糠醛對釀酒酵母GGSF16葡萄糖酒精發(fā)酵的影響

于志強(qiáng)，伍時華，趙東玲，黃翠姬，易　弋（廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006）

糠醛對釀酒酵母GGSF16葡萄糖酒精發(fā)酵的影響

于志強(qiáng)，伍時華，趙東玲*，黃翠姬，易弋
（廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006）

研究了不同質(zhì)量濃度糠醛對釀酒酵母GGSF16葡萄糖酒精發(fā)酵的影響，旨在為木質(zhì)纖維素水解液酒精發(fā)酵提供參考和依據(jù)。以酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基替代木質(zhì)纖維素水解液，調(diào)節(jié)糠醛質(zhì)量濃度為0～2 g/L之間七個不同梯度，基于曲線下面積法考察糠醛對葡萄糖酒精發(fā)酵的影響。結(jié)果表明，隨著糠醛質(zhì)量濃度的增加酒精發(fā)酵周期延長，乙醇產(chǎn)率逐漸降低，但最終酒精度并沒有明顯差別；當(dāng)糠醛質(zhì)量濃度為0時乙醇產(chǎn)率最高，為3.24 g/（L·h）；發(fā)酵周期最短，為6.94 h。

糠醛；葡萄糖；酒精發(fā)酵；酵母；曲線下面積

木質(zhì)纖維素主要包含單糖聚合而成的纖維素和半纖維素。半纖維素的主要降解產(chǎn)物為木糖，在高溫或高壓條件下木糖將進(jìn)一步降解為糠醛，糠醛為木質(zhì)纖維素水解液酒精發(fā)酵的主要抑制劑［1-2］。而糠醛抑制酵母代謝的機(jī)理并不完全清楚，但已有研究表明，糠醛抑制了糖酵解過程中主要的酶的活性，包括己糖激酶、磷酸果糖激酶和磷酸丙糖脫氫酶［3］。此外，三羧酸循環(huán)及乙醇合成路徑中的乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶同樣受糠醛的影響［4］。在厭氧條件下，酵母利用糠醛轉(zhuǎn)變成糠醇和甲酸［5］。這種轉(zhuǎn)換最可能的途徑是糠醛取代乙醛作為乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的底物［6］。糠醛的抑制效果主要與酵母代謝利用糠醛的能力有關(guān)［6］。如果糠醛對酒精發(fā)酵的影響能夠確定，便可通過特定的去毒方法、選擇合適的菌種或者應(yīng)用最優(yōu)的工藝條件來提高發(fā)酵效率。

為了避免水解液中的其他成分對發(fā)酵產(chǎn)生影響或與糠醛產(chǎn)生相互作用，故將糠醛貯備液添加到酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YEPD）中替代木質(zhì)纖維素水解液進(jìn)行酒精發(fā)酵，通過曲線下面積法（areaunder the curve，AUC）并對糖代謝曲線擬合［7-10］，考察酒精發(fā)酵過程中的葡萄糖代謝、細(xì)胞生長及乙醇的生成受糠醛的抑制效果，從而為利用木質(zhì)纖維素水解液酒精發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1料與試劑

1.1.1株

釀酒酵母GGSF16（Saccharomycescerevisiae GGSF16）：由廣西科技大學(xué)發(fā)酵工程研究所提供。

1.1.2養(yǎng)基

斜面活化培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸膏10 g/L，瓊脂20 g/L，自然pH值。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸膏10 g/L，自然pH值。

YEPD發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸膏10 g/L，自然pH值。

以上培養(yǎng)基和溶液均115℃高壓蒸汽滅菌20min。

1.2器與設(shè)備

ZWYD-2402疊式恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；LS-B35L-I立式壓力蒸汽滅菌器：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；UV-1100紫外分光光度計：上海美普達(dá)儀器有限公司；SBA-40生物傳感儀：山東科學(xué)院生物研究所；SW-CJ-TB標(biāo)準(zhǔn)凈化工作臺：蘇州集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；M ikro220R臺式冷凍離心機(jī)：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；DW-86L386立式超低溫保存箱：青島海爾特種電器有限公司。

1.3法

1.3.1酵方法

種子培養(yǎng)：將實驗室保存的斜面菌種接至斜面活化培養(yǎng)基中，32℃條件下培養(yǎng)1～2 d，待其斜面上長出白色菌苔即為菌種培養(yǎng)成熟。將活化的菌種轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中，32℃、160 r/min培養(yǎng)24 h后，經(jīng)12 000 r/min離心5min，棄上清液，加入無菌水將酵母泥制成10倍濃縮種子懸液備用。

