響應面法優化羅非魚皮酶法脫脂工藝

蔣 麗，陸劍鋒，呂 順，姜紹通，林 琳（合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽省農產品精深加工重點實驗室，安徽合肥230009）

響應面法優化羅非魚皮酶法脫脂工藝

蔣 麗，陸劍鋒，呂 順，姜紹通，林 琳*
（合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽省農產品精深加工重點實驗室，安徽合肥230009）

以羅非魚魚皮為原料，在單因素實驗基礎上，選取脫脂溫度、脫脂時間、加酶量為自變量，羅非魚皮脫脂率為響應值，利用Box-Benhnken中心組合設計和響應面分析法，對羅非魚皮酶法脫脂的工藝條件進行優化。結果表明：脂肪酶對羅非魚皮脫脂的最優工藝條件為pH9、加酶量0.5%、脫脂溫度39℃、脫脂時間56 min，在此條件下魚皮脫脂率為63.71%。

羅非魚皮，脂肪酶，脫脂，響應面分析，膠原蛋白

羅非魚（Oreochromis mossambicus）是我國重要的淡水養殖品種，2013年全球羅非魚年產量達300萬噸，其中中國養殖總量155萬噸，但羅非魚加工產品形態較單一，主要是條凍和魚片［1］。近年來，魚丸類的魚糜產品廣受歡迎，魚肉加工量驟增。在魚糜及魚糜產品加工特別是淡水魚的加工過程中，采肉率通常只有25%～30%左右，而剩余的60%～70%的魚體都成為副產品，包括魚皮、魚骨、魚頭和內臟等。目前，由于大多數水產加工企業的技術裝備較差，缺乏配套的工程化技術，水產加工副產物沒有得到充分的增值加工，利用程度較低。魚皮中富含膠原蛋白，從魚皮中提取膠原蛋白可大幅提高魚加工廢棄物的經濟價值，并可減少環境污染［2-3］。

膠原蛋白在食品、醫藥、美容行業應用廣泛［4］，但其提取工藝復雜且耗時長，在一定程度上增加了產品成本，限制了膠原蛋白的應用。魚較之于一些哺乳動物如豬、牛等生長周期更短，因此魚皮原料豐富，魚皮膠原蛋白的提取成本更低。另一方面，魚皮膠原蛋白也可避免某些宗教人群對于特定動物產品的排斥。從魚皮提取膠原蛋白的過程中，脫脂是一道關鍵工序，脫脂過程會直接影響膠原蛋白的提取效果和產品品質。傳統膠原蛋白提取工藝中，脫脂過程耗時較長。Nagai等［5］采用正丁醇浸泡方法對魚皮進行脫脂，耗時48 h左右，期間需要多次更換浸泡液。張強等［6］使用正己烷對鰱魚魚皮進行脫脂，耗時6 h，需2次更換浸泡液。楊萌萌等［7］在提取牛筋膠原蛋白時，使用10%丁酮脫脂需18 h。目前，對魚皮膠原蛋白提取的研究主要集中在提取方法的改進方面，以增加絕對提取率，而對脫脂工藝的研究較少且大多采用有機溶劑浸提法。與化學方法相比，酶反應方法效率更高且更安全，許曉紅等［8］采用脂肪酶分別對豬皮、牛皮、山羊皮和綿羊皮等原皮及其脫灰裸皮進行脫脂，發現脂肪酶對不同組織結構和不同油脂含量的動物原料皮的脫脂效果有較大差異，豬皮的脂肪酶脫脂效果良好，脫脂率可達67%。本文利用脂肪酶對羅非魚魚皮進行脫脂處理，以脫脂率為指標，優化羅非魚皮酶法脫脂的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

羅非魚（Oreochromis mossambicus）魚皮 廣東省明基水產品有限公司提供，-20℃保存；羥脯氨酸標準品 Sigma公司；豬胰脂肪酶（3000 U/g） 上海金穗生物科技有限公司；乳酸、正己烷、氫氧化鈉、醋酸鈉、氯化鈉、異丙醇、無水乙醚等化學試劑 均為分析純。

