泡菜中優良乳酸菌篩選及特性的研究

李 靜，王 瑤，鄧毛程（廣東輕工職業技術學院，廣東廣州510300）

泡菜中優良乳酸菌篩選及特性的研究

李 靜，王 瑤，鄧毛程*
（廣東輕工職業技術學院，廣東廣州510300）

為了獲得適用于純種強化發酵泡菜生產的優良菌種，采用平板篩選法和發酵篩選法從泡菜中分離、篩選乳酸菌，采用形態、生理生化和16S rDNA等特性的分析技術對優選菌種進行鑒定，并通過發酵實驗進一步研究優選菌種的發酵特性。經篩選，獲得一株乳酸產量最高的菌種LP-09，該菌種被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。發酵實驗結果表明，菌種LP-09的最適溫度和初始pH分別為37℃和6.0，具有較強的耐鹽性，在含有40 g/L NaCl的培養基中生長正常，在含有100 g/L NaCl的培養基中可緩慢發酵產酸；同時，菌種LP-09具有較強的亞硝酸鹽降解能力，對200 mg/L亞硝酸鹽的降解率可達99.3%以上。

植物乳桿菌，篩選，耐鹽，亞硝酸鹽

泡菜具有美味、爽口、開胃等特點，是我國已有三千多年歷史的傳統發酵食品［1］。乳酸菌是泡菜制作過程中的優勢微生物，對泡菜品質具有重要影響［2］。隨著對食品安全要求的提高，我國傳統泡菜行業正朝著生產工業化和產品標準化的方向而發展，乳酸菌強化發酵技術已成為了改良傳統泡菜的重要手段［3］。

優良乳酸菌是實現純種強化發酵泡菜的前提，多年來人們一直致力于優良乳酸菌篩選的研究工作。通過對泡菜中微生物的分離與鑒定，乳桿菌屬（lactobacillus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）被確認為泡菜發酵的優勢菌群［2-4］。研究人員已從泡菜中獲得一些具有較強產酸和耐鹽性能的植物乳桿菌（lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（lactobacillus brevis）、副干酪乳桿菌（lactobacillus paracasei）和戊糖乳桿菌（lactobacillus pentose）等［5-6］，同時也發現一些植物乳桿菌降解亞硝酸鹽的能力較強［7-8］。泡菜發酵對乳酸菌的產酸、耐鹽和降亞硝酸鹽等性能均有要求，由于傳統泡菜發酵通常由混合菌群協同完成，盡管現已分離出不少優良乳酸菌，但單一菌種較難同時滿足幾方面性能的要求，使純種強化發酵泡菜的實施受到一定的限制。本實驗從泡菜中篩選乳酸菌，以期獲得兼有產酸、耐鹽和降亞硝酸鹽等方面良好性能的優良菌種，并初步研究菌種的特性，為泡菜工業化生產提供有益的幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

泡菜 購于廣東省雷州市菜市場；乳酸 色譜純；葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、松三糖、葡萄糖、乙酸鈉、檸檬酸三銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、Tween-80 分析純；酪蛋白胨、牛肉粉、酵母粉 市售生化試劑；MRS培養基 酪蛋白胨10.0 g，牛肉粉8.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，硫酸鎂0.2 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸錳0.05 g，吐溫1.0 g，蒸餾水1000 mL，pH6.2±0.2。

FA2204型電子分析天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；JA5003型精密電子天平 杭州中拓儀器有限公司；YX-280D型蒸汽滅菌器 合肥華泰醫療設備有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；SPX-100-Z型生化培養箱上海博訊實業有限公司醫療設備廠；A200型基因擴增儀 杭州朗基科學儀器有限公司；RDY-SP1Z型核酸電泳儀 北京榮陽經典科技有限公司；GI-1型凝膠成像系統 通寶達成科技（北京）有限公司；S-3000N型掃描電鏡 日本日立公司；H-7650型透射電鏡 日本日立公司；Essentia LC-15C型高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.2 乳酸菌的篩選

