酶法制備沙漠果蛋白ACE抑制肽工藝的研究

賈葉葉，田洪磊，詹 萍，邢慧慧，陳 蕊（石河子大學食品學院，新疆石河子832000）

酶法制備沙漠果蛋白ACE抑制肽工藝的研究

賈葉葉，田洪磊*，詹 萍，邢慧慧，陳 蕊
（石河子大學食品學院，新疆石河子832000）

在單酶篩選和單因素實驗的基礎上，采用響應面分析法優化沙漠果蛋白血管緊張素轉換酶抑制肽（ACEIP）酶解制備的技術條件，主要研究了酶解時間、酶解溫度、初始pH及底物濃度四個因素對酶解工藝條件的影響。以ACE抑制率為響應值，確定堿性蛋白酶的最佳酶解條件為：酶解時間114 min，酶解溫度57℃，初始pH10，底物濃度3.24%，酶添加量2000 U/g，此時ACEIP抑制率為69.83%。本研究可為沙漠果蛋白的高效利用奠定基礎。

沙漠果蛋白，ACEIP，酶解，響應面分析法

沙漠果又名巴西堅果（Brazil nut），也稱鮑魚果等，主要產于亞馬遜盆地，目前在我國主要分布于新疆的沙漠地帶。沙漠果果實富含油酸、亞油酸、亞麻酸等多種不飽和脂肪酸［1］，脂肪酸高達66.7%以上［2］，是健腦、益腦特色功能脂質體，脂質體制備后的仁粕中蛋白含量在13.9%左右［2］，為特色蛋白生物活性肽開發提供了優質資源。目前國外相關學者在沙漠果天然產物的生物學功能領域開展了相關工作，如Martins等［3］對沙漠果中硒和黃曲霉毒素毒理與安全性進行了評價；Jenny等［4-5］研究了沙漠果中酚類物質的抗氧化活性等，針對沙漠果蛋白生物活性肽制備等方面的研究鮮見報道。

目前，臨床用于治療高血壓的多為合成藥物，如依那普利、卡托普利等，雖能有效抑制血管緊張素轉換酶抑制肽ACE活性，降低血壓，但具明顯副作用［6］。天然、無毒副作用的食源蛋白（ACEIP）已成為目前研究開發的熱點。如Jang等［7］在酶解牛臀部肌漿蛋白提取物獲得ACEIP基礎上，確定Val-Leu-Ala-Gln-Tyr-Lys可作為牛肉ACEIP肽段主要活性序列；Byun等［8-10］從阿拉斯加鱈魚皮膚中分離得到Gly-Pro-Leu和Gly-Pro-Met兩個ACEIP序列，并測得IC50值（IC50，即ACE抑制肽抑制活性達到50%時肽的濃度）分別為2.6 μmol/L和17.13 μmol/L。植源蛋白來源廣泛，成本較低廉，成為制備ACEIP的較好選擇，具有廣闊應用前景［11］。作為新疆特色林果資源的沙漠果不但是營養油脂資源，而且是優質的蛋白副產物。本實驗采用單因素及響應面分析法對酶法制備沙漠果蛋白ACEIP工藝條件進行了優化，為產品開發及生物活性機理的揭示奠定前期研究基礎，提高以沙漠果為主的新疆特色堅果資源的精深加工利用程度。

表1 不同蛋白酶最適酶解條件Table1 The optimal conditions on enzymatic hydrolysis of different proteases

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙漠果 購買于石河子農貿市場，于4℃冰箱保存；堿性蛋白酶（200000 U/g）、木瓜蛋白酶（110000 U/g）、中性蛋白酶（60000 U/g）、風味蛋白酶（12000 U/g）、胰蛋白酶（106000 U/g） 諾維信（中國）生物技術有限公司；血管緊張素轉化酶（ACE）、N-［3-（2-呋喃基）丙烯酰］-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（FAPGG）美國Sigma公司；HEPES 上海源葉生物科技有限公司；石油醚（沸程30～60℃）、中性甲醛溶液（37%～40%）、氯化鈉、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉鈉等 均為國產分析純。

粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；DK-8D數顯恒溫水浴鍋 金壇市醫療儀器廠；Neofuge 15R臺式高速冷凍離心機 力康發展有限公司；PHS-25CW雷磁pH計 上海精科公司；85-2數顯恒溫磁力攪拌器 上海梅香儀器有限公司；ENK-PRO型酶標儀 美國Bioteck公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 沙漠果蛋白粉制備 在室溫條件下，將沙漠果去殼、粉碎，以料液比1∶3（g/mL），用石油醚浸泡1 h（期間不時攪動）后，待其沉淀，棄上清液。反復脫脂2～3次，盡可能脫脂徹底，使得上層液澄清，收集濾渣，于通風處揮發溶劑后，置于恒溫干燥箱烘干，收集沙漠果蛋白粉，4℃保存備用。

1.2.2 沙漠果蛋白酶解液制備 稱取3 g沙漠果蛋白粉（蛋白含量為41.37%），加入100 mL蒸餾水，混勻，90℃加熱10 min后，冷卻至室溫，再用NaOH調節蛋白液pH至蛋白酶最適pH范圍，將溶液置于水浴鍋中，預熱5 min，加入蛋白酶（酶底比為2000 U/g）酶解240 min。取出酶解液，置于沸水中滅酶10 min，待冷卻至室溫，8000 r/min離心10 min，收集上清液。

1.2.3 蛋白酶的篩選 分別用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶，于各自適宜條件下以酶底比2000 U/g對沙漠果蛋白進行酶解，酶解條件見表1。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 底物濃度的影響 設置蛋白酶解體系的酶解溫度為55℃，加酶量為2000 U/g，初始pH為9.0，分別在底物濃度為2%、3%、4%、5%、6%、7%的條件下，對沙漠果蛋白酶解240 min，研究底物濃度對ACE抑制率和水解度的影響。

1.2.4.2 酶解時間的影響 設置蛋白酶解體系的底物濃度為3%，酶解溫度為55℃，加酶量為2000 U/g，初始pH為9.0，分別在酶解時間為30、90、150、210、270、330 min條件下，對沙漠果蛋白進行酶解，研究酶解時間對ACE抑制率和水解度的影響。

1.2.4.3 酶解初始pH的影響 設置蛋白酶解體系的底物濃度為3%，酶解溫度為55℃，加酶量為2000 U/g，分別在初始pH為8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5條件下，對沙漠果蛋白酶解240 min，研究初始pH對ACE抑制率和水解度的影響。

1.2.4.4 酶解溫度的影響 設置蛋白酶解體系的底物濃度為3%，加酶量為2000 U/g，初始pH為9.0，分別在酶解溫度為40、45、50、55、60、65℃條件下，對沙漠果蛋白酶解240 min，研究酶解溫度對ACE抑制率和水解度的影響。

1.2.4.5 酶添加量的影響 設置蛋白酶解體系的底物濃度為3%，酶解溫度為55℃，初始pH為9.0，分別在酶添加量為500、1000、1500、2000、2500 U/g，對沙漠果蛋白酶解240 min，研究酶添加量對ACE抑制率和水解度的影響。

1.2.5 響應面實驗 根據單因素實驗結果，選取對ACE抑制率影響較大的四個因素：酶解時間、酶解溫度、底物濃度、初始pH，以ACE抑制率為響應值，運用Box-Benhnken的中心組合實驗設計原理，設計四因素三水平的酶解工藝優化實驗，因素水平設計見表2。

表2 響應面因素水平設計Table2 Factors and levels design of response surface

1.2.6 測定指標及檢測方法

1.2.6.1 ACEIP活性的測定［12］以FAPGG作為ACE的底物，測定樣品的ACEIP活性，在酶標定量儀中進行測定。按照表3添加反應物，在可見光340 nm處測定吸光值，設空白為a1，樣品為b1，于37℃下，反應30 min，再次測定OD340 nm，反應后空白組、樣品組吸光值分別記為a2、b2，每組實驗均進行平行實驗。ACEIP抑制率計算式如下：A=a1-a2，B=b1-b2，抑制率（%）= （A-B）/A×100。

