白鰱魚頭蛋白酶解工藝研究

閆靜芳，張麗娟，顏智勇，王龍剛，武奔月，張生生，王昱灃，*（.南京農業大學食品科技學院，江蘇南京0095；.江蘇聯益生物科技有限公司，江蘇盱眙700）

白鰱魚頭蛋白酶解工藝研究

閆靜芳1，張麗娟1，顏智勇2，王龍剛2，武奔月1，張生生1，王昱灃1，*
（1.南京農業大學食品科技學院，江蘇南京210095；2.江蘇聯益生物科技有限公司，江蘇盱眙211700）

以白鰱魚下腳料中最為重要的魚頭為原料，以水解液中氨基氮含量為指標，比較了木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶5種酶的水解效果，從中選出最佳水解酶，在單因素實驗基礎上對其水解工藝進行正交實驗優化，并對其水解產物中游離氨基酸組成進行分析。結果表明：胰蛋白酶對魚頭蛋白的水解效果最佳，最佳工藝條件為水解溫度55℃，pH8.0，料水比1∶3（g/mL），加酶量80 U/g，在此條件下水解液中游離氨基氮含量為63.69 mg，水解液中游離氨基酸含量較高。

白鰱魚頭，酶解，氨基氮，氨基酸

低值水產蛋白質主要包括低值魚及水產加工副產物，這類原料鮮銷價值較低，但因其加工復雜，目前主要的加工方法是加工成魚粉或直接作為飼料。我國水域遼闊，淡水魚資源豐富，占我國漁業產量的40%以上［1］，然而數據顯示我國淡水魚的加工率僅為14.1%［2］，而下腳料的加工產業更是少見，因此，積極開展淡水魚特別是低值水產蛋白的深加工勢在必行。

自1946年聯合國糧農組織（VAO）倡導開發未利用或低利用的漁業資源以來，世界各國己開展了大量的魚類加工方面的研究［3］，而魚類蛋白質的酶水解是一個非常重要的利用方式。魚蛋白質經酶作用降解，功能和品質都得到提高［4］。國外對魚蛋白水解的利用主要針對近海魚，這與當地的資源和條件有關［5-7］，目前，日本、西歐和美國己有此方面的產品問世，許多新產品也正在研制開發中。與國外相比，國內關于魚蛋白水解技術尤其是下腳料深加工方面的研究相對滯后，以魚蛋白水解物為基料的醫藥品和食品幾乎沒有［8］。導致大量的淡水魚資源得不到充分利用。

鰱魚是四大家魚之一，也是一種產量很大的淡水魚，其營養豐富，蛋白質含量高，但食用價值較低，加工下腳料利用率低［9-10］，不僅造成了資源的浪費，還會導致環境污染，而鰱魚頭作為下腳料中最重要的一部分，占魚體總重的24%～34%，含有蛋白質、脂肪、鈣、鐵、磷等多種營養成分，具有較高的利用價值。本文研究了鰱魚頭蛋白的酶解技術，并對其水解產物進行氨基酸分析，不僅為鰱魚下腳料的深加工及高值化利用提供了理論依據，更可以減少資源浪費和環境污染。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鰱魚頭 童衛路菜市場；木瓜蛋白酶（65萬U/g）、胰蛋白酶（4000 U/g）、中性蛋白酶（20萬U/g）、堿性蛋白酶（20 U/g）、風味蛋白酶（20萬U/g） 廣西南寧龐博生物有限公司；NaOH、HCl、甲醛等均為分析純 南京試劑有限公司。

JYL-Y3九陽營養破壁調理機 九陽股份有限公司；CP124C先行者精密電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽 上海森信實驗儀器有限公司；TDZ5-WS離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司；MS-H280-Pro LED數顯加熱型磁力攪拌器 上海漢林實驗儀器有限公司；L-8900全自動氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚頭蛋白水解液的制備 將鰱魚頭洗凈后放入JYL-Y3九陽營養破壁調理機打漿，分別取15 g魚漿于100 mL錐形瓶中，加入一定比例的蒸餾水，調節pH，在設定水解溫度下保溫15 min，待水解魚漿達到水解溫度，加入蛋白酶水解，水解結束后沸水浴滅酶10 min，冷卻后于5000 r/min離心15 min，取上清液即為蛋白水解液。