CT15RT臺式高速冷凍離心機 上海天美生化儀器設備工程有限公司；HH數顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；DHG-9123J精密恒溫鼓風干燥箱 上海三發科學儀器有限公司；722E型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；PHS-3C精密pH計 上海大普儀器有限公司；FD-1B-50冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 羅非魚魚皮基本成分的測定 水分：參考GB 5009.3-2010《食品中水分的測定》；灰分：參考GB 5009.4-2010《食品中灰分的測定》；蛋白質：參考GB 5009.5-2010《食品中蛋白質的測定》；脂肪：參考GB/ T 5009.6-2003《食品中脂肪的測定》。

1.2.2 羅非魚魚皮的預處理 4℃條件下，魚皮解凍、刮鱗、去掉魚皮內側殘留肉質、大片脂質后，用去離子水洗凈，瀝干后將魚皮剪成碎片（5 mm×5 mm），用濾紙吸去表面水分，放入保鮮袋中于-20℃凍藏備用。

1.2.3 羅非魚皮酶法脫脂單因素實驗 冷凍羅非魚皮解凍后，用濾紙吸干表面水分。取適量魚皮在特定溫度、pH、反應時間、加酶量的反應液中脫脂。脫脂后，用去離子水反復洗滌魚皮，置于105℃烘箱內干燥3 h，稱重。

參考脂肪酶的最適反應條件，分別考察反應液pH、反應溫度、反應時間和加酶量對羅非魚皮脫脂率的影響。各組實驗條件分別為：考察溫度對羅非魚皮酶法脫脂率影響時，反應時間設定60 min，加酶量0.5%，pH9，測定反應溫度分別為29、34、39、44、49℃時羅非魚皮的脫脂率；考察pH對羅非魚皮酶法脫脂率影響時，反應時間設定60 min，加酶量0.5%，反應溫度為39℃，測定pH分別為7、8、9、10、11時羅非魚皮的脫脂率；考察加酶量對羅非魚皮酶法脫脂率影響時，反應時間設定60 min，反應溫度為39℃，pH9，測定加酶量分別為0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%時羅非魚皮的脫脂率；考察反應時間對羅非魚皮酶法脫脂率影響時，反應溫度設定39℃，加酶量0.5%，pH9，測定反應時間分別為40、55、70、85、100 min時羅非魚皮的脫脂率。

1.2.4 脫脂率的計算 采用索氏抽提法，測定脫脂前魚皮脂肪含量并通過魚皮脫脂前后質量變化計算出脂肪脫除量，按式（1）計算脫脂率。

其中：m0為脫脂前羅非魚皮質量（g）；m1脫脂后羅非魚皮質量（g）；m為脫脂前羅非魚皮中脂肪含量（g）。

1.2.5 羅非魚皮酶法脫脂工藝條件的響應面優化 采用方差分析對4組單因素水平進行篩選，最終選取脫脂溫度、脫脂時間和加酶量為主要考察因素。按Box-Benhnken中心組合實驗設計原理設計3因素3水平響應面實驗，以脫脂率為響應值，確定羅非魚皮酶法脫脂工藝條件。實驗因素與水平設計見表1。

表1 Box-Benhnken中心組合實驗因素水平編碼表Table1 Factors and levels of Box-Benhnken experimental design

1.3 數據處理

數據用均值±標準差表示（x±s），采用Microsoft Excel 2010及Design Expert 8.0.6軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 羅非魚魚皮的基本組成成分

表2中列出了羅非魚魚皮的基本化學成分，從表2中可以看出，羅非魚魚皮中水分含量為64.02%，干物質是羅非魚皮中除去水分后的物質總量，為35.98%，干物質中主要為蛋白質，約占干物質總量的94.88%。

