovery of CPL-CLEAs

2.1.3 戊二醛濃度（質量濃度）對CPL-CLEAs酶活回收率的影響 從圖2可以看出，隨著戊二醛濃度的增加，酶活回收率逐漸升高，當體系中的戊二醛濃度為1.5%時，酶活回收率達到最高，為90%。之后隨著戊二醛濃度的增加，酶活回收率開始下降。戊二醛一方面是蛋白的交聯劑，可以將蛋白表面的賴氨酸殘基交聯起來，但另一方面又是蛋白的變性劑；濃度低時，難以將大多數酶分子交聯固定，導致大多數酶分子泄漏到上清中，使固定化酶的酶活回收率降低；而過量的戊二醛可以進入酶分子的活性中心，破壞酶的活性中心結構，使酶失活［13］。

圖2 戊二醛濃度對CPL-CLEAs酶活回收率影響Fig.2 The effect of glutaraldehyde concentration on enzyme recovery of CPL-CLEAs

2.1.4 交聯時間對CPL-CLEAs酶活回收率的影響

從圖3可知，交聯時間在1 h時，酶活回收率達到最大，為90%，此時大部分酶都已經交聯在一起，隨著時間的增加，酶蛋白長時間的與戊二醛接觸，酶活性中心更易受到戊二醛的破壞，導致酶失活，酶蛋白會受到一定破壞，時間越長，酶活損失越大［14］。

圖3 交聯時間對CPL-CLEAs酶活回收率的影響Fig.3 The effect of cross-linking time on activity recovery of CPL-CLEAs

2.2 交聯酶聚體脂肪酶的形態觀察

圖4 CPL-CLEAs的形態Fig.4 Morphology of CPL-CLEAs

圖4是掃描電鏡觀察的固定化酶的圖片。從圖4中可以看出，制備的CPL-CLEAs的顆粒非常小（圖4a），呈現疏松多孔的網狀結構（圖4b）。這種疏松多孔的網狀結構是由于戊二醛使酶蛋白分子以共價鍵結合，形成網狀結構，這種結構使得制備的CPL-CLEAs具有優良的穩定性和一定的機械強度［15］。同時，網狀結構還提高了固定化酶的表面積，提高了酶與底物的接觸機會，使底物更容易進入酶的活性中心發生酶促反應，因而使CPL-CLEAs具有較高的催化活性。

2.3 最適催化溫度和動力學參數

2.3.1 最適催化溫度 由圖5可知，游離脂肪酶的最適催化溫度為50℃，交聯酶聚體脂肪酶的最適催化溫度為60℃。且交聯酶聚體脂肪酶對高溫的適用范圍變寬；當催化溫度由50℃升高至70℃時，游離酶的相對酶活下降至60%，而交聯酶聚體脂肪酶的相對酶活僅下降至90%。因此，交聯酶聚體脂肪酶比游離脂肪酶具有更好的溫度適用性。

圖5 游離酶和交聯酶聚體脂肪酶的最適催化溫度Fig.5 The optimal temperature of CPL and CPL-CLEAs

2.3.2 動力學常數 由表1可知，交聯酶聚體脂肪酶的Km值比游離脂肪酶的大，表明游離脂肪酶更易與底物結合，并且與底物結合后形成的中間體結合力也相對大，不易于解離，因此游離脂肪酶的Vmax比交聯酶聚體脂肪酶的大［16］。而交聯酶聚體脂肪酶中由于酶分子各個亞基受共價鍵鏈接影響，其構象也發生一定變化，使活性位點的構象發生改變，導致酶活性中心與底物的親和力有所下降；而且交聯酶聚體脂肪酶中酶分子以超分子狀態聚集到一起，導致底物難以進入交聯酶聚體脂肪酶的活性中心，表現出Vmax降低。

表1 游離脂肪酶和交聯酶交聯酶聚體脂肪酶的Vmax和KmTable1 Vmaxand Kmof CPL and CPL-CLEAs

2.4 交聯酶聚體脂肪酶的穩定性

2.4.1 溫度穩定性 從圖6可以看出，游離脂肪酶在60℃處理5 h后酶活殘留率僅能保持75%，但是，交聯酶聚體脂肪酶在相同條件下處理5 h后酶活幾乎沒有損失。這可能是由于交聯酶聚體脂肪酶中由于共價鍵的存在阻止了酶分子的伸展變形以及分子自我變性［17］，使得酶結構更加穩定。