發(fā)酵流程：以10%的接種量（2m L高濃度種子液）將種子液轉(zhuǎn)接至200m L YEPD發(fā)酵培養(yǎng)基中（500m L的錐形瓶），無菌操作將糠醛貯備液加入YEPD發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別制成0、0.25 g/L、0.5 g/L、0.75 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L質(zhì)量濃度梯度，并以不添加糠醛作為對照組。初始酵母數(shù)在3.32×107CFU/m L左右，搖床160 r/m in，溫度為32℃，發(fā)酵條件為非嚴(yán)格厭氧，用透氣膜和牛皮紙包扎發(fā)酵。每個處理3個平行。發(fā)酵過程中每隔2 h取樣并取其中一個平行用稱重法測CO2質(zhì)量損失，直至CO2質(zhì)量損失＜0.2 g時，即發(fā)酵結(jié)束。

1.3.2析方法

樣品處理：取發(fā)酵液1m L，12 000 r/min離心5min，取上清液于-60℃冰箱冷凍，用于葡萄糖含量和乙醇生成數(shù)據(jù)分析；加入與抽取上清液等量的蒸餾水混合成菌懸液，用于測定酵母細(xì)胞OD值。

生物量的測定：使用UV-1100紫外可見分光光度計，將菌懸液稀釋至合適倍數(shù)測定其在波長600 nm處的吸光度值。酒精度與葡萄糖含量采用SBA-40C生物傳感分析儀測定，標(biāo)準(zhǔn)乙醇與葡萄糖含量分別為0.1%vol和1 g/L，將發(fā)酵上清液稀釋合適倍數(shù)進(jìn)樣分析。

1.3.3線下面積與糖代謝曲線擬合

葡萄糖的代謝曲線及細(xì)胞OD值的生長曲線運(yùn)用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行處理，并分別獲得葡萄糖代謝曲線下面積及細(xì)胞生長曲線下面積，分別記做葡萄糖AUC與OD值A(chǔ)UC。

葡萄糖的代謝曲線運(yùn)用Origin 8.0軟件進(jìn)行非線性曲線擬合，葡萄糖代謝方程擬合較好的主要有Boltzm ann S形函數(shù)和DoseResp S形函數(shù)，選擇R2最大的函數(shù)作為其擬合方程，并以擬合方程分別計算出葡萄糖消耗一半與完全消耗的時間，記做t50與tend。

1.3.4定方法

2　結(jié)果和分析

2.1醛對糖代謝的影響

2.1.1醛對葡萄糖AUC的影響

圖1　不同糠醛質(zhì)量濃度條件下酵母GGSF16葡萄糖消耗擬合曲線Fig.1 Fitting curve of glucose consum ption from S.cerevisiae GGSF16 w ith differen t furfural concentration

表1　糠醛濃度對酵母GGSF16葡萄糖代謝曲線面積的影響Table 1 Effec t of different furfural concentration on glucose m etabolism curve area from S.cerevisiae GGSF16

曲線下面積法能夠直觀、準(zhǔn)確且定量的判斷葡萄糖的利用情況，從而整體的評估發(fā)酵的好壞［10］。葡萄糖AUC越大說明葡萄糖利用速率越慢、糠醛對酵母細(xì)胞利用葡萄糖的抑制作用越強(qiáng)，反之亦然［10］。從圖1可知，隨著糠醛質(zhì)量濃度的增大，葡萄糖的代謝速率不斷降低，但對最終的殘?zhí)橇坑绊懖淮蟆Ｓ杀?可知，對照組的葡萄糖AUC值最小193.10±2.16，不同糠醛質(zhì)量濃度條件下的葡萄糖AUC隨糠醛質(zhì)量濃度的增大而增大。當(dāng)糠醛質(zhì)量濃度為2.0 g/L時，葡萄糖AUC達(dá)到最大355.70±2.93。分別以不同糠醛質(zhì)量濃度條件下的葡萄糖AUC與對照組的葡萄糖AUC比值發(fā)現(xiàn)，比值隨著糠醛質(zhì)量濃度的增大而增大。結(jié)果表明，抑制作用隨著糠醛質(zhì)量濃度的增大而不斷增強(qiáng)［3-7］。當(dāng)糠醛質(zhì)量濃度分別為0.25 g/L與1.0g/L時，比值分別為1.04±0.008 7和1.31±0.004 1，表明糠醛質(zhì)量濃度為0.25 g/L時，對酵母GGSF16利用葡萄糖的影響較小，而當(dāng)糠醛質(zhì)量濃度＞1.0 g/L時，對葡萄糖的消耗具有明顯影響［11］。