表2 羅非魚魚皮基本化學組成（以濕基計）Table2 Basic chemical composition of tilapia skin（wet basic）

2.2 羅非魚魚皮酶法脫脂單因素實驗結果及分析

圖1 溫度對羅非魚皮脫脂率的影響Fig.1 Effect of temperature on defatted rate of tilapia skin

2.2.1 溫度對羅非魚皮脫脂率的影響 溫度對羅非魚皮脫脂率的影響見圖1，單因素方差分析結果表明，在溫度29～49℃范圍內，溫度對羅非魚皮脫脂率有顯著影響（p＜0.05）。從圖1中可以看出，隨著溫度的升高，魚皮脫脂率逐漸升高，在44℃時，脫脂率達到最大值。當溫度超過44℃后，繼續升高溫度，脫脂率緩慢降低。考慮到溫度過高易使膠原蛋白發生變性，影響提取效果，且溫度也會在一定程度上影響生產成本，同時從實驗結果來看，在39℃時魚皮脫脂率達到64%，與44℃時的脫脂率（65.20%）僅差1.20%，統計學上無顯著差異，所以選定39℃為響應面實驗中溫度的中心水平。

2.2.2 pH對羅非魚皮脫脂率的影響 pH對羅非魚皮脫脂率的影響見圖2，單因素方差分析結果表明pH對羅非魚皮脫脂率的影響不顯著（p＞0.05）。從圖2中可以看出，隨著pH的升高，魚皮脫脂率略有升高，并在pH9時，魚皮脫脂率達到最大值。當pH超過9后，繼續升高pH，脫脂率緩慢下降。原因是酶的活性基團的解離受pH影響，過高或過低的pH都會影響酶分子活性中心的構象［9］，從而影響酶的催化效果。由于pH對魚皮脫脂率的影響不顯著，因此在后續實驗中將脫脂條件設定為pH9，此因素不計入響應面實驗進行研究。

圖2 pH對羅非魚皮脫脂率的影響Fig.2 Effect of pH on defatted rate of tilapia skin

2.2.3 加酶量對羅非魚皮脫脂率的影響 加酶量對羅非魚皮脫脂率的影響見圖3，單因素方差分析的結果表明，在加酶量0.3%～0.6%范圍內，加酶量對羅非魚皮脫脂率有顯著影響（p＜0.05）。從圖3中可以看出，當加酶量低于0.5%時，隨著加酶量的升高，魚皮脫脂率逐漸升高，并在加酶量等于0.5%時，脫脂率達到最大值。加酶量高于0.5%后繼續添加，脫脂率緩慢下降并趨于穩定值。所以選定0.5%為響應面實驗中加酶量的中心水平。

圖3 加酶量對羅非魚皮脫脂率的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on defatted rate of tilapia skin

2.2.4 反應時間對羅非魚皮脫脂率的影響 反應時間對羅非魚皮脫脂率的影響見圖4，單因素方差分析的結果表明，在反應時間40～70 min范圍內，反應時間對羅非魚皮脫脂率有顯著影響（p＜0.05）。從圖4中可以看出，隨著反應時間的延長，魚皮脫脂率逐漸升高，并在反應時間等于55 min時，脫脂率達到最大值。繼續延長反應時間，脫脂率緩慢下降。所以選定55 min為響應面實驗中脫脂時間的中心水平。

圖4 反應時間對羅非魚皮脫脂率的影響Fig.4 Effect of time on defatted rate of tilapia skin

2.3 羅非魚皮酶法脫脂最佳工藝條件的確定

2.3.1 響應面分析實驗結果 對酶法羅非魚皮脫脂工藝進行響應面優化，實驗結果見表3。通過數據分析軟件Expert Design 8.0.6對表3中響應值與各因素進行回歸擬合后，得到脫脂率（Y）對溫度（X1）、時間（X2）和加酶量（X3）的二次多項回歸方程為：

