保護劑對真空冷凍干燥酸馬乳粉中乳酸菌的影響

王 威，王小標，殷 娜，張亞南，楊波若，古麗娜孜，武 運，*（.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊8005；.昌吉市農產品質量安全檢驗檢測中心，新疆昌吉800；.新疆農業大學科學技術學院，新疆烏魯木齊8005）

保護劑對真空冷凍干燥酸馬乳粉中乳酸菌的影響

王 威1，王小標2，殷 娜3，張亞南1，楊波若1，古麗娜孜1，武 運1，*
（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052；2.昌吉市農產品質量安全檢驗檢測中心，新疆昌吉831100；3.新疆農業大學科學技術學院，新疆烏魯木齊830052）

以真空冷凍干燥酸馬乳粉中乳酸菌為考察對象，采用二水平部分析因設計和最陡爬坡實驗篩選了3種乳酸菌凍干保護劑，并確定了中心組合實驗的中心實驗點。通過響應面實驗優化得到3種凍干保護劑的最優添加量為麥芽糊精2.30%（W/V）、海藻糖3.50%（W/V）、α-環狀糊精3.10%（W/V）。在此條件下，酸馬乳粉中乳酸菌活菌數為（8.78±0.10）×108CFU/g。真空冷凍干燥酸馬乳粉具有較高的乳酸菌活菌數與較佳的風味和品質，可為新疆地區馬乳及其制品的加工提供一定的理論依據。

酸馬乳粉，真空冷凍干燥，凍干保護劑，乳酸菌活菌數

發酵酸乳是一種含有大量活性乳酸菌，具有較高營養價值和醫療保健作用的乳制品，深受廣大消費者的喜愛。發酵酸乳制品中乳酸菌的活菌數及其活性與發酵酸乳制品的醫療保健作用密切相關［1］。《GB 16321-2003乳酸菌飲料衛生標準》規定，未殺菌活性乳酸菌飲料出廠、運輸、貯藏以及銷售時乳酸菌活菌數應在1×106CFU/mL以上。有研究認為，益生菌發酵食品在貨架期內乳酸菌活菌數應大于1×106CFU/mL，才能更好發揮乳酸菌益生作用［2］。然而，發酵乳制品在運輸、貯藏、銷售過程中需要全程冷鏈，否則會造成嚴重的后酸化現象，大大降低發酵乳中乳酸菌活菌數，以及發酵乳制品的風味和品質，縮短保質期［3-4］。將發酵乳通過冷凍干燥、噴霧干燥或者微波干燥等工藝加工成酸乳粉，在保持發酵乳制品風味及乳酸菌活菌數的同時，又可以延長產品貨架期，同時不需要冷鏈參與，降低生產成本［5-6］。研究表明，與其他干燥方式相比，冷凍干燥制備的酸乳粉具有較高的活菌數和較好的風味［7-8］。陸婧采用冷凍干燥法制備的藏靈菇酸奶粉色澤均勻、疏松多孔，無結塊具有典型的酸乳風味，而且藏靈菇酸奶粉中乳酸菌活菌數可達到2.12×108CFU/g［9-10］。

保護劑對液態乳的乳酸菌活性的影響研究較多，但在國內外，保護劑對真空冷凍酸馬乳粉中乳酸菌活性的影響還未曾研究。因此，本實驗以真空冷凍干燥酸馬乳粉中乳酸菌為考察對象，通過二水平部分析因設計篩選出對真空冷凍干燥酸馬乳粉中乳酸菌存活有顯著影響的凍干保護劑，并通過最陡爬坡實驗確定凍干保護劑的添加量范圍，運用中心組合實驗設計優化不同凍干保護劑的最優添加量，提高真空冷凍干燥酸馬乳粉中乳酸菌活菌數，為新疆地區馬乳加工產業的發展提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮馬乳 購于新疆烏魯木齊南山地區；干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）MLS5、乳酸乳球菌（Lactococus lactis）WLB5和馬克思克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus）WWMJ1 新疆農業大學食品科學與藥學學院微生物實驗室；MRS肉湯、改良MC培養基、酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）、孟加拉紅培養基 青島日水生物技術有限公司；乳清蛋白、海藻酸鈉、木糖醇、α-環狀糊精、海藻糖、麥芽糊精、乳糖醇、谷氨酸鈉 鄭州裕和食品添加劑有限公司。

FA2014N分析天平 北京東南儀誠實驗室設備有限公司；HR40-IIA2生物安全柜 青島海爾特種電器有限公司；YXQ-LS-18SI手提式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；DHP-9052電熱恒溫培養箱、HWS-26電熱恒溫水浴鍋、BYKFD-5真空冷凍干燥機 上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 二水平部分析因設計 通過二水平部分析因實驗設計（Fractional Factorial Design，FFD）分別研究乳清蛋白、海藻酸鈉、木糖醇、α-環狀糊精、海藻糖、麥芽糊精、乳糖醇、谷氨酸鈉對真空冷凍干燥酸馬乳粉中乳酸菌的保護作用，并對實驗結果進行回歸分析，篩選對酸馬乳粉中乳酸菌數有顯著影響的凍干保護劑。二水平部分析因實驗設計如表1所示。