2.1.2醛對t50和tend的影響

圖2　不同糠醛質(zhì)量濃度條件下t50和tend值Fig.2 t50and tendw ith different furfural concentrations

應(yīng)用Origin 8.0軟件對圖1糖代謝曲線的擬合，可以分別計算出葡萄糖消耗一半和完全消耗的時間t50與tend。t50可以判斷酒精發(fā)酵前期葡萄糖的消耗情況，tend則可以預(yù)測酒精發(fā)酵的結(jié)束時間［7］，從而直觀、定量的比較出不同濃度糠醛對酒精發(fā)酵結(jié)束時間的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，t50和tend均隨糠醛濃度的增大而增大。當(dāng)糠醛質(zhì)量濃度＜0.5 g/L時，t50變化并不顯著。表明糠醛在低濃度條件下對酵母GGSF16利用葡萄糖的影響較小，可能由于酵母本身對糠醛具有一定的耐受性［12］。當(dāng)糠醛質(zhì)量濃度＞1.0 g/L時，t50與tend均隨糠醛濃度增大而增大，tend與對照組相比分別增加了35.50%、43.15%和55.07%（見圖2）。結(jié)果表明，隨著糠醛濃度的增加，酒精發(fā)酵周期逐漸延長。

圖3　不同糠醛質(zhì)量濃度條件下酵母GGSF16細(xì)胞生長曲線Fig.3 Cellgrow th curve of S.cerevisiae GGSF16 a t different furfural concentrations

2.2醛對細(xì)胞生長的影響

測定細(xì)胞懸液的OD值能夠簡單、快速地評估微生物的生長情況［12］。與平板計數(shù)法相比更加適用、快速且廉價，因此一些作者已經(jīng)采用OD值曲線下面積法來評估不同物質(zhì)對細(xì)胞生長的抑制作用［13-16］。OD值A(chǔ)UC能夠簡單、直觀且定量的比較細(xì)胞生長的情況［11］。OD值A(chǔ)UC越小則說明抑制成分對微生物生長抑制越明顯，反之亦然［14］。由圖3可知，隨著糠醛濃度的增大，發(fā)酵前期細(xì)胞的生長速率逐漸降低，細(xì)胞的生長出現(xiàn)停滯且最終OD值逐漸減小。糠醛的存在抑制了乙醇脫氫酶的活性，乙醇脫氫酶有助于細(xì)胞排除乙醛，從而引起乙醛在細(xì)胞內(nèi)部的積累，乙醛在細(xì)胞內(nèi)部的積累被認(rèn)為是細(xì)胞生長放緩或停滯的原因［17］。而在高濃度糠醛條件下會造成細(xì)胞的死亡可能是最終OD值隨糠醛濃度的增大而減小的原因［18］。當(dāng)糠醛質(zhì)量濃度為2.0 g/L時，0～4 h的OD值增長量為0.49，而對照組在0～4 h的OD值增長量則為6.54。充分說明糠醛影響了細(xì)胞的繁殖與再生，且這種影響隨著糠醛濃度的增大而增強(qiáng)。實驗結(jié)果表明，糠醛在高濃度條件下，嚴(yán)重阻礙了細(xì)胞的生長。因此，高接種量可能是降低糠醛抑制作用的一種有效途徑。由表2可知，不同糠醛濃度條件下的OD值A(chǔ)UC隨糠醛濃度的增加而減小，糠醛濃度為0時，OD值A(chǔ)UC最大132.00±1.48。糠醛質(zhì)量濃度為2 g/L時，OD值A(chǔ)UC最小75.58±0.83。說明糠醛濃度越高對細(xì)胞生長的抑制作用越強(qiáng)。糠醛的添加組與對照組的比值同樣隨糠醛濃度的增加而減小，當(dāng)糠醛質(zhì)量濃度為0.25 g/L和1.0 g/L時，比值分別為0.96與0.81，當(dāng)糠醛質(zhì)量濃度為0.25 g/L時，對細(xì)胞生長的影響較小，而當(dāng)糠醛質(zhì)量濃度＞1.0 g/L時，細(xì)胞生長則明顯放緩，表明糠醛阻礙了細(xì)胞的繁殖與再生，從而引起細(xì)胞生長的停滯［18］。與糠醛對葡萄糖代謝的影響一致，糠醛在低濃度條件下對細(xì)胞生長的影響較小；當(dāng)糠醛質(zhì)量濃度＞1.0 g/L時，則對細(xì)胞生長具有明顯影響。