采用含有15 g/L CaCO3的MRS瓊脂培養基制作分離平板，將泡菜汁進行梯度稀釋，涂布于平板上，置于37℃下培養36～48 h，挑取周圍有明顯透明圈的單菌落，再在無菌的分離平板上進行劃線分離，然后將純化后的單菌落挑取至斜面，培養后保藏備用。將各菌株的斜面菌種分別接入含有20 g/L葡萄糖的MRS培養基中，置于37℃下培養48 h，采用液相色譜法分析發酵液中的乳酸產量，優選乳酸產量最高的菌株進行進一步的研究。

1.3 乳酸菌的鑒定

分別利用普通光學顯微鏡、掃描電鏡和投射電鏡對優選菌種的菌體進行觀察。按照《Bergy's Manual of Determinative for Bacteriology》中生理生化分析方法［9］，對菌種進行過氧化氫酶實驗、吲哚實驗、甲基紅實驗、硝酸鹽還原實驗、淀粉水解實驗、明膠液化實驗以及各種糖類利用實驗。參照文獻的16S rDNA鑒定方法［10］，采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGAC TT-3′）對16S rDNA進行擴增，純化后PCR產物的序列檢測由深圳華大基因公司完成，在NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）中檢索序列的同源性，并采用Neighborjoining法構建系統發育樹。

1.4 溫度對生長的影響

調節MRS培養基的pH至6.0，將100 mL培養基裝入三角瓶，接入1環斜面菌種，分別置于28、31、34、 37、40℃下進行培養24 h。在培養過程中，每隔4 h取樣進行梯度稀釋，涂布于平板培養基上，培養后進行菌落計數。根據菌落計數結果，選擇最佳的培養溫度。

1.5 pH對生長的影響

將MRS培養基調節至pH5.0、5.5、6.0和6.5，接入斜面菌種后，置于最佳的溫度下培養24 h。在培養過程中，每隔4 h采用平板菌落計數法測定培養液的菌體數，從而選擇最佳的初始pH。

1.6 鹽度對乳酸生成的影響

在含有10 g/L葡萄糖的MRS培養基中，分別添加0、20、40、60、80、100 g/L的氯化鈉，調節至最佳的初始pH，接入斜面菌種，在最佳的溫度下培養144 h，取培養72、144 h的培養液進行乳酸含量測定。

1.7 菌種對亞硝酸鹽的降解實驗

為了檢驗菌種降解亞硝酸鹽的能力，在含有20 g/L葡萄糖的MRS培養基中添加200 mg/L的亞硝酸鈉，調節至最佳的初始pH，接入斜面菌種，在最佳的溫度下進行培養，每隔8 h取樣檢測殘留的亞硝酸鹽，并計算亞硝酸鹽的降解率，如下式：

降解率（%）=（降解前亞硝酸鹽含量-降解后亞硝酸鹽含量）/降解前亞硝酸鹽含量×100

1.8 乳酸的測定

測定前，培養液經離心去除菌體，再經適當稀釋，過0.45 μm濾膜，所得濾液作為待測溶液。采用日本島津高效液相色譜儀測定乳酸，參照文獻的液相色譜條件［11］：色譜柱為Hypersil C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為甲醇與0.01 mol/L磷酸二氫鉀的混合溶液（3∶97，v/v），用磷酸調節pH2.0；流速為0.5 mL/min；進樣量為5 μL；柱溫為30℃；檢測波長為210 nm。將乳酸標準品配制成10 mg/mL的乳酸標準液，用流動相稀釋成不同濃度，進行高效液相色譜分析，以乳酸濃度（mg/mL）為橫坐標，以峰面積（mAU）為縱坐標，建立線性回歸方程。培養液的稀釋樣品測定后，根據線性回歸方程計算出稀釋樣品中的乳酸含量，培養液的乳酸產量即為：稀釋樣品中乳酸含量×稀釋倍數。

1.9 亞硝酸鹽的測定

按照GB 5009.33-2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的操作方法進行測定［12］。