圖6 游離脂肪酶和交聯酶聚體脂肪酶的溫度穩定性Fig.6 Thermal stability of CPL and CPL-CLEAs

2.4.2 儲存穩定性 從圖7可以看出，游離脂肪酶在25℃下儲存到第12 d時酶活僅剩43%，但是，交聯酶聚體脂肪酶仍能保留80%的酶活，顯示出良好的儲存穩定性。這可能由于脂肪酶在戊二醛的作用下，脂肪酶表面的活性基團互相鏈接后，形成了穩定結構，這種穩定的結構對酶的活性中心有一定的保護作用，使其經過長時間儲存后，仍然可以保持較高酶活力［18］。

圖7 游離脂肪酶和交聯酶聚體脂肪酶的儲存穩定性Fig.7 Storage stablility of CPL and CPL-CLEAs

2.4.3 操作穩定性 從圖8中可以看出，游離脂肪酶在200 r/min振蕩條件下維持12 d時，酶活殘留率僅剩13%。而在同樣的條件下維持12 d，交聯酶聚體脂肪酶酶活殘留率能保持63%。這可能是由于在高剪切力的作用下，酶分子構象更容易發生變化，使酶變性失活。但將酶分子間交聯固定化后，由于固定化后的酶分子構象更趨于剛性，不易發生變化，使酶構象更穩定，從而可以保持較高酶活力［18-19］。

圖8 游離酶和交聯酶聚體脂肪酶的操作穩定性Fig.8 Operation stability of CPL and CPL-CLEAs

2.4.4 重復使用性 從圖9可知，交聯酶聚體脂肪酶重復使用7次，酶活殘留率仍能保持43%。說明交聯酶聚體脂肪酶具有較好的重復使用效果。相對于游離酶而言，交聯酶聚體脂肪酶可以更容易的從反應液中分離出來用于下一循環，從而減少回收過程中酶的損失，提高工業化應用效果。

圖9 交聯酶聚體脂肪酶的重復使用性Fig.9 Reusability of CPL-CLEAs

3 結論

本研究制備了牛胰脂肪酶交聯酶聚體，獲得的最適制備條件是：硫酸銨飽和濃度80%，戊二醛質量濃度1.5%，交聯時間1 h，在此條件下，獲得的最大酶活回收率達到90%。與游離脂肪酶相比，交聯酶聚體脂肪酶在60℃處理5 h后酶活幾乎沒有損失，而游離脂肪酶只能保持75%的初始酶活；交聯酶聚體脂肪酶在25℃下儲藏12 d后仍能保持初始酶活的80%，但游離脂肪酶只能保持43%。在持續的12 d振蕩條件下，交聯酶聚體脂肪酶能保持初始酶活的63%，而游離脂肪酶只有13%。在重復使用7次后，交聯酶聚體脂肪酶酶活殘留率仍能保持43%。上述結果表明這種固定化酶方法在工業應用中具有較好的實用前景。

［1］許建和.生物催化工程［M］.上海：華東理工大學出版社，2008.

［2］劉海洲，吳小飛，牛佰慧，等.脂肪酶在食品工業中的應用與研究進展［J］.糧食加工，2008，33（5）：55-57.

［3］鄒彬，初旭明，張洋，等.離子液體修飾的SBA-16材料在豬胰脂肪酶固定化中的應用［J］.生物加工過程，2014（12）：6-11.

［4］梁靜鵑，楊立鵬，韓鈞，等.固定化脂肪酶在離子液體中催化合成生物柴油［J］.可再生能源，2012，30：72-77.

［5］Zhang W W，Yang X L，Jia J Q，et al.Surfactant-activated magnetic cross-linked enzyme aggregates（magnetic CLEAs）of Thermpmyces lanuginosus lipase for biodiesel production［J］.Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2015，115：3-89.

