巴氏醋酸桿菌AS1.41產醋酸關鍵酶研究

陳　洋，高　冰，汪　超，李冬生，徐　寧，胡　勇（湖北工業大學 工業發酵湖北省協同創新中心湖北省食品發酵工程技術研究中心，湖北 武漢 430068）

巴氏醋酸桿菌AS1.41產醋酸關鍵酶研究

陳洋，高冰，汪超，李冬生，徐寧，胡勇*
（湖北工業大學 工業發酵湖北省協同創新中心湖北省食品發酵工程技術研究中心，湖北 武漢 430068）

巴氏醋酸桿菌（Acetobacerpasteurianus）將乙醇氧化成醋酸的關鍵酶是乙醇脫氫酶（ADH）和乙醛脫氫酶（ALDH）。在不同初始乙醇含量條件下，ADH和ALDH的酶活呈現動態變化，乙醇含量為4%時，ADH和ALDH的酶活達到最大，分別為7.43U/mg和7.18 U/mg。同時，酶活與產酸速率呈現出較高一致性：酶活越高，產酸速率越快。發酵溫度為32℃時，菌體生長最為活躍，酶活最大，產酸最快；加入0.5%的乙酸后，ADH和ALDH的酶活分別由8.12 U/mg和7.06U/mg提高到了9.43U/mg和8.52 U/mg，產酸速率也得到相應提升。ALDH對乙醇、乙酸、溫度的穩定性均高于ADH。

巴氏醋酸桿菌；乙醇脫氫酶；乙醛脫氫酶；乙醇；溫度；乙酸

醋酸菌是一類革蘭氏陰性好氧菌，其中醋桿菌屬（Acetobacter）、葡糖酸醋酸桿菌屬（Gluconoacetobacter）、葡糖桿菌屬（Gluconobacter）均可以將乙醇快速氧化為乙酸［1-2］，因此，他們廣泛用于工業食醋的釀造。AS1.41是我國釀醋工業中常用的醋酸菌，該菌屬于醋桿菌屬中的巴氏醋酸桿菌（Acetobacterpasteurianus），具有較好的發酵性能，值得進行研究。

將乙醇氧化為乙酸是食醋生產的主要過程，這一過程主要涉及到兩種較為關鍵的酶：乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）［3］和乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）［4］。這兩種酶結合于細胞膜上，位于膜的外側部分，吡咯喹啉醌（pyrroloquinolinequinine，PQQ）是他們的輔酶［5-6］。大量研究已經表明，醋酸發酵是依賴于PQQ-ADH和PQQ-ALDH完成的，乙醇作為底物，在PQQ-ADH的催化下生成乙醛，乙醛接著在PQQ-ALDH的作用下生產醋酸［7］。周秉辰［8］研究發現醋酸菌的產酸速率與ADH的酶活存在著明顯的相關性，酶活越高產酸速率越快；TRCEK J等［9］研究發現與巴氏醋酸桿菌相比，葡糖醋桿菌能產生較高濃度的醋酸，其PQQ-ADH的活性和酸穩定性明顯高于巴氏醋酸桿菌，同時PQQ-ADH的表達量也相應較多；KANCHANARACHW等［10］從酶的穩定性方面研究了醋酸菌耐高溫與乙醇脫氫酶的關系，結果發現，乙醇脫氫酶氨基酸序列的差異性導致了酶的穩定性不同，而乙醇脫氫酶的穩定性與醋酸菌的耐高溫特性具有一定的相關性。

醋酸菌作為釀醋的核心微生物，其在發酵過程中會面臨各種壓力。高濃度初始乙醇是其首先要面對的挑戰。隨著發酵進行，溫度及乙酸逐漸對醋酸菌產生抑制作用。雖然乙醇氧化產酸與PQQ-ADH和PQQ-ALDH直接相關，但是在發酵過程中這兩種酶的動態變化及穩定性與產酸之間的關系研究很少。本實驗在不同的乙醇、乙酸、溫度等條件下從酶活及酶的穩定性等方面，探究發酵過程中PQQ-ADH和PQQ-ALDH與醋酸菌產酸的關系，揭示這兩種酶與產酸的規律。將該規律用于實際生產，通過改變乙醇、溫度、乙酸等條件對酶的酶活及穩定性進行調控，達到提高醋酸產量的目的，為工業生產提供堅實的理論依據。