1.2.2 蛋白酶的選擇 分別以木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶為水解酶，由于單位質量的5種蛋白酶價格相近，因此在酶的選擇中，從生產成本角度考慮，選擇酶用量均為0.08 g，料水比為1∶2（g/mL）。

不同種類蛋白酶的最適反應條件不同，選用木瓜蛋白酶［11］的水解溫度為55℃，pH為6.5；胰蛋白酶［12］的水解溫度為50℃，pH為7.5；風味蛋白酶［13］的水解溫度為50℃，pH為7.0；中性蛋白酶［14-15］的水解溫度為55℃，pH為7.5；堿性蛋白酶［16］的水解溫度為50℃，pH為8.0，分別水解1、2、3、4、6 h，以水解液中游離氨基氮含量為指標，篩選出最佳蛋白酶。

1.2.3 單因素實驗 以最佳蛋白酶為水解酶，稱取15 g魚頭漿，選取料水比、水解溫度、pH、加酶量四因素進行單因素實驗，固定水解時間3 h，測定水解液中氨基氮含量。

1.2.3.1 加酶量的確定 固定溫度50℃，pH7.5，料水比1∶2，加酶量分別為10、20、40、60、80 U/g。

1.2.3.2 料水比的確定 固定溫度50℃，pH7.5，加酶量0.08 g，設定料水比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5。

1.2.3.3 反應溫度的確定 固定料水比1∶2，pH7.5，加酶量0.08 g，設定溫度分別為40、45、50、55、60℃。

1.2.3.4 水解pH的確定 固定溫度50℃，料水比1∶2，加酶量0.08 g，設定pH分別為5、6、7、8、9。

1.2.4 正交實驗 根據單因素實驗結果，確定正交實驗參數范圍，以水解液中游離氨基酸含量為指標，對加酶量、料水比、水解溫度、pH進行L9（34）正交優化，因素水平見表1，實驗重復三次。

1.2.5 游離氨基氮含量測定 精確量取水解液5 mL，加入60 mL蒸餾水稀釋，采用甲醛滴定法［17］測定水解液中氨基氮含量。因氨基酸分析儀成本較高，在蛋白酶選擇和優化實驗中無需測定氨基酸種類，甲醛滴定法即可滿足測量需求，且測量簡單快速，因此，采用甲醛滴定法測定游離氨基氮含量。

表1 L9（34）正交實驗因素水平表Table1 Factors and levels of L9（34）orthogonal test

1.2.6 酶解液中游離氨基酸分析 在最佳條件下分別水解鰱魚頭蛋白2、4、6、9、12、15 h，得到不同時間的水解液，分別取不同水解時間的水解液2 μL，用超純水稀釋500倍，0.45 μm親水濾膜過濾，采用全自動氨基酸分析儀測定水解液中游離氨基酸的種類及含量。

1.2.7 數據統計方法 文中所有數據均取三次重復實驗的平均值，采用Origin 8.0軟件作圖，SAS軟件進行顯著性分析，顯著水平p＜0.05。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的選擇

由于不同蛋白酶的水解位點不同，產物分子量、功能特性及氨基氮含量等都存在明顯差異，選擇合適的蛋白酶對提高水解效率具有重要意義。實驗采用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶，分別在較適條件下進行水解，測定不同時間游離氨基氮含量，實驗結果如圖1所示。

圖1 最佳水解酶的選擇Fig.1 The select of the best hydrolysis enzyme

從圖1中可以看出，隨著水解時間的延長，水解液中游離氨基氮含量呈明顯的上升趨勢，其中，胰酶的水解效果最好，水解1～6 h水解液中游離氨基氮含量由19.34 mg增至27.45 mg，而其余4種酶水解效果差異不顯著。水解效果最差的為木瓜蛋白酶，當水解時間從1 h延長至6 h，水解液中氨基氮含量僅從13.98 mg增至21.80 mg。因此，實驗選擇胰蛋白酶進行后續實驗。