2 結果與討論

2.1 優良菌種的篩選

從MRS平板上挑取30株具有溶鈣圈的菌株，初步視為產酸菌。將這些菌株分別進行發酵，采用高效液相色譜對發酵產物進行分析，與乳酸標準品的色譜圖對比，從保留時間（4.916 min）可以確定30株菌的主要產物均為乳酸。通過建立乳酸外標曲線，發現乳酸濃度為1～5 mg/mL時的線性關系良好，其回歸方程為y=304996.18x+10785.94（其中：y為峰面積，mAU；x為乳酸濃度，mg/mL），相關系數r=0.9992。根據回歸方程對各菌株48 h的乳酸產量進行計算，結果表明，乳酸產量低于5.5 g/L的菌株有24株，高于8.0 g/L的菌株有6株，其中產量較高6株菌的乳酸產量如圖1所示。菌種LP-09的乳酸產量最高，故選其為進一步研究的菌種。

圖1 優良菌種的乳酸產量Fig.1 Yield of lactic acid produced from 6 potential strains

2.2 菌種的鑒定

菌種LP-09經革蘭氏試劑染色和顯微鏡觀察，呈陽性，菌體形態為桿狀。在掃描電鏡（10 k×）、透射電鏡（10 k×）下觀察，電鏡圖像如圖2所示，菌體無鞭毛，大小約為（1.0～2.2）μm×（0.6～0.8）μm。獲得菌種LP-09的16S rDNA序列為1438 bp，經同源性檢索，發現其與許多植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的同源性達99%以上。采用MEGA5.1軟件以Neighborjoining法構建系統發育樹，如圖3所示，菌種LP-09與Lactobacillus plantarum S2S21（登錄號：KP345897.1）的親緣關系最近。通過生理生化實驗，菌種LP-09的主要生理生化特征如表1所示。綜合16S rDNA鑒定和生理生化鑒定的結果，可確定菌種LP-09為植物乳桿菌。

圖2 在掃描電鏡和透射電鏡下的圖像Fig.2 SEM（10 k×）and TEM（10 k×）photographs of cell morphology of strain LP-09

圖3 菌種LP-09的系統進化樹Fig.3 The sequence phylogenetic tree of strain LP-09

表1 菌株LP-09的生理生化特征Table1 Physiological and biochemical characteristics of strain LP-09

2.3 溫度對菌種生長的影響

在不同溫度下，菌種LP-09的生長情況如圖4所示。從圖4中可以看出，在各實驗溫度下，培養4 h后的菌種均可進入對數生長期。從生長速度來看，34～40℃的溫度范圍較適宜菌體生長。其中，在37℃下進行培養，菌種生長速度最快，16 h開始進入生長穩定期，此時的菌落數達到最大值，故該溫度被確認為最佳生長溫度。

圖4 不同溫度下的生長情況Fig.4 Growth status of strain under different temperature

2.4 pH對菌種生長的影響

圖5 不同pH下的生長情況Fig.5 Growth status of strain under different pH

在不同初始pH下，菌種LP-09的生長情況如圖5所示。乳酸菌生長有其最適宜的pH范圍，但在培養過程不控制pH的情況下，乳酸的分泌將會引起pH降低，從而對乳酸菌的生長和生理活動產生影響，因而控制初始pH對菌種生長具有重要作用。在實驗的范圍內，初始pH為6.0～6.5時的生長速度較快，表明此初始pH范圍適宜于菌種生長。其中，初始pH為6.0時的菌落數最大，達到生長穩定期時間最快，故確定最佳的初始pH為6.0。從適宜生長的初始pH來看，菌種LP-09與其他植物乳桿菌是一致的［5，13］。

2.5 鹽度對乳酸生成的影響

在含有不同濃度NaCl的MRS培養基中，菌種LP-09產乳酸情況如圖6所示。在0～40 g/L的NaCl濃度范圍，鹽度對菌種影響不大，各鹽度下的乳酸產量變化不大，且在40 g/L的NaCl濃度下，72 h和144 h的乳酸產量十分接近，分別為11.25 g/L和11.89 g/L，表明菌種在72 h左右基本可以完成產酸作用。當NaCl濃度達到60 g/L或以上時，72 h和144 h的乳酸產量均有明顯的下降；且隨著NaCl濃度增大，72 h和144 h的乳酸產量差距趨于明顯，表明高鹽度對菌種產生一定的抑制作用，菌體生長和乳酸分泌較為緩慢，需要較長時間完成乳酸的積累。根據文獻報道［5-6］，在80 g/L以上NaCl濃度下，一些耐鹽性的植物乳桿菌生長或產酸都比較微弱。在100 g/L的NaCl濃度下，菌種LP-09 在144 h仍可產乳酸2.39 g/L，具有一定的耐鹽性，在高鹽培養基中可進行緩慢發酵。