1.2.6.2 蛋白水解度（DH）測定 采用甲醛滴定法［13-15］對沙漠果蛋白各酶解體系中蛋白水解度進行測定。

表3 ACE抑制活性的測定Table3 The determination of ACE inhibitory activity

游離氨基態氮的測定：將100 mL酶解液4℃、10000 r/min離心10 min，取上清液60 mL，定容至100 mL。吸取20 mL稀釋后的酶解液于250 mL錐形瓶中，加水60 mL，用0.05 mol/L的NaOH滴定至pH8.2。加入10 mL 20%中性甲醛溶液，混勻1 min。再用0.05 mol/L的NaOH滴定至pH9.2（記錄加入甲醛溶液后消耗的NaOH體積為V1）。空白組：取80 mL蒸餾水于250 mL錐形瓶中，按照上述方法同樣進行滴定，并記錄消耗的NaOH體積為V2。

游離氨基態氮（%）=［（V1-V2）×c×0.014］/（m×20/ 100）×100

DH（%）=水解液中游離氨基態氮/樣品中總氮×100。

式中：V1—樣品稀釋液在加入甲醛溶液后滴定至pH9.2，所消耗NaOH體積，mL；V2—蒸餾水（空白）在加入甲醛溶液后滴定至pH9.2，所消耗NaOH體積，mL；c—NaOH標準溶液的濃度，mol/L；m—測定用的樣品溶液，相當于樣品質量，g或mL；0.014—氮的毫摩爾質量，mg/mol。

1.3 數據統計

實驗數據為三個實驗樣本的平均值，實驗數據采用Design Expert 8.0.6.1、Origin 8.5和DPS 7.55數據處理軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶篩選

為了探究不同蛋白酶對酶解獲得沙漠果蛋白酶ACEIP的影響，本實驗采用了五種蛋白酶：堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶酶、胰蛋白酶對沙漠果蛋白進行酶解，并以酶解液ACE抑制率和水解度為指標進行測定，每組實驗均進行平行實驗，結果見圖1。

由圖1可見，不同蛋白酶酶解液的ACE抑制率存在差異（p＜0.05），酶解液的水解度存在差異（p＜0.05），造成的原因可能是由于不同蛋白酶的作用位點不同，因此水解得到的肽段結構、數量及大小，均存在差異。風味蛋白酶水解度最大為4.11%，胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶次之，分別為3.67%、3.27%、3%、1.83%。堿性蛋白酶的抑制率最高為52.53%，風味蛋白酶酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶次之，分別為43.41%、42.21%、39.76%，胰蛋白酶最小為32.43%。本實驗綜合考慮ACE抑制率和水解度兩個指標，確定堿性蛋白酶為水解沙漠果蛋白最佳用酶。

圖1 不同蛋白酶對ACE抑制率和水解度的影響Fig.1 Effect of different proteases on ACE inhibition rate and the degree of hydrolysis

2.2 單因素實驗

2.2.1 底物濃度對ACE抑制率和水解度的影響 底物濃度對ACE抑制率和水解度的影響，結果見圖2。底物濃度是影響酶促反應的主要因素之一，隨底物濃度的增加，水解度逐漸降低，可能是因為當底物濃度逐漸增大時，溫度升高，溶液粘度增大，有效水分活度降低，酶分子與蛋白分子間的有效碰撞減少造成。而抑制率呈先上升后下降趨勢，于底物濃度3%時，抑制率最大達58.29%。造成該趨勢可能是因為底物濃度低時，酶解液中的ACEIP較少，因而抑制率較低，此時增加底物濃度，有利于得到更多的ACEIP，抑制率隨之增大；但底物濃度增大到一定水平時，酶解液中ACEIP含量較高，造成溶液濃度過高，不利于與底物的結合，抑制率隨之降低。底物濃度為6%和7%時，ACE抑制率差異顯著（p＜0.05）。在此底物濃度下，抑制率上升，可能是因為底物濃度較高，反應正向遞進，導致溶液中ACEIP積累量升高，因而抑制率增大［16］。但考慮到成本問題，本實驗選取底物濃度為3%。

圖2 底物濃度對ACE抑制率和水解度的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on ACE inhibition rate and the degree of hydrolysis

2.2.2 酶解時間對ACE抑制率和水解度的影響 由圖3可知，隨時間增加水解度先上升后趨于穩定，變化不大，可能是因為，時間較短時，酶解反應不完全，蛋白未能充分酶解為肽段，因而此時增加酶解時間，將有利于酶解的進行，增大水解度；當時間增至270 min時，即使增加酶解時間，水解度變化不明顯（圖3），可能是由于蛋白已充分水解所致。

圖3 酶解時間對ACE抑制率和水解度的影響Fig.3 Effect of time on ACE inhibition rate and the degree of hydrolysis