表1 二水平部分析因設計因素與水平編碼值Table1 Factors，levels，and codes of two level fractional factorial design

1.2.2 最陡爬坡實驗 根據二水平部分析因實驗設計的結果，依據對酸馬乳粉中乳酸菌活菌數影響顯著的凍干保護劑的回歸系數確定相應的變化步長，運用最陡爬坡實驗快速逼近酸馬乳粉中乳酸菌活菌數最高的區域，從而確定各種保護劑的添加量范圍。

1.2.3 中心組合實驗 根據最陡爬坡實驗結果，利用中心組合實驗設計，以麥芽糊精、海藻糖和α-環糊精的添加量為考察因子，以酸馬乳粉中乳酸菌活菌數為響應值，建立響應值與考察因子之間的二次多項回歸模型。中心組合實驗設計因素與水平編碼值表見表2。

表2 中心組合實驗設計因素和水平編碼值Table2 Factors，levels，and codes of central composite design

1.2.4 檢測指標

1.2.4.1 活菌計數 酸馬乳中乳酸菌活菌計數采用改良MC瓊脂培養基傾注培養，放置于37℃恒溫培養箱中培養2 d；酸馬乳中酵母菌活菌計數采用孟加拉紅瓊脂培養基涂布培養，放置于28℃恒溫培養箱中培養2 d［11-12］。

1.2.4.2 酸馬乳粉含水量的測定 酸馬乳粉含水量的測定參照《GB 5009.3-2010食品中水分的測定》中直接干燥法［13］。

1.2.4.3 潤濕下沉性 精確稱取10.00 g酸馬乳粉，均勻分散在40℃水面上，分別在靜置和攪拌兩種情況下測定酸馬乳粉全部潤濕下沉的時間［14］。

1.2.4.4 沖調性 用40℃水250 mL沖調34.00 g的酸馬乳粉，攪拌后觀察酸馬乳的溶解性狀［15］。

1.3 數據處理

實驗數據利用Design-Expert 8.05軟件對回歸模型進行響應面優化，運用Sigmaplot 12.5繪制交互項三維響應面圖，通過SPSS 19.0軟件進行方差分析，p＜0.05具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 二水平部分析因設計結果

運用二水平部分析因設計實驗分別考察乳清蛋白、海藻酸鈉、木糖醇、麥芽糊精、海藻糖、α-環狀糊精、乳糖醇、谷氨酸鈉9種凍干保護劑對酸馬乳粉中乳酸菌活菌數和凍干存活率的影響，結果如表3所示。

對表3二水平析因設計實驗結果進行方差分析，結果如表4所示。由表4可知，在酸馬乳粉真空冷凍干燥過程中，在α=0.05的顯著性水平上，麥芽糊精、海藻糖添加量對酸馬乳粉中乳酸菌的活菌數有極顯著的影響，α-環狀糊精添加量有顯著影響，而且三種凍干保護劑對酸馬乳粉中乳酸菌活菌數的影響均為正效應，可考慮作為主要因素進一步做響應面實驗。對二水平部分析因設計結果進行一元線性回歸分析，得到酸馬乳粉中乳酸菌活菌數（Y）對麥芽糊精（D）、海藻糖（E）和α-環狀糊精（F）多元一次方程為：Y= 8.74+0.035D+0.029E+0.022F。

表3 二水平部分析因設計及結果Table3 The experiment design and results of two-level partial factorial design

表4 二水平部分析因設計方差分析Table4 Analysis of variance of the two-level partial factorial design

2.2 最陡爬坡實驗結果

由多元一次方程和相關系數可以看出，麥芽糊精（D）相關系數絕對值最大，因此選擇麥芽糊精（D）作為變量來定義步長。定義ΔXD=1.00為1個步長，則ΔXE=（0.029/0.035）ΔXD=0.83，ΔXF=（0.022/0.035） ΔXD=0.63。自然變量步長的相應變化為ΔD=ΔXD［（1-0.5）/2］=0.25，ΔE=ΔXE［（2-1）/2］=0.42，ΔF=ΔXF［（2-1）/ 2］=0.32，考慮實際實驗的方便性，調整麥芽糊精、海藻糖和α-環狀糊精步長分別為0.3、0.4、0.3下進行最陡爬坡實驗，實驗設計及結果如表5所示。在第五組（0+4Δ）實驗中，酸馬乳粉中乳酸菌活菌數最高，即選取麥芽糊精添加量2.2%、海藻糖添加量3.6%、α-環狀糊精添加量3.2%作為中心組合實驗的中心點。