2.2 單因素實驗

2.2.1 加酶量對水解效果的影響 如圖2所示，隨著酶用量的增加，水解液中氨基氮含量不斷增加，但超過40 U/g時，水解效果變化并不顯著。這是因為，在酶促反應中，當有充足的底物存在時，酶促反應速率隨酶濃度增加而加快［18］；但當酶濃度超過一定水平，由于底物被酶飽和，沒有多余的底物與之結合，酶促反應速率便不再增加，此時，加酶量的增加不僅不會使反應速率加快，反而造成了酶的浪費，使成本增加。因此，實驗選取40、60、80 U/g為正交實驗中考察酶用量的水平。

圖2 酶用量對水解效果的影響Fig.2 The effect of enzyme concentration for hydrolysis

2.2.2 料水比對水解效果的影響 料水比的大小影響酶與底物的結合程度［19］，料水比過低，酶與底物分布不均勻，降低了酶與底物的結合程度，實驗結果如圖3所示。從圖3中可以看出，當料水比從1∶1增加到1∶3時，水解液中游離氨基氮含量明顯增加，超過1∶3后水解效果差異并不顯著，且當料水比為1∶4時氨基氮含量達到最大值24.85 mg。因此，實驗選擇1∶3、1∶4、1∶5作為正交實驗中考察料水比的三個水平。

圖3 料水比對水解效果的影響Fig.3 The effect of the ratio of water to materials for hydrolysis

2.2.3 水解溫度對水解效果的影響 溫度對酶促反應具有較大影響，每種酶促反應都有一個最適溫度。由圖4可知，40～50℃時隨著溫度的增長，水解液中氨基氮含量呈增加的趨勢，當溫度達到50℃時達到最大值27.53 mg，繼續增加溫度，水解液中氨基氮含量開始降低，但經顯著性分析得出，溫度為45、50、55℃時，氨基氮含量差異并不顯著。因此，實驗選擇45、50、55℃為正交實驗中溫度的三個水平。

圖4 水解溫度對水解效果的影響Fig.4 The effect of hydrolysis temperature for hydrolysis

溫度的改變不僅影響胰蛋白酶的穩定性，還會影響胰蛋白酶酶促反應中的締合解離平衡、酶-底物絡合物的締合解離以及底物溶解度等。當溫度較低時，和普通化學反應一樣，升高溫度可加快反應速率，因此，隨著溫度升高，胰蛋白酶的水解效率升高，游離氨基酸含量不斷增大，但酶本身是一種蛋白質，在高溫下其空間結構發生改變，導致變性失活，酶促反應效率降低，水解液中氨基酸含量開始降低，且溫度越高酶的變性程度越大，導致55℃后氨基酸含量迅速降低。酶的最適溫度并不是一個固定值，底物濃度、離子強度、反應時間以及pH等均會影響胰蛋白酶促反應的最適溫度［20］。

2.2.4 pH對水解效果的影響 當pH改變時，水解液中氨基氮含量變化如圖5所示。從圖5中可知，當pH＜8時，水解液中氨基氮含量隨pH的增大明顯增加，并在pH8.0時達到最大值26.27 mg；但當pH繼續增大時，水解液中氨基氮含量顯著降低。由于實驗所用胰酶對pH較為敏感，為了精確考察水解的最佳pH，實驗選擇了7.5、8.0、8.5為正交實驗中考察pH的水平范圍。

圖5 pH對水解效果的影響Fig.5 The effect of pH for hydrolysis

pH對酶活性的影響主要表現在兩方面：pH變化改變了底物分子和酶分子的帶電狀態，從而影響底物和酶的結合；過高或過低的pH都會影響酶分子的穩定性，進而導致其變性失活。一般情況下，胰蛋白酶最適pH為7，此時水解效率最高，高于或低于此pH時，酶分子與底物結合能力減弱，穩定性降低，導致水解液中氨基酸含量顯著降低。但酶的最適pH受多種因素影響，如酶的來源、純度、底物種類、反應體系中的鹽類、反應溫度等［21］。