表3 響應面分析實驗結果Table3 The results of response surface analysis

回歸模型各項系數的顯著性檢驗結果和方程的方差分析結果見表4。由表4可以看出，模型極顯著（p＜0.0001），說明該模型成立，本實驗方法可靠［10］。失擬項不顯著（p=0.0928＞0.05），總決定系數R2=0.9984，表明回歸方程無失擬因素存在，回歸方程擬合度較好，在實驗范圍內可以用來解釋和預測實驗結果。方程一次項和二次項的影響均極顯著；交互作用項中，X2（時間）和X3（加酶量）（p=0.24548＞0.05）交互作用不顯著，X1（溫度）和X2（時間）（p＜0.0001）、X1（溫度）和X3（加酶量）（p＜0.0001）交互作用極顯著。由此可知，各因素對魚皮脫脂率的影響不是簡單的線性關系。

表4 方差分析表Table4 Analysis of variance

2.3.2 響應面圖分析 響應面圖能直觀地反映各因素和及其之間的交互作用對響應值的影響［10-11］。根據上述二次多項回歸方程所做的響應面圖如圖5～圖7所示。從圖5、圖7中可以看出，隨著脫脂時間的延長，魚皮脫脂率呈現先升高后緩慢降低的現象，反應溫度對脫脂率的影響也表現出類似的效果（見圖5、圖6）。溶液中的反應受限于溶質間的傳質速率，而傳質速率是隨時間變化的［12］。反應初期，時間持續增加，反應傳質速率增加，脫脂率升高；時間達到某一定值（約為55 min）后，魚皮脫脂反應產生的大量游離脂肪酸和甘油酯重新合成大分子脂質［9，13］，體系中總脂質含量回升，表現為脫脂率下降。酶反應需要在一定的溫度和pH條件下進行。本實驗中使用的脂肪酶為蛋白酶，當溫度逐漸升高至酶最適溫度過程中，魚皮脫脂率逐漸升高；當溫度繼續升高時，高溫使酶發生不同程度的變性，降低酶對脫脂反應的催化效果，魚皮脫脂率下降。加酶量對魚皮脫脂率的影響類似于反應時間和反應溫度（見圖6、圖7）。堿性脂肪酶催化油脂水解的反應是可逆的，逆向反應時發生了酯交換，酯交換使游離脂肪酸重新合成大分子的甘油酯［9，13］。新甘油酯增加了反應體系的脂含量，表現為脫脂率緩慢下降的現象。

從圖5～圖7中可以看出，脫脂溫度與加酶量、脫脂時間與脫脂溫度交互作用圖為橢圓形，交互作用項系數顯著（p＜0.01）。魚皮脫脂率與脫脂時間、脫脂溫度、加酶量交互作用較為復雜，隨著各因素的水平值增加，脫脂率會出現一個峰值；當繼續升高各水平值時，脫脂率又會隨之下降。每個因素及其之間的交互作用對脫脂率的影響也存在差異。脫脂溫度、加酶量、脫脂時間、脫脂溫度與加酶量、脫脂時間與脫脂溫度對魚皮脫脂率的影響極其顯著。由F值可知，實驗因素對脫脂率影響的主次順序為：X3＞X2＞X1，即加酶量＞時間＞溫度。

圖5 反應時間與反應溫度對脫脂率的影響Fig.5 The effects of reaction time and temperature on defatted rate

圖6 反應溫度與加酶量對脫脂率的影響Fig.6 The effects of reaction temperature and enzyme dosage on defatted rate

圖7 反應時間與加酶量對脫脂率的影響Fig.7 The effects of reaction time and enzyme dosage on defatted rate

2.4 羅非魚皮酶法脫脂工藝條件的確定和驗證實驗

結合回歸模型的數學分析可知，羅非魚魚皮酶法脫脂的最佳工藝為：脫脂時間56.08 min、加酶量0.52%、脫脂溫度39.51℃，在此條件下預測魚皮脫脂率為65.58%。為了驗證結論的可靠性，按照最佳脫脂條件進行驗證實驗。考慮到實驗操作的可行性，將最佳脫脂條件修正為脫脂時間56 min、加酶量0.5%、脫脂溫度39℃（因膠原蛋白在高溫條件下易發生變性，將最佳脫脂工藝中魚皮脫脂溫度修正為稍低的溫度），在此條件下測定的魚皮脫脂率為63.71%，與理論預測值的誤差為1.87%，說明采用響應面法優化得到的脫脂條件可靠。