1　材料與方法

1.1料與試劑

1.1.1料與試劑

醋酸菌AS1.41：中國典型微生物保藏中心；葡萄糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、酵母粉、鐵氰化鉀、無水硫酸鎂、無水乙醇、體積分數40%的乙醛、Triton X-100、乙二胺二乙酸二鈉鹽、硫酸鐵、十二烷基硫酸鈉、95%磷酸等均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2養基

種子培養基：葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，滅菌冷卻到50℃條件下加入體積分數為2%的乙醇；

發酵培養基：葡萄糖10 g/L，酵母粉15 g/L，無水硫酸鎂0.2 g/L，滅菌冷卻到50℃條件下加不同體積分數的乙醇或者乙酸。

1.2器與設備

ZHJH-C1214B紫外超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；GL-21高速冷凍離心機：長沙平凡儀器儀表有限公司；XO-1000D超聲細胞破碎儀：上海實驗儀器廠；i8雙光束紫外可見分光光度計：濟南海能儀器有限公司；HNY-2112B柜式全溫振蕩培養箱：天津歐諾儀器儀表有限公司；SY-3010發酵罐：上海世遠生物設備工程有限公司。

1.3驗方法

1.3.1養方法

發酵罐發酵的條件：發酵罐為10 L，攪拌的速度控制為120 r/m in，溶解氧濃度維持在22%，發酵溫度根據實驗要求控制。

1.3.2析方法

菌體密度：使用分光光度計在波長600 nm處測定吸光度值OD600nm。

酸度測定：0.5mol/LNaOH溶液滴定法，以醋酸計。

粗酶液的制備：參照問清江等［11］方法。

ADH、ALDH酶活的測定：參照參考文獻［12］，分別取0.5m LM cllvaine緩沖液（pH 4.0），0.1m L粗酶液，0.1m L乙醇或乙醛（1.0mol/L）溶液，1%的Triton X-100溶液0.1m L加入15m L比色管中25℃保溫5min；再加入0.2m L鐵氰化鉀溶液（0.1mol/L），25℃反應5m in（需要做空白對照）以后，加入0.5m L硫酸鐵-Dupanol溶液結束反應；加3.5m L蒸餾水混合，于25℃靜置20min，然后于波長660 nm處測定吸光度值。

酶活單位定義：在25℃、pH 4.0條件下，1min氧化lμmol乙醇的酶量為一個酶活力單位（U）。

酶的穩定性：為了研究ADH和ALDH在不同溫度、乙醇、乙酸條件下的穩定性，用10mmol/L磷酸鉀鹽緩沖溶液（pH 6.0）將ADH和ALDH粗酶液的質量濃度調成1mg/m L，然后取相同體積的ADH和ALDH溶液測量其對乙醇、溫度、乙酸的穩定性。乙醇穩定性：酶液中加入體積分數為0～35%的乙醇后30℃培養30m in。溫度穩定性：酶液置于25～55℃培養30min。乙酸穩定性：酶液中加入體積分數為0～12%的乙酸后30℃培養30min。

相對酶活：實驗組的酶活與參照組的酶活之間的比值。相對酶活的計算公式如下：

2　結果與分析

2.1醇對發酵過程中ADH和ALDH酶活的影響

發酵培養基（2 L）滅菌后分別加入體積分數為2%、4%、6%、8%的乙醇，接種8%的種子液，發酵罐中30℃發酵8 d。每天測量ADH和ALDH的酶活，醋酸的產量和醋酸菌的生物量，結果如圖1和表1所示。醋酸菌的產酸包括3個階段：高速積累期（0～3 d），平穩增長期（4～6 d），過氧化期（＞7 d）。乙醇含量的升高，醋酸菌受到的抑制作用增強。

圖1　初始乙醇含量對菌株AS1．41產酸量（A）及生物量（B）的影響Fig．1 Effectof initia lethanol concentration on acid yield（A）and biomass（B）o f strain AS1．41