表5 最陡爬坡實驗結果Table5 Results of the steepest ascent of experiment

2.3 酸馬乳粉凍干保護劑響應面優化

2.3.1 響應面實驗設計及結果 根據表6中心組合實驗設計結果進行回歸分析，得到酸馬乳粉中乳酸菌活菌數（Y）對麥芽糊精（A）、海藻糖（B）和α-環狀糊精（C）添加量的擬合方程為：Y1=8.94+0.0005A-0.028B-0.077C-0.064AB-0.051AC+0.0013BC-0.065A2-0.088B2-0.14C2。

表6 中心組合實驗設計及結果Table6 Experimental design and results of the central composite design

表7 回歸方程方差分析Table7 Analysis of variance of regression equations

由表7可以看出，本實驗建立的回歸模型F=30.92，p＜0.0001，表明回歸模型極顯著；而模型失擬項p= 0.3251＞0.05，說明模型失擬項不顯著，由此說明所建立的模型具有良好的顯著性。決定系數R2=0.9653，校正決定系數R=0.9341，表明該模型能較好擬合實際實驗中響應值的變化，利用此模型可以對真空冷凍干燥酸馬乳粉中乳酸菌活菌數進行分析和預測。從表7可以看出：在α=0.05的顯著水平上，一次項C、交互項AB、AC和二次項A2、B2、C2對真空冷凍干燥酸馬乳粉中乳酸菌活菌數的影響均為極顯著（p＜0.01），一次項B對真空冷凍干燥酸馬乳粉中乳酸菌活菌數存在顯著的影響（p＜0.05）。

2.3.2 響應面分析與優化 利用Design-Expert 8.05軟件對建立的回歸模型進行響應面優化，運用Sigmaplot 12.5繪制交互項三維響應面圖（圖1～圖3），可以比較直觀看出麥芽糊精、海藻糖和α-環狀糊精兩兩之間交互作用對真空冷凍干燥酸馬乳粉中乳酸菌活菌數的影響。從圖1可以看出，隨著麥芽糊精含量的增大，活菌數呈現先增大后減小的趨勢，整個曲面呈凸形，活菌數受海藻糖的影響大于麥芽糊精的含量；從圖2可以看出，隨著麥芽糊精含量的增大，活菌數呈現先增大后減小的趨勢，曲面弧度很陡，二者交互作用對響應值的影響比較明顯；從圖3可以看出，隨著海藻糖含量的增高，活菌數呈現先增大后減小的趨勢，曲面弧度比較陡峭。通過Design-Expert 8.05對建立的回歸方程進行參數最優化分析，可以得出酸馬乳粉中乳酸菌活菌數最高時麥芽糊精、海藻糖和α-環狀糊精的最佳添加量，即麥芽糊精2.28% （W/V）、海藻糖3.50%（W/V）、α-環狀糊精3.10% （W/V）。在此條件下，酸馬乳粉中乳酸菌活菌數預測值為8.9574 lg CFU/g。

圖1 麥芽糊精與海藻糖交互作用響應面圖Fig.1 Response surface for the effect of maltodextrin and trehalose on the viable count of LAB

圖2 麥芽糊精與α-環狀糊精交互作用響應面圖Fig.2 Response surface for the effect of maltodextrin and α-cyclodextrin on the viable count of LAB

2.3.3 驗證實驗 為檢驗所建立的多元回歸模型的準確性，同時考慮實驗操作方便，在麥芽糊精2.30% （W/V）、海藻糖3.50%（W/V）、α-環狀糊精3.10%（W/V）條件下進行酸馬乳真空冷凍干燥實驗，實驗平行3次，得到的真空冷凍干燥酸馬乳粉中乳酸菌活菌數平均值為（8.78±0.10）×108CFU/g，對數值為（8.9436±0.0051）lg CFU/g，與預測值較為接近，說明該模型準確可靠，能較好預測真空冷凍干燥酸馬乳粉中乳酸菌活菌數。

圖3 海藻糖與α-環狀糊精交互作用響應面圖Fig.3 Response surface for the effect of trehalose and α-cyclodextrin on the viable count of LAB

2.4 酸馬乳粉的感官指標

測定最佳工藝條件下制備的酸馬乳粉的感官指標，結果如表8所示。

提高酸馬乳粉中乳酸菌活菌數主要有兩條途徑，一是提高發酵酸馬乳中乳酸菌活菌數，二是提高真空冷凍干燥過程中乳酸菌的存活率。在酸馬乳粉真空冷凍干燥過程中，乳酸菌細胞暴露在多種應力下，從而導致菌體細胞機械損傷、細胞膜的流動性和完整性改變，細胞內蛋白變性失活，尤其是一些重要的蛋白酶或抑制因子，破壞pH的動態平衡、DNA損傷等［16］。研究表明，添加凍干保護劑，不僅可以提高乳酸菌的凍干存活率，還可提高其在貯藏期間的穩定性［17］。

