嗜酸乳桿菌細菌素對鮮乳保質期的影響及防腐技術體系的建立

王　瑩，趙瑞香，馬艷艷，梁新紅（河南科技學院 食品學院，河南 新鄉 453003）

嗜酸乳桿菌細菌素對鮮乳保質期的影響及防腐技術體系的建立

王瑩，趙瑞香*，馬艷艷，梁新紅
（河南科技學院 食品學院，河南 新鄉 453003）

研究嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）產細菌素lactobacillin XH1對鮮乳保質期的影響。將0.5 g/kg嗜酸乳桿菌細菌素lactobacillin XH1分別添加到鮮乳和消毒鮮乳中，分析其在4℃貯藏期間抑菌活性、酸度、感官特性的變化趨勢。通過在消毒鮮乳中添加嗜酸乳桿菌細菌素lactobacillin XH1，建立消毒鮮乳防腐應用中的危害分析和關鍵環節控制點（HACCP）技術體系。結果表明，4℃條件下貯藏，添加細菌素lactobacillin XH1的乳樣的抑菌活性顯著大于未添加細菌素lactobacillin XH1的乳樣，且酸度變化趨勢平緩，仍保持產品原有的風味、色澤、質構等感官特性，有效地延長鮮乳保質期2 d，消毒鮮乳保質期4～6 d。并建立了嗜酸乳桿菌細菌素lactobacillinXH1在消毒鮮乳防腐應用中的HACCP體系，確保產品的安全性。

嗜酸乳桿菌；細菌素；鮮乳；保質期；危害分析與關鍵控制點

牛乳營養豐富全面，是最理想的天然食品，西方人稱牛乳是人類的保姆，它所具有的原生營養性是其他任何人造營養品都無法比擬的［1-3］。除膳食纖維外，牛乳含有人體所需要的全部營養物質［4-5］。正是由于牛乳有著豐富而完全的營養成分，所以它是各種微生物的天然培養基［6］，極易被微生物所污染，從而使牛乳及乳制品的保質期大為縮短，影響乳及其產品的質量。因此，尋找一種天然而經濟的乳品防腐劑并建立相應的防腐技術體系，一直是乳品工業和研究人員所關心的問題［7］。

危害分析與關鍵點控制（hazard analysiscriticalcontrol point，HACCP）體系是通過實踐驗證最具科學性的能夠確保食品安全與衛生的預防性控制體系，其在乳及乳制品中的應用是對于其在生產過程中實施全過程的危害分析和關鍵點控制，并確定預防措施，以期消除或降低在生產的各個環節可能造成的危害，從而提高食品的安全性，達到控制以及監管的目的，降低食源性疾病的發生，為食品生產提供了更為安全的產品質量控制方法［8-11］。由于HACCP體系是目前保證食品安全性最有效和最經濟的方法，所以其在食品生產中的廣泛應用必將是未來發展的趨勢［12-13］。

人們對化學防腐劑的安全性越來越擔憂，利用食品級微生物嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）產生的細菌素［14-16］作為生物型防腐劑，阻止乳中腐敗菌和致病菌的生長繁殖，從而克服化學防腐劑的安全隱患，對于提高乳和乳制品的安全與品質，有著重要的現實意義。食品安全國家標準GB/T 2760—2014《食品添加劑使用標準》中規定乳酸鏈球菌在乳及乳制品中的最大添加量為0.5 g/kg［17-18］。鑒于此，本試驗將嗜酸乳桿菌發酵上清液經70%飽和度硫酸銨沉淀透析，HiTrap Capto Q離子柱進一步純化，冷凍干燥后所得細菌素lactobacillin XH1，按照0.5 g/kg添加到鮮乳和消毒鮮乳中，在4℃下貯藏，考察和評價細菌素lactobacillin XH1對于延長鮮乳及消毒鮮乳保質期的影響，建立嗜酸乳桿菌細菌素lactobacillin XH1在消毒鮮乳防腐應用中的HACCP技術體系，以期為嗜酸乳桿菌細菌素在乳及乳制品防腐應用中提供理論參考和技術支撐。

1　材料與方法

1.1料與試劑

嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）（簡寫為La-XH1）：由河南科技學院食品研究所保藏提供；鮮牛乳：新鄉市康元乳業有限公司。