2.3 正交實驗結果

正交實驗結果見表2。由k值可得水解條件的最佳組合為A3B2C1D3，即水解溫度55℃，pH8.0，料水比1∶3，加酶量80 U/g。各因素對酶解效果的影響順序為：D＞A＞B＞C，即加酶量＞溫度＞pH＞料水比，恰為正交實驗中的實驗8。三次驗證實驗表明，此時的含量為（63.69±0.5143）mg。

表2 正交實驗結果Table2 Combinations and results of orthogonal test

2.4 水解液中游離氨基酸分析

在蛋白質酶解過程中，不同程度的酶解產物含有的氨基酸種類及含量有很大差異，這在美拉德反應生產香味物質中具有較大影響。表3為不同水解時間的水解液中氨基酸組成分析。

從表3結果中可看出，鰱魚頭蛋白水解液中的氨基酸含量較高，種類較為齊全，且包含了除色氨酸外的所有必需氨基酸，具有很高的應用價值。總體來看，隨著酶解時間的延長，氨基酸總量呈增長的趨勢，且在2～9 h增長較快，之后變化不大，甚至出現了下降的趨勢，這可能是由于合成了類蛋白的緣故。在魚頭水解液中，含量較高的氨基酸有亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸等，但半胱氨酸和脯氨酸的含量較低，其中，半胱氨酸在美拉德反應中可合成肉類香味化合物的中間體，對于肉味的產生極為重要，而脯氨酸可形成烤香味［22］，因此，在以該水解液為原料生產香味物質過程中，應根據實際需要添加合適的氨基酸化合物，以提高水解液的利用程度，節約成本，減少浪費。

3 結論

比較了木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶5種酶的水解白鰱魚頭的效果，得到胰蛋白酶為最適水解酶，并通過單因素和正交實驗確定最佳酶解工藝條件為：水解溫度55℃，pH8.0，料水比1∶3，加酶量80 U/g，在此條件下水解液中游離氨基氮含量為（63.69±0.5143）mg，經檢測，水解液中氨基酸含量較高，種類齊全。

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表3 胰酶酶解魚頭蛋白過程中游離氨基酸組成（μg/mL）Table3 Changes in free amino acid composition during the hydrolysis of fish head protein by trypsin（μg/mL）

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Enzymatic hydrolysis process of silver carp head

YAN Jing-fang1，ZHANG Li-juan1，YAN Zhi-yong2，WANG Long-gang2，WU Ben-yue1，ZHANG Sheng-sheng1，WANG Yu-feng1，*
（1.College of Food Science and Technology，Nanjing Angricultural Univeisity，Nanjing 210095，China；2.Jiangsu Lian Yi Biotechnology Limited Company，Xuyi 211700，China）

In this paper，the head of silver carp，the most important part of fish byproducts were taken as raw materials.The hydrolysis effects of papain，trypsin，flavourzyme，neutral protease and alkali protease were compared and selected，with the content of amino nitrogen in the hydrolysate as an index.The hydrolysis process was optimized by orthogonal tests on the basis of single factor，and the composition of free amino acid in hydrolysate was analyzed.The results showed that trypsin could be selected as the best hydrolysis enzyme，and the maximal content of amino nitrogen in hydrolysate reached 63.69 mg with the following conditions：hydrolysis temperature of 55℃，pH8.0，the ratio of water to materials 1∶3，enzyme concentration 80 U/g，and the content of free amino acid in hydrolysate was higher.

silver carp head；enzymatic hydrolysis；amino nitrogen；amino acid

TS254.5

A

1002-0306（2016）06-0221-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.037

2015－07－17

閆靜芳（1990-），女，在讀碩士研究生，主要從事食品工程方面的研究，E-mail：2014808102@njau.edu.cn。

王昱灃（1976-），男，博士，副教授，主要從事生物工程和食品科學方面的研究，E-mail：Joywangyu@sina.com。

南京農業大學研究生工作站和江蘇省研究生工作站（南京農業大學-江蘇聯益生物科技有限公司）項目；江蘇省科技項目蘇北科技專項（BN2015071）。