通過二水平部分析因設計篩選出麥芽糊精、海藻糖和α-環狀糊精對酸馬乳粉中乳酸菌的活菌數和凍干存活率有顯著影響。海藻糖在凍干過程中對生物體和生物大分子的保護效果顯著，常用作乳酸菌發酵劑的凍干保護劑。蒲麗麗等發現，在冷凍干過程中海藻糖對嗜熱鏈球菌的凍干保護效果最好，而且嗜熱鏈球菌細胞飽滿，無變形、塌陷［18］。張玉華等發現，海藻糖可以與菌體蛋白和細胞膜磷脂的極性基團形成氫鍵，起到維持磷脂水化狀態和蛋白質二級結構穩定的作用［19］。麥芽糊精和α-環狀糊精均屬于高分子凍干保護劑，在凍干過程中通過包裹菌體，使其免受外熱源的熱傳導性和熱輻射性傷害，與小分子的凍干保護劑配合使用，可以加速升華，加速干燥，在凍干和貯藏期間維持較高的乳酸菌細胞存活率［20］。

表8 酸馬乳粉感官指標Table8 Sensory indexs of koumiss powder

酸馬乳粉的含水量是重要的質量指標之一，一定的含水量可以保持酸馬乳粉的品質，延長保質期，無論在質量和經濟效益上均起很大的作用。有研究報道，奶粉要求含水量為3.0%～5.0%，不能超過此范圍，若含水量大于5.0%，就易造成奶粉結塊，則商品價值就低，含水量過高，奶粉易變色，貯藏期降低，可能導致營養素損失、微生物滋長、奶粉結塊變質等問題。目前行業的平均水平控制在4.0%左右。

3 結論

通過二水平部分析因設計實驗及最陡爬坡實驗篩選出了對真空冷凍干燥酸馬乳粉中乳酸菌活菌數和存活率影響顯著的3種凍干保護劑，即麥芽糊精、海藻糖和α-環狀糊精，并確定了中心組合實驗中心實驗點。利用Design-Expert 8.05軟件對真空冷凍干燥酸馬乳粉中乳酸菌活菌數進行響應面優化，得到3種凍干保護劑的最優添加量為麥芽糊精2.30%（W/V）、海藻糖3.50%（W/V）、α-環狀糊精3.10%（W/V）。在此條件下制備的酸馬乳粉中乳酸菌活菌數為（8.78±0.10）×108CFU/g。真空冷凍干燥酸馬乳粉呈均勻乳白色，具有典型的酸馬乳風味，結構疏松，無結塊，沖調后無結塊，杯底有少量蛋白質沉淀，含水量為3.93%。

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Effect of protective agents on lactic acid bacteria of koumiss powder by vacuum freeze-drying

WANG Wei1，WANG Xiao-biao2，YIN Na3，ZHANG Ya-nan1，YANG Bo-ruo1，GU Li-nazi1，WU Yun1，*
（1.College of Food Science and Pharmaceutical Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China；2.Agricultural Products Quality and Safety Inspection Center，Changji 831100，China；3.College of Science and Technology，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China）

In order to improve the viable count of lactic acid bacteria in koumiss powder produced by vacuum freeze-drying，3 kinds of freeze-drying protective agents were screened by two level fractional factorial design，and the central point of response surface experiment was confirmed by the steepest ascent experiment.The optimal additions of 3 freeze-drying protective agents were 2.30%（W/V）of maltodextrin，3.50%（W/V）of trehalose and 3.10%（W/V）of α-cyclodextrin.Under the optimal conditions，the viable count of lactic acid bacteria in koumiss powder was up to（8.78±0.10）×108CFU/g.The freeze-drying koumiss powder had higher viable count of lactic acid bacteria and good flavor and quality，which could provide theoretical basis for processing of mare's milk and its'production.

koumiss powder；vacuum freeze drying；freeze-drying protective agents；the viable count of lactic acid bacteria

TS252.42

A

1002-0306（2016）06-0206-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.034

2015－08－03

王威（1991-），男，碩士研究生，研究方向：食品生物技術，E-mail：928178182@qq.com。

武運（1965-），女，碩士，教授，主要從事食品生物技術與食品安全方面的研究，E-mail：wuyunster@sina.com。

新疆維吾爾自治區科技廳重大專項目（201130101-4（2）-2）；“十二五”國家科技支撐項目（2012BAD44B01-05）；新疆農業大學科學技術學院大學生創新項目（2015KCX03）。