MRS液體培養基［19］：蛋白胨1%，葡萄糖2%，乙酸鈉0.5%，酵母浸粉0.5%，牛肉膏1%，檸檬酸氫二銨0.2%，MgSO4·7H2O 0.058%，MnSO4·4H2O 0.025%，K2HPO40.2%，吐溫80 0.1%，調pH 6.2～6.4，121℃滅菌15m in。

蛋白胨、瓊脂粉、牛肉膏、硫酸鎂、硫酸錳、酵母浸粉、葡萄糖、吐溫-80、磷酸氫二鉀、檸檬酸二銨、無水乙酸鈉、氯化鈉、瓊脂等均為國產生化試劑和分析純。

1.2器與設備

SW-CJ-1D單人單面垂直凈化工作臺：蘇州智華凈化精密儀器有限公司；SHP-250型生化培養箱：上海三發科學儀器有限公司；YXQ-LS-50G型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅儀器有限公司；101-3型恒溫干燥箱：上海浦鴻儀器廠；JA2003型電子天平：上海浦春計量儀器有限公司；H2050R臺式高速冷凍離心機湘儀：湖南湘儀實驗儀器開發公司；85-1B型磁力攪拌器：上海鷹迪儀器設備有限公司；FT74XTS UHT/HTST系統：湖北恒綠工程技術有限公司。

1.3驗方法

1.3.1菌素lactobacillin XH1的制備［20］

將活化后的嗜酸乳桿菌La-XH1按2.5%的接種量加入到pH 6.5的MRS液體培養基中，37℃培養18h，經10000 r/min、4℃、15min離心去沉淀，經0.22μm孔徑無菌濾膜過濾后，放入4℃冰箱保存備用。發酵上清液中加入70%飽和度的硫酸銨，采用磁力攪拌器緩慢攪拌直至溶解，4℃下過夜，10 000 r/m in、4℃、10min離心收集沉淀蛋白，50mmol/L、pH 7.0磷酸鹽緩沖液溶解，截留分子質量為1 ku的透析膜在相同磷酸鹽緩沖液中透析24 h，在透析過程中多次更換緩沖液；再經HiTrap Capto Q離子柱進一步純化，收集目標峰后冷凍干燥。

1.3.2菌素lactobacillin XH1對鮮乳保質期的影響

在鮮乳中加入0.5 g/kg（按照食品安全國家標準防腐劑最大使用量）細菌素，并以無菌生理鹽水作對照，采用實驗室小型臺式真空包裝機進行無菌真空包裝，在4℃條件下貯藏，隔天測試培養基內的細菌菌落總數［21］，同時對牛乳進行酸度的測定［22］、煮沸實驗，并對乳的感官指標進行評價。

1.3.3菌素lactobacillin XH1對消毒鮮乳貨架期的影響

將提取的細菌素按照食品安全國家標準防腐劑最大使用量0.5 g/kg加入到消毒鮮乳中，在80～85℃條件下滅菌10～15 s，冷卻后無菌裝入塑料袋中，密封，在4℃下貯藏，加入等體積生理鹽水的消毒鮮乳作為空白對照。隔天測其細菌菌落總數，并對消毒鮮乳進行酸度的測定、煮沸實驗以及對乳的感官指標評價。

1.3.4官指標測試

將各種試驗處理下的乳樣，按時間段采樣，分別對其氣味、色澤、組織狀態、口感進行評定，滿分100分。評議小組由10位食品感官評定專家組成，評定標準見表1［23-25］。

表1　鮮乳感官評定標準Table 1 Sensory evaluation standard of fresh m ilk

1.3.5菌素lactobacillin XH1應用于消毒鮮乳中HACCP體系的建立

依據HACCP體系的7個原理和12項基本步驟［26］，將細菌素lactobacillin XH1應用于消毒鮮乳中，并對各工藝步驟可能會發生的生物性、物理性、化學性危害做出分析，確定控制措施、關鍵控制點和關鍵控制限值，建立糾偏措施、審核程序和記錄文件管理程序，逐步建立針對細菌素lactobacillin XH1應用于消毒鮮乳的HACCP計劃。

1.3.6據統計與分析

所有試驗數據均重復3次，采用Origin 7.0和Excel2003對各試驗數據進行統計學分析。

圖1　鮮乳在4℃下貯藏期間細菌菌落總數（a）和酸度（b）的變化Fig．1 Changes o f totalbacterial count（a）and acidity（b）of fresh m ilk at 4℃