李佳［14］在制備羅非魚魚皮明膠的過程中，使用脂肪酶對羅非魚皮脫脂，采用正交實驗法優化得到最佳脫脂工藝為：pH9，脫脂時間3 h，脫脂溫度40℃，加酶量2%，脫脂率為67.5%。本實驗無論是原料還是采用的方法都與李佳的研究類似，從實驗結果比較來看，與其得到的實驗結果相比，本實驗得到的酶法脫脂工藝條件加酶量更少，脫脂時間縮短2 h。但是，由于原料魚皮的脂肪含量和脂肪酶的來源、特性等均會對脫脂過程造成影響，因此不能只單純從優化得到的具體工藝條件進行比較，還需考慮其他因素的影響。

由于整個脫脂過程是一個酶反應，酶反應具有一定的特殊性，如反應的可逆性、酶與底物的比例是否合適等。通過實驗及與李佳的研究結果比較來看，原料魚皮的脂肪含量可能會對實驗結果產生影響，這可能會對本實驗結果的進一步應用產生一定的限制，因此，在后續的研究中，將重點考察不同脂肪含量的魚皮原料以及酶與底物的比例對酶法脫脂效果的影響，為此方法在更廣泛的領域中應用提供參考。

3 結論

利用脂肪酶對羅非魚皮進行脫脂，通過單因素實驗和響應面法分析，考察反應時間、溫度、加酶量和pH對魚皮脫脂率的影響，并對羅非魚皮酶法脫脂的工藝條件進行優化，得到羅非魚皮酶法脫脂的最佳工藝為：脫脂時間56 min、加酶量0.5%、脫脂溫度39℃，pH9，在此條件下，魚皮的脫脂率為63.71%。脂肪酶法脫脂工藝可大大縮短魚皮脫脂處理的時間，較有機溶劑脫脂方法更安全。

經本實驗脫脂處理的羅非魚將用于魚皮提取膠原蛋白，由于脂肪酶的使用（主要是處理溫度和酶對魚皮的作用兩方面）可能會對魚皮膠原蛋白的性質產生影響，因此，后續實驗將進一步研究脂肪酶法脫脂工藝對提取膠原蛋白理化特性的影響，探討魚皮脂肪酶脫脂的方法在實際膠原蛋白生產中應用的可行性。

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Optimization of enzymatic defatted conditions of tilapia skin by response surface methodology

JIANG Li，LU Jian-feng，LV Shun，JIANG Shao-tong，LIN Lin*
（College of Biotechnology and Food Engineering，Key Laboratory for Agriculture Products Processing of Anhui Province，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China）

In this study，the tilapia skin was as the raw material，and the lipase was used to remove fat from tilapia skin.On the basis of single-factor experiments，Box-Behnken central composite design combined with response surface methodology（RSM）was utilized to optimize the defatted conditions of tilapia skin.Three variables（defatted temperature，defatted time and enzyme dosage）were involved in this experiment，and the defatted rate was as the measure indicator.The results showed that the optimum defatted conditions for tilapia skin were pH9，enzyme dosage 0.5%，temperature 39℃，and defatted time 56 min.The defatted rate at this condition could reach 63.71%.

tilapia skin；lipase；defatted；response surface analysis；collagen

TS254.9

A

1002-0306（2016）06-0211-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.035

2015-07-02

蔣麗（1990-），女，碩士研究生，研究方向：水產品加工副產物綜合利用，E-mail：904582736@qq.com。

林琳（1978-），女，博士，副教授，研究方向：水產活性物質及功能特性，E-mail：linlin7805@163.com。

安徽省“115”產業創新團隊項目（2012d5t146）；廣東省部產學研結合重點項目（2012B091000121）。