由圖1可知，在初始乙醇含量為2%時菌株AS1.41生長最好，OD600nm值為2.22。隨著乙醇含量的增加菌株AS1.41的生長周期逐漸延長。當初始乙醇含量為4%時，菌株AS1.41產酸量最大，為38.9 g/L。當初始乙醇含量達到8%時，菌株AS1.41的生長受到較強的抑制，產酸降至30.1 g/L。由表1可知，ADH和ALDH的酶活呈現動態變化。不同初始乙醇含量下，ADH和ALDH的活性均呈現出先增加后降低的趨勢，在3～4 d時，ADH和ALDH的酶活均達到峰值。乙醇含量為2%～4%時，隨乙醇含量的升高，ADH和ALDH的酶活也相應提高，在乙醇含量為4%時，ADH和ALDH的最大酶活分別為7.43U/mg、7.18U/mg。初始乙醇含量＞4%時，兩種酶的酶活均開始下降，且ALDH下降的速度比ADH緩慢。同時，由表1還可以看出，一定量乙醇的存在對ADH和ALDH的表達有誘導作用，當乙醇含量超過這個范圍（4%）時，乙醇對醋酸菌會產生毒害作用，從而嚴重影響ADH和ALDH的表達。

表1　不同初始乙醇含量下醋酸發酵過程中關鍵酶系的酶活力和產酸速率Table 1 Enzyme activity of the key enzym es and acid production rate during acetic fermentation at different initialethanol concentration

ADH和ALDH的酶活與產酸速率存在著一定的對應關系。表1體現了產酸速率與酶活的關系：酶活高時產酸速率快。發酵初期菌體要適應新環境，因而生長較弱，ADH和ALDH的表達量較少，酶活較低，此時產酸速率較小。隨著菌種的生長進入對數期，ADH和ALDH的表達量增加，酶活處于較高的水平，此時，菌種產酸速率顯著加快，發酵液中大量積累醋酸。隨著發酵進入后期，菌種停止生長甚至死亡，酶的分泌量急劇減少，產酸速率隨之下降直到停止。

在實際發酵過程中，可以通過控制發酵液中的乙醇含量調節ADH和ALDH的酶活，從而提高產酸量。對于連續補料發酵，可以控制乙醇含量為4%，此時ADH和ALDH的酶活維持在較高的水平，達到從酶學水平調控發酵，提升產量的目的。

2.2度對ADH和ALDH的影響

溫度是影響醋酸發酵的重要因素。發酵培養基（2 L）滅菌后加入體積分數為4%的無水乙醇和8%的種子液，分別于28℃、30℃、32℃、35℃、37℃、39℃條件下在發酵罐（10 L）中發酵。每天測量ADH和ALDH的酶活，產酸量和醋酸菌的生長。菌種在不同溫度下的生長量、產酸量及酶活結果如圖2所示。

圖2 溫度對菌株AS1．41的生物量和產酸量（A）及ADH和ALDH的酶活（B）的影響Fig．2 Effect of tem perature on biom ass，acid yield（A）and enzyme activity of ADH and ALDH（B）of strain AS1．41

由圖2A可知，醋酸菌AS1.41在不同溫度下的生物量和產酸的表現是一致的，即生長越好產酸越高。在發酵溫度為32℃時，AS1.41的生長最好（OD600nm=2.23），產酸量最大（39.8 g/L）。由圖2B可知，ADH和ALDH的酶活與發酵溫度存在相關性：發酵溫度為32℃時，ADH和ALDH的酶活均達到最大，分別為8.34U/mg和7.23U/mg；隨著溫度繼續升高（＞35℃），ADH和ALDH的酶活快速下降，且ADH的下降速率高于ALDH。

結果表明，不同溫度條件下ADH和ALDH的酶活水平與菌體的生長表現是一致的，培養溫度為32℃時，菌體生長最為活躍，酶活最高，產酸最快。溫度過高（＞35℃）后，AS1.41的生長受到抑制，酶活降低，產酸速率下降。因此，在實際生產中，可以通過控制發酵溫度，使得發酵體系中ADH和ALDH處于較高酶活水平，從而提高生產強度。從本實驗的結果來看，32℃最適合作為AS1.41的發酵溫度。