2　結果與分析

2.1菌素lactobacillin XH1對鮮乳保質期的影響

將0.5 g/kg細菌素lactobacillin XH1添加到鮮乳中，無菌真空包裝，4℃條件下冷藏，隔天取乳樣測定其細菌菌落總數、酸度變化情況，結果見圖1，并對鮮乳進行煮沸試驗和感官評價，結果見圖2。

圖2　鮮乳在4℃下貯藏期間的感官評價Fig．2 Sensory evaluation of fresh m ilk during storage at4℃

由圖1、圖2可知，鮮乳在4℃下貯藏5 d內，不加細菌素的乳樣在第2天細菌數為3.0×106CFU/m L，酸度值為20°T，指標均超出鮮乳食品安全國家標準GB/T 19301—2010《生乳》中要求細菌菌落總數≤2×106CFU/g（m L）、酸度12～18°T的上限，并且經煮沸后乳樣開始出現凝固，第3天時乳樣出現大量絮片，色澤青色，有酸臭味產生。添加細菌素的乳樣各個指標均比對照變化緩慢，在貯藏的第4天，細菌菌落總數剛達到4.5×106CFU/m L，酸度20°T，開始出現腐敗變質現象。不加細菌素的鮮乳保質期為2 d，添加細菌素的鮮乳保質期為4 d，從而有效地延長鮮乳保質期2 d。因此細菌素lactobacillin XH1能夠有效抑制乳中雜菌的生長繁殖，控制鮮乳的酸敗，從而有效延長鮮乳保質期。

2.2菌素lactobacillin XH1對消毒鮮乳保質期的影響

將0.5 g/kg細菌素lactobacillin XH1添加到消毒鮮乳中，采用125～130℃下滅菌2～4 s的高溫短時（high temperature short time，HTST）殺菌，冷卻后真空無菌裝入塑料袋中密封，再4℃條件下冷藏，之后隔天測定乳樣的細菌數和酸度變化情況，結果見圖3，并對消毒鮮乳進行煮沸試驗和感官評價，結果見圖4。

由圖3、圖4可知，消毒鮮乳在貯藏期間，不加細菌素的乳樣在第34天細菌菌落總數達到1.2×105CFU/m L，酸度值為20°T，指標已超出消毒乳食品安全國家標準GB/T 19645—2010《巴氏殺菌乳》中要求細菌總數5×104～105CFU/g（m L）、酸度12～18°T的上限，在第36天時，明顯有酸味和稠狀物產生，煮沸后沉淀，色澤暗淡，發生嚴重腐敗變質現象；然而添加細菌素后的乳樣隨著貯藏時間的延長，細菌數比對照少2～3個數量級，在第40天細菌數的數量級才達到105，酸度值為25°T。由此得出不加細菌素的消毒乳的保質期為34～36d，添加細菌素的消毒乳的保質期為40 d。說明細菌素lactobacillin XH1對食品腐敗菌和致病菌有較好的抑制作用，因此，在消毒鮮乳中添加細菌素lactobacillin XH1，能夠有效的延緩生化反應速率，從而延長消毒鮮乳保質期4～6 d，提高產品的安全性。

圖3　消毒鮮乳在4℃下貯藏期間細菌菌落總數（a）和酸度（b）的變化Fig．3 Changes o f totalbacterial count（a）and acidity（b）of ste rilized fresh m ilk du ring storage at 4℃

圖4　消毒鮮乳在4℃下貯藏期間的感官評價Fig．4 Sensory evaluation o f sterilized freshm ilk during storage at4℃

2.3菌素lactobacillin XH1應用于消毒鮮乳中HACCP體系的建立

2.3.1菌素lactobacillin XH1應用型消毒鮮乳產品描述

配方：新鮮牛乳，純化后的嗜酸乳桿菌細菌素lactobacillin XH1。

感官特性：色澤呈均勻一致的乳白色或微黃色；具有消毒乳固有的純香味；組織細膩、均勻。

理化指標：脂肪≥3.1 g/100 g，蛋白質≥2.9 g/100 g，酸度16～18°T。

衛生指標：防腐劑，黃曲霉毒素，大腸桿菌數，金黃色葡萄球菌等致病菌均符合國家標準［17，24，27］。

2.3.2毒鮮乳制作工藝流程

2.3.3毒鮮乳生產過程危害分析與關鍵控制點（CCP）的確定

乳與乳制品在儲存、運輸、生產加工到產品銷售各個環節中均可能受到生物性、化學性、物理性的危害，從而引起污染而造成腐敗變質，使乳及乳制品喪失食用價值，并造成食源性疾病的發生。通過對消毒鮮乳生產加工步驟進行詳細的危害分析，并結合決策樹原則，確定了該消毒鮮乳生產過程中5個關鍵控制點（critical control point，CCP），即原料乳的驗收與處理、設備管道就地清洗（clean-in p lace，CIP）、標準化、HTST殺菌、無菌灌裝。通過對生產過程中的關鍵控制點CCP的控制，最大程度地減少或降低危害，以保持鮮乳的品質，提高鮮乳的安全性。