［6］Xu D Y，Yang Zh.Cross-linked tyrosinase aggregates for elimination of phenolic compounds from wastewater［J］.Chemosphere，2013，92（4）：391-398.

［7］Yu HW，Chen H，Wang X，et al.Cross-linked enzyme aggregates（CLEAs） with controlled particles：Application to Candida rugosa lipase［J］.Molecular Catalysis，2006，43：124-127.

［8］馬雷猛，貴莉莉，王飛，等.添加納米粒子對脂肪酶交聯酶聚集體活性及結構的影響［J］.北京化工大學學報，2015，42 （2）：83-88.

［9］Wilson L，Fern＇andez-Lorente G，Fern＇andez-Lafuente R.CLEAs of lipases and poly-ionic polymers：A simple way of preparing stable biocatalysts with improved properties［J］.Enzyme and Microbial Technology，2006，39：750-755.

［10］孫立梅，李連連，崔建東.牛血清白蛋白輔助交聯對苯丙氨酸解氨酶交聯酶聚體影響的研究［J］.食品工業科技，2013，13：44-47.

［11］邢肖肖，王夢凡，齊崴，等.β-半乳糖苷酶交聯酶聚體的制備及酶學性質研究［J］.食品工業科技，2014，35（23）：158-167.

［12］李連連，崔建東.以大孔硅膠為載體的苯丙氨酸解氨酶交聯酶聚體的制備及性質研究［J］.食品工業科技，2014，35（11）：160-165.

［13］Cui J D，Zhang S，Sun L M.Cross-linked enzyme aggregates of phenylalanine ammonia lyase：novel biocatalysts for synthesis of L-Phenylalanine［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2012，167（4）：835-844.

［14］Moon II Kim，Jungbae Kim，Jinwoo Lee.One-dimensional crosslinked enzyme aggregates in SBA-15：Superior catalytic behavior to conventional enzyme immobilization［J］.Microporous and Mesoporous Materials，2008，101：18-23.

［15］Mengfan Wang，Wei Qi，Qingxin Yu，et al.Cross-linking enzyme aggregates in the macropores of silica gel：A practical and efficient method for enzyme stabilization［J］.Biochemical Engineering Journal，2010，52：168-174.

［16］劉娟，楊楠楠，姜愛莉.固定化脂肪酶的制備及其酶學性質的研究［J］.油脂化學，2013，38（1）：44-47.

［17］石蓮蓮.固載化脂肪酶交聯酶聚集體的制備及應用［D］.天津：河北工業大學，2013.

［18］王夢凡.新型交聯酶聚體技術及其在蛋白組學與生物催化中的應用［D］.天津：天津大學，2011.

［19］常凱，王紅英，孫井輝.磁性殼聚糖微球固定化脂肪酶的研究［J］.大連工業大學學報，2011，30（1）：31-33.

Preparation and properties of cross－linked enzyme aggregates of cattle pancreatic lipase

CUI Jian-dong，LIU Rong-lin
（Research Center for Fermentation Engineering of Hebei，College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China）

In this study，cross-linked enzyme aggregates（CLEAs）of cattle pancreatic lipase（CPL-CLEAs）was prepared by cross-linked enzyme aggregates technology，the preparation conditions，catalysis properties，and dynamics parameters of CPL-CLEAs were investigated.The results showed that the optimum conditions of the preparation of CPL-CLEAs were as followed：final saturability of the ammonium sulfate was 80%，final concentration of glutaraldehyde was 1.5%，and corss-link time was 1 h.Under this condition，the highest activity recovery reached 90%.In addition，compared to free lipase，the optimum temperature of CPL-CLEAs was 60℃，which was increased about 10℃.The thermal stability，operational stability，and storage stablility of CPL-CLEAs were significantly enhanced compared with free lipase.Furthermore，the CPL-CLEAs still retained 43%of its initial activity after consecutive 7 cycles.

CLEAs technology；lipase；immobilized enzyme

TS202.3

A

1002-0306（2016）06-0201-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.033

2015－07－06

崔建東（1974-），男，博士，教授，主要從事生物催化與微生物資源開發，E-mail：cjd007cn@163.com。

國家自然科學基金（21072041）；河北省自然科學基金（B2014208054）。