2.3酸（乙酸）對ADH和ALDH的影響

醋酸是醋酸菌發酵的主要產物，發酵初期醋酸的存在會對發酵產生一定的影響［13-14］，酶系水平可能也會發生一些變化。為研究底酸（乙酸）對酶的影響，發酵培養基（2 L）滅菌后加入體積分數4%的乙醇和8%的種子液，同時分別加入0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的乙酸作為底酸，在發酵罐（10 L）中32℃發酵。每天測量ADH和ALDH的酶活，產酸量和AS1.41的生長量。不同底酸下菌種的最大生長量，最大產酸量和最大酶活如圖3所示。

圖3　乙酸含量對菌株AS1．41的生物量和產酸量（A）及ADH和ALDH的酶活（B）的影響Fig．3 Effec t of acetic acid content on biom ass，acid yield（A）and activities of ADH and ALDH（B）of strain AS1．41

由圖3A可知，菌株AS1.41的生物量隨底酸的增加（0～1.5%）而緩慢減少，產酸量先增加后減少。底酸含量為0.5%時，菌株AS1.41的產酸量最大（40.8 g/L），生物量較好（OD600nm=1.98）。因此，發酵時加入0.5%的底酸對菌株AS1.41的產酸有促進作用。從圖3B可知，發酵過程中，ADH和ALDH的酶活與底酸有一定關系：隨底酸的增加，ADH和ALDH的酶活均先增大后降低，當底酸含量＞1.0%時，酶活快速降低，且ADH酶活的下降速率高于ALDH。

結果表明，不同底酸含量下ADH和ALDH的酶活水平與菌體的產酸表現是一致的。加入0.5%的底酸后，ADH和ALDH的酶活分別由8.12 U/mg和7.06 U/mg提高到了9.43U/mg和8.52U/mg。因此，一定量的底酸存在會形成反饋激活作用，促進ADH和ALDH的表達，從而提高其酶活。因此，在實際的生產過程中，加入一定量（0.5%）的乙酸作為底酸，可有效提高ADH和ALDH的酶活，最終達到促進發酵、提高產酸的目的。

2.4醇脫氫酶（ADH）和乙醛脫氫酶（ALDH）的穩定性

酶在極端環境下的穩定性是工業生產上十分關心的問題［15］。因此，研究了ADH和ALDH在不同乙醇、乙酸、溫度下的穩定性，結果見圖4～圖6。

圖4　ADH和ALDH在不同乙醇含量下的穩定性Fig．4 Stability of ADH and ALDH at differentethanol concentration

由圖4可知，乙醇含量＜5%時，ADH和ALDH均非常穩定，其酶活保持在較高的水平；乙醇含量為15%時，ALDH較為穩定，其剩余酶活＞82.78%，而ADH的酶活僅為初始酶活的59.32%；乙醇含量＞15%時，ADH的酶活急劇下降；當乙醇含量達到35%時，ADH幾乎完全失活，而ALDH仍保留了16.54%的酶活。由此可見，ALDH對乙醇的穩定性明顯高于ADH。

圖5 ADH和ALDH在不同溫度下的穩定性Fig．5 Stability of ADH and ALDH at different tem perature

由圖5可知，ADH和ALDH的酶活在30℃時最穩定；當溫度為45℃時，ADH和ALDH的剩余酶活分別為60.1%和76.3%；溫度＞50℃時，ADH和ALDH的酶活迅速降低，且ADH下降速率明顯高于ALDH。55℃時，ALDH保留了18.6%的酶活，而ADH失去了活性。因此，ALDH對溫度的穩定性優于ADH。

由圖6可知，酸的存在對ADH和ALDH的穩定性有重要的影響。隨乙酸的含量從0增加到4%，ADH和ALDH的相對酶活從100%分別下降到58.5%和76.3%；乙酸含量超過6%時，ADH和ALDH的活性急劇下降，這對醋酸發酵極為不利。乙酸含量為10%時，ADH幾乎失活，而ALDH的剩余酶活僅為17.1%。由此可知，ALDH對乙酸的穩定性強于ADH。