抑制率則呈先上升后下降趨勢，于90 min時，抑制率和水解度均達最大值，分別為65.88%和5.36%，可能是因為酶解初期，隨酶解時間的增加，具有ACE抑制活性的肽段逐漸增加，抑制率增大；但隨時間增大到一定程度時，肽類物質過度水解，具有ACE抑制活性的肽段的某些活性基團遭到破壞［17-18］，抑制率降低。因此，本實驗選取酶解時間為90 min。

2.2.3 初始pH對ACE抑制率和水解度的影響 利用Tukey法多重比較不同初始pH條件下ACE抑制率和水解度，結果見圖4。pH是影響酶促反應的重要因素，只有在最適pH范圍內，酶的活力較高；偏離最適pH范圍時，酶分子活性部位的解離狀態可能發生變化［19］，酶活降低；甚至過酸或過堿時，可能造成酶分子空間結構不可逆性改變，酶變性失活。由圖4可見，當初始pH為9.5時，抑制率最大達64.93%，水解度為4.98%；當pH為10.0時，抑制率為50.71%，水解度為5.26%。綜合考慮，選取最佳pH為9.5。

圖4 初始pH對ACE抑制率和水解度的影響Fig.4 Effect of initial pH on ACE inhibition rate and the degree of hydrolysis

2.2.4 酶解溫度對ACE抑制率和水解度的影響 酶解溫度對ACE抑制率和水解度的影響差異顯著，結果見圖5。由圖5可知，隨溫度的增高，抑制率和水解度均呈現先上升后下降的趨勢。酶解溫度小于最適溫度時，隨溫度升高，酶分子與底物分子內量增加，單位時間內兩者碰撞次數增多，酶促反應速率增大；酶解溫度大于最適溫度時，隨溫度升高，酶分子空間結構遭到破壞，導致變性，酶活性降低，甚至失活。由圖可知，當溫度達到55℃時，抑制率達最大值76.3%，水解度為4.6%；溫度達到60℃時，水解度最大，達4.72%，抑制率為66.82%。綜合考慮，選取酶解溫度為55℃。

圖5 酶解溫度對ACE抑制率和水解度的影響Fig.5 Effect of temperature on ACE inhibition rate and the degree of hydrolysis

2.2.5 酶添加量對ACE抑制率和水解度的影響 利用Tukey法多重比較不同加酶量時ACE抑制率和水解度的影響，結果見圖6。酶添加量也是影響酶促反應的重要因素之一。由圖6可見，隨酶添加量的增大，抑制率和水解度均呈先上升后逐漸趨于平緩趨勢，當加酶量增加到2000 U/g時，抑制率達到37.55%，水解度達到4.65%。加酶量為2000 U/g和2500 U/g時，水解液的水解度差異不顯著（p＞0.05），說明底物濃度達2000 U/g后，再增大加酶量，酶解液水解度數值變化不大。隨酶添加量逐漸增大，酶與底物結合增多，水解度和抑制率增大；但當酶添加量增大至一定程度時，酶與底物比例失調，底物已充分結合，因而酶解效果變化不大。綜合考慮，本實驗選取最適酶添加量為2000 U/g。

圖6 加酶量對ACE抑制率和水解度的影響Fig.6 Effect of dosage of enzyme on ACE inhibition rate and the degree of hydrolysis

2.3 響應面實驗

2.3.1 回歸方程的建立與方差分析 在單因素實驗基礎上，運用Design Expert 8.0.5軟件中的Box-Behnken模型設計四因素三水平共29組實驗，實驗設計及結果見表4。

該模型p＜0.0001，模型極顯著；失擬項p=0.1725＞0.05，說明未知因素對實驗結果影響不顯著；回歸決定系數R2=0.9732，說明97.32%的響應值變化來源于所選因素；修正回歸決定系數R2Adj=0.9465，說明該模型能解釋94.65%的響應值的變化，預測值與實驗值具高度相關性，該回歸方程對實驗擬合度較好。因此，可以用回歸模型對實驗結果進行分析和預測。