2.6 亞硝酸鹽的降解

在含有200 mg/L NaNO2的MRS培養基中，菌種LP-09降解亞硝酸鹽的情況如圖7所示。亞硝酸鹽降解率隨著發酵時間延長而增大，其中8 h以后的增大幅度較大，至40 h達到99.3%，而后變化趨于平緩。根據文獻報道，一些植物乳桿菌對150 mg/L NaNO2的降解率為96%～98%［7-8］，相對而言，菌種LP-09具有較強的降亞硝酸鹽能力。在文獻所報道的泡菜發酵過程中，所產生的亞硝酸鹽峰值一般不超過40 mg/kg［14-15］。因此，如果菌種LP-09應用發酵蔬菜生產，可以有效地控制泡菜的亞硝酸鹽含量。

圖7 不同時間的亞硝酸鹽降解率Fig.7 Time course of degradation rate of LP-09 acted on nitrate

3 結論

從泡菜中篩選獲得30株乳酸產生菌，經發酵實驗和對乳酸產物進行定量，優選出乳酸產量最高的菌種LP-09。通過對形態、生理生化特性和16S rDNA序列進行分析，菌種LP-09被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。植物乳桿菌LP-09生長的最適溫度和初始pH分別為37℃和6.0。具有較強的耐鹽性，在含有40 g/L NaCl培養基中進行培養，72 h的乳酸產量達11.25 g/L；同時，在含有100 g/L NaCl培養基中仍可緩慢發酵產酸，144 h的乳酸產量達2.39 g/L。另外，植物乳桿菌LP-09具有很強的亞硝酸鹽降解能力，對200 mg/L亞硝酸鹽的降解率可達99.3%以上。因此，植物乳桿菌LP-09是一株具有應用潛力的菌株。但是，仍需對其進行泡菜發酵實驗，進一步掌握菌種發酵特性和優化發酵工藝條件，以推動該菌種在泡菜工業化生產中的應用。

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Screening and characterization of an excellent Lactobacillus isolated from pickle

LI Jing，WANG Yao，DENG Mao-cheng*
（Guangdong Industry Technical College，Guangzhou 510300）

To obtain excellent and pure breed strain suitable for producing fermented vegetable products，strains were isolated，screened from pickle using plate screening as well as fermentation screening method.And then，optimizing species were identified using morphological，physiological and biochemical properties and 16S rDNA analysis technology.Finally，further study on fermentation characteristics of the target strain carried out a series of fermentation test.A strain named LP-09，with maximum lactic acid-producing，was isolated from pickle and identified as Lactobacillus plantarum.Results of fermentation tests showed that the optimal temperature and initial pH suitable for strain LP-09 were 37℃ and 6.0，respectively.Meanwhile，the strain owned better salt tolerance because it could grow normally in culture media with 40 g/L NaCl，or could keep fermenting and producing lactic acid even at 100 g/L NaCl concentration continuously and slowly.At the same time，strain LP-09 possessed quite strong ability to degrade nitrite and degradation rate of 200 mg/L nitrite could reach more than 99.3%.

lactobacillus plantarum；screen；salt tolerance；nitrite

TS201.1

A

1002-0306（2016）06-0229-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.039

2015－07－21

李靜（1974-），女，博士研究生，副教授，研究方向：環境科學、資源綜合利用技術，E-mail：eeslee2005@163.com。

鄧毛程（1971－），男，博士，教授，研究方向：生物工程，E-mail：dengmc@163.com。

湛江市科技計劃項目（2014A03001）；創新強校工程專項資金自主創新能力提升項目（1A10205，1A20105）；創新強校工程專項資金機制改革與協同創新項目（1A20201）。