圖6　ADH和ALDH在不同乙酸含量下的穩定性Fig.6 Stability of ADH and ALDH at different acetic acid content

結果表明，ALDH對乙醇、乙酸、溫度的穩定性均高于ADH，因此，ADH是醋酸發酵過程中的限制酶。要保持較高的發酵效率就必須使ADH和ALDH在復雜發酵環境下仍保持較高的活性，因此，發酵條件必須進行控制：發酵的初始乙醇含量要＜10%，發酵溫度≤35℃，發酵液中的乙酸含量≤4%。

3　結論

通過發酵罐進行分批發酵探究醋酸菌AS1.41產酸與關鍵酶系之間的關系。在不同初始乙醇濃度含量下，酶活與產酸速率呈現出較高一致性：酶活越高，產酸越快。2%～4%的初始乙醇可誘導ADH和ALDH的表達，在此范圍內，ADH和ALDH的酶活明顯提高。發酵溫度為32℃時，菌體生長最為活躍，ADH和ALDH的酶活最大，產酸的速率最快，發酵溫度＞35℃時，酶的表達受到抑制，AS1.41的產酸速率下降。在0.5%的底酸（乙酸）存在時，ADH和ALDH的酶活分別由8.12 U/mg和7.06 U/mg提升到了9.43 U/mg和8.52U/mg，產酸速率也得以提升。

通過對剩余酶活的測量來探究ADH和ALDH面對乙醇、溫度、乙酸時的穩定性。與ADH相比，ALDH顯示出更好的乙醇、溫度以及乙酸穩定性。本研究同時表明：當乙醇含量＜10%，溫度≤35℃，乙酸含量≤4%時，ADH和ALDH的酶活相對穩定，對發酵也比較有利。

酶的表達量直接關系到酶的活性大小，酶的穩定性直接關系到酶的作用時間，因此，ADH和ALDH的活性和穩定性對AS1.41產酸有直接影響。在實際發酵過程中可以通過控制發酵的初始乙醇，底酸，溫度等條件達到調控酶的表達量和酶的穩定性，最終達到提升產酸量，縮短發酵周期的目的。

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Study on the key enzymes of acetic acid production from Acetobacter pasteurianus ASI.41

CHEN Yang，GAO Bing，WANG Chao，LIDongsheng，XU Ning，HU Yong*
（HubeiResearch CenterofFood Fermentation Engineeringand Technology，Research CenterofFood Fermentation Engineering and Technology ofHubei，HubeiUniversity ofTechnology，Wuhan 430068，China）

The alcohol dehydrogenase（ADH）and aldehyde dehydrogenase（ALDH）were the key enzymeswhich ethyl alcoholwasoxidized into acetic acid by Acetobacterpasteurianus.The enzyme activity of ADH and ALDH presented dynamic changesunder the conditionsof different initial ethanolcontent.When ethanolcontentwas4%，theenzymeactivity of ADH and ALDH reached themaximum 7.43U/mg and 7.18U/mg，respectively.Enzymeactivity and acid production ratepresented ahigh consistency.Thehigher the enzyme activity，the faster the acid produces.When the fermentation temperaturewas32℃，thegrow th of thestrainwas themostactive；theenzymeactivity reached to the highest，and theacid production rate was the fastest.A fter adding acetic acid 0.5%，the enzyme activity of ADH and ALDH increased from 8.12 U/mg and 7.06 U/mg to 9.43 U/mg and 8.52 U/mg，respectively.Acid production ratewasalso improved.The stability of ALDH on ethanol，acetic acid，and temperature was higher than thatof ADH.

Acetobacerpasteurianus；ADH；ALDH；ethanol；temperature；acetic acid

TS264．2

0254-5071（2016）01-0038-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．009

2015-10-28

湖北省自然科學基金（2015CFB678）；湖北省級教育部門青年人才項目（Q20151412）

陳洋（1988-），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物和發酵工程。

胡勇（1980-），男，講師，博士研究生，研究方向為細胞工程。