2.3.4HACCP計劃制定

對危害分析表中識別出的危害進行評估，將有可能發生和一旦失控可能給消費者帶來不可接受的健康風險的點確定為顯著危害，并提出有效的控制措施和糾偏措施。關鍵控制點是最能有效控制顯著危害的點［28］，根據5個關鍵控制點確定各控制點的關鍵限值、監控程序和糾偏措施，制作嗜酸乳桿菌細菌素Lactobacillin XH1應用于消毒鮮乳的HACCP計劃，結果見表2。

表2 HACCP計劃Table 2 HACCP plan

3　結論

食品級微生物嗜酸乳桿菌的代謝產物細菌素具有無毒、無害、無殘留、無抗藥性等優點，是目前最有應用前景的天然食品防腐劑之一，若將其應用于乳及乳制品中，不僅能夠克服化學防腐劑的安全隱患，也能夠持久保持防腐效果。研究表明，將本實驗室保藏的嗜酸乳桿菌La-XH1所產生的細菌素lactobacillin XH1按0.5 g/kg添加到鮮乳和消毒鮮乳中，驗證和評價了細菌素在延長鮮乳保質期中的明顯效果。由試驗結果得出，在4℃下，添加細菌素lactobacillin XH1能夠有效延長鮮乳保質期2d，消毒鮮乳保質期4～6d，說明嗜酸乳桿菌細菌素lactobacillin XH1可以有效控制乳品中微生物的生長，從而延緩鮮乳的腐敗變質。通過觀察鮮乳中添加細菌素lactobacillin XH1的變化，根據對消毒鮮乳生產過程各個環節可能造成的潛在危害進行物理、化學和生物分析，確定關鍵控制點、關鍵限值、監控程序、糾偏措施、驗證程序和記錄保持程序，逐步建立起嗜酸乳桿菌細菌素lactobacillin XH1應用于消毒鮮乳中HACCP防腐技術體系，以期為嗜酸乳桿菌細菌素在乳及乳制品防腐應用提供理論參考和技術支撐。

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Effects of bacteriocin produces by Lactobacillus acidophilus on the shelf-life of fresh milk and the establishment of preservative technology system

WANG Ying，ZHAORuixiang*，MA Yanyan，LIANG Xinhong
（College ofFood Science，Henan Institute ofScience and Technology，Xinxiang 453003，China）

The effectof lactobacillin XH1 from Lactobacillus acidophilus on freshm ilk shelf-lifewas researched.5 g/kg lactobacillin XH1 produced by L.acidophilus wasadded to freshmilk and sterilized freshmilk to analyze thevariation trend ofbacteriostatic activity，acidity，sensory characteristicsduring storage at4℃.Through adding lactobacillin XH1 into sterilized freshmilk，the hazard analysis critical control point（HACCP）system in the corrosion resistanceapplication of sterilized freshm ilkwould be established.The results indicated thatbacteriostatic activity ofm ilk samplew ith lactobacillin XH1 was significantly greater than that ofmilk sample without lactobacillin XH1.The variation trend of acidity was flat，and them ilk still kept the productoriginal sensory characteristics such as flavor，color and textural properties.A fter adding the lactobacillin XH1，the freshmilk shelf-lifewasextended 2 d，and the sterilized freshm ilk shelf-lifewas extended to 4-6 d.The HACCP system lactobacillin XH1 from L.acidophilus in the corrosion resistanceapplication of sterilized freshmilkwasestablished，which couldmake sure theproductsafety.

Lactobacillusacidophilus；bacteriocins；freshm ilk；shelf-life；HACCP

TS201．3

0254-5071（2016）01-0051-06

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．012

2015-11-18

河南省教育廳科學技術研究重點項目（12A 550004）；河南省科技攻關計劃項目（122102110117）；新鄉市科技創新平臺建設項目（CP1310）

王瑩（1989-），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。

趙瑞香（1966-），女，教授，博士，研究方向為食品生物技術。