對回歸模型進行方差分析，結果見表5。經方差分析可知，一次項中，B、C、D對ACE抑制率有極顯著影響，A對ACE抑制率有顯著影響；交互項中，AB、BD、CD對ACE抑制率有極顯著影響，AD、BC對ACE抑制率有顯著影響，而AC對ACE抑制率影響不顯著；二次項中，B2、C2、D2對ACE抑制率有極顯著影響，而A2對ACE抑制率有顯著影響。剔除不顯著項，得到優化后的堿性蛋白酶水解沙漠果蛋白多元二次回歸方程：Y=-981.02854+88.49900A-0.73031B+26.09327C-53.31767D+0.079333AB+4.11000AD+5.63333E-003BC+0.045083BD+0.64050AD-6.40100A2-2.30597E-003B2-0.27976C2-4.47025D2。

表4 響應面實驗設計與結果Table4 The design and results of response surface experiment

表5 回歸模型的建立及方差分析Table5 The establishment of regression model and analysis of variance

2.3.2 響應面分析 對回歸模型進行響應面分析，得到6個交互圖，其中交互顯著項AB、AD、BC、BD、CD的響應面三維立體圖，見圖7（a～e）。

等高線的形狀可以反映因素間交互作用的強弱，呈橢圓形，則表示交互作用明顯；等高線越趨向圓形，則表示交互作用越不明顯。由圖7可看出，CD、BD、AB的交互最為顯著；AD、BC次之。

2.3.3 最佳酶解條件的確定和驗證實驗 通過所得回歸模型對實驗結果進行分析和預測，確定堿性蛋白酶水解沙漠果蛋白的最佳條件：初始pH9.94，酶解時間113.60 min，酶解溫度56.66℃，底物濃度3.24%，酶添加量為2000 U/g，于最佳酶解條件下ACE抑制率的理論值為70.40%。考慮到實際操作的簡便性，對酶解條件進行適當調整：初始pH10.0，酶解時間114 min，酶解溫度57℃，底物濃度3.24%，酶添加量為2000 U/g。采用優化后的酶解條件，進行驗證實驗，此條件下ACE抑制率為69.83%，與理論值間誤差較小，說明利用響應面優化得到的酶解條件具可行性，該模型成立。

3 結論

圖7 抑制率的響應曲面圖Fig.7 The inhibition rate of response surface methodology

采用響應面分析法對酶解制備沙漠果蛋白ACE抑制肽條件進行優化，以ACE抑制率和水解度為指標，從堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶中，篩選出堿性蛋白酶為制備沙漠果蛋白ACE抑制肽的最佳用酶。在單因素實驗基礎上，采用響應面分析法確定了最佳酶解條件，考慮到實際生產中各參數調節的可行性及適宜性，對參數進行調整：初始pH10.0，酶解時間114 min，酶解溫度57℃，底物濃度3.24%，酶添加量為2000 U/g。在此條件下，制備的ACE抑制肽抑制率達69.83%，與理論值70.40%相差較小，實際驗證值與理論預測值擬合度良好，該工藝條件合理。

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Preparation of ACE inhibitory peptides from Brazil nut protein by enzymatic hydrolysis

JIA Ye-ye，TIAN Hong-lei*，ZHAN Ping，XING Hui-hui，CHEN Rui
（Food College，Shihezi University，Shihezi 832000，China）

Based on single-enzyme screening and single-factor tests analysis，the preparation conditions of ACE inhibitory peptides from Brazil nut protein were studied with response surface analysis methodology.The effects of four factors，including the time of enzymatic hydrolysis，the temperature，initial pH and substrate concentration，were mainly discussed on the enzymatic hydrolysis.Using the ACE inhibitory rate as responses，the optimum conditions of alcalase enzymatic hydrolysis were determined as enzymatic hydrolysis time 114 min，enzymatic hydrolysis temperature 57℃，initial pH10，3.24%concentration of the substrate，dosage of enzyme 2000 U/g，and then the inhibition ratio of ACEIP was 69.83%.The results of the research were the basis for the efficient utilization of the Brazil nut protein.

Brazil nut protein；ACEIP（angiotensin converting enzyme inhibitory peptide）；enzymatic hydrolysis；response surface analysis methodology

TS255.6

B

1002-0306（2016）06-0264-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.046

2015－07－21

賈葉葉（1992-），女，碩士研究生，研究方向：食品營養學，E-mail：1471282989@qq.com。

田洪磊（1979-），男，博士，副教授，研究方向：食品營養與風味化學，E-mail：272416560@qq.com。

國家自然基金（31260374）。