表2　糠醛質(zhì)量濃度對酵母GGSF16細(xì)胞生長曲線下面積的影響Table 2 Effectof different furfural concentration on area under the curve of S.cerevisiae GGSF16 grow th

2.3醛對酒精生成的影響

糠醛對細(xì)胞生長的影響遠(yuǎn)大于對酒精生成的影響［18］。由圖4與表3可知，隨著糠醛濃度的增加，乙醇的生成速率逐漸降低，但對最終酒精度以及發(fā)酵效率影響不大。先前的研究同樣表明，在糠醛存在的情況下，細(xì)胞的生長受到了明顯的抑制作用，然而乙醇的產(chǎn)量仍舊維持在較高的水平［7，19］。但由于糠醛的加入延長了發(fā)酵周期，從而使得乙醇產(chǎn)率隨著糠醛濃度的增大而逐漸降低（見表3）。當(dāng)糠醛質(zhì)量濃度為0時，乙醇產(chǎn)率最高為3.24 g/（L·h）。結(jié)果表明，隨著糠醛濃度的增大乙醇產(chǎn)率逐漸降低、發(fā)酵周期逐漸延長，但對最終酒精度的影響不大。因此，盡可能的降低木質(zhì)纖維素水解液中的糠醛濃度有利于酒精發(fā)酵的過程。

圖4　不同糠醛質(zhì)量濃度條件下酵母GGSF16酒精發(fā)酵過程中酒精生成曲線Fig.4 Alcohol production curve during the ferm entation process of S.cerevisiae GGSF16 from glucose at different furfural concentrations

表3　糠醛質(zhì)量濃度對酵母GGSF16葡萄糖酒精發(fā)酵參數(shù)的影響Table 3 Effectof different furfural concentrations on alcohol ferm entation param eters of S.cerevisiae GGSF16 from glucose

3　結(jié)論

本試驗以調(diào)節(jié)不同濃度糠醛的YEPD發(fā)酵培養(yǎng)基替代木質(zhì)纖維素水解液，通過對葡萄糖代謝曲線的擬合，分別得到了不同糠醛濃度條件下的發(fā)酵結(jié)束時間；并應(yīng)用曲線下面積法整體評估了糠醛對發(fā)酵過程中幾個重要參數(shù)的影響，在不同糠醛濃度條件下酵母GGSF16葡萄糖酒精發(fā)酵結(jié)果表明，糠醛濃度的增加會導(dǎo)致葡萄糖代謝和細(xì)胞生長逐漸減慢、乙醇產(chǎn)率逐漸降低、發(fā)酵周期逐漸延長，但最終酒精度并沒有明顯差別。當(dāng)糠醛質(zhì)量濃度為0時乙醇產(chǎn)率最高，為3.24 g/（L·h）；發(fā)酵周期最短，為6.94 h。因此，在酒精發(fā)酵的過程中應(yīng)盡可能的降低木質(zhì)纖維素水解液中的糠醛含量。

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Effect of furfural on alcohol fermentation from glucose by Saccharomyces cerevisiae GGSF16

YU Zhiqiang，WU Shihua，ZHAO Dongling*，HUANG Cuiji，YIYi
（SchoolofBiologicaland Chemical Engineering，GuangxiUniversity ofScience and Technology，Liuzhou 545006，China）

The effect of different furfural concentration on alcohol fermentation from glucose by Saccharomyces cerevisiae GCSF16 wasexplored，which provided basic information for alcohol fermentation from lignocellulosic hydrolysate.YEPD medium was used instead of lignocelluloses hydrolysate，and the furfuralcontentwasadjusted to seven levels ranging from 0-2 g/L.Based on the areaunder curve，the effectof furfuralon thealcohol fermentation from glucosewasexplored.The results showed thatw ith the increase of furfural concentration，the fermentation period prolonged and the production of alcohol decreased，but no significant difference in alcohol content at the end.When the furfural concentration was 0，the ethanolyield was3.24 g/（L·h），and the fermentation period shortened to 6.94 h.

furfural；glucose；alcohol fermentation；Saccharomycescerevisiae；areaunder the curve

TS261．4

0254-5071（2016）01-0034-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．008

2015-11-03

廣西科技攻關(guān)項目（桂科攻0782003-2）；廣西高校科學(xué)技術(shù)研究項目（YB2014202）

于志強(qiáng)（1990-），男，碩士研究生，研究方向為纖維素酒精發(fā)酵。

趙東玲（1965-），男，工程師，博士，研究方向為微生物發(fā)酵。