多菌混合發酵產纖維素酶及生物法預處理秸稈的研究

白春艷，魏如騰，侯紅萍（山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 太谷 030801）

多菌混合發酵產纖維素酶及生物法預處理秸稈的研究

白春艷，魏如騰，侯紅萍*
（山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 太谷 030801）

對實驗室分離篩選的3株綠色木霉和6株枯草芽孢桿菌的生長及產酶情況進行了研究，綜合確定綠色木霉綠2與芽孢桿菌S3為混合菌中產纖維素酶酶活最高的組合。在此基礎上，采用解脂假絲酵母處理高粱秸稈。先將解脂假絲酵母的種子培養液按照3%的接種量接種到發酵產酶培養基中，隔24 h將綠色木霉綠2的孢子懸浮液按照2.67%的接種量接種到發酵產酶培養基中，再隔12 h將芽孢桿菌S3的種子培養液按照5.33%的接種量接種到發酵產酶培養基中，測定出的濾紙酶活（FPA）最高，為389.89 U/m L，比優化前提高了14.30%。

綠色木霉；枯草芽孢桿菌；混合菌；纖維素酶

Ketwords: Trichodermaviride；Bacillussubtilis；m ixed strain culture；cellulase

秸稈作為農作物經加工提取出果實后的剩余物，是一類極重要的可再生物質資源。但是目前我國秸稈資源并沒有得到充分有效的利用，大量秸稈被直接用于焚燒、填埋，這不僅是生物質資源的極大浪費，并且嚴重污染空氣和水源，影響動植物和人類的健康。因此，認識并了解我國農作物秸稈資源的利用開發和存在的主要問題，對于秸稈資源的合理化利用具有重要的意義。常見的秸稈預處理方法為物理預處理、化學預處理、生物預處理和組合預處理（如超聲波與堿法聯合預處理）。相比較而言，生物預處理方法因具有低能耗和環境友好的特點，近年來成為國內外研究的熱點［1-3］。

真菌通過分泌到胞外的游離纖維素酶，以水解酶機制和氧化酶機制降解纖維素，細菌纖維素酶則是以形成多酶復合體結構而起作用。纖維素酶是多組分酶系，需要各組分協同作用才能分解纖維素物質。但是，現有菌株生產的纖維素酶普遍酶解效率偏低、易失活，因此，利用復合菌株發酵可以克服酶活力低，酶系不完全的缺點。經研究表明，解脂假絲酵母可以將天然小麥秸稈表面的蠟質層分解掉，這樣可以省去利用酸、堿蒸煮法處理秸稈的步驟，降低對設備的要求，減少成本［4-7］。

本試驗以實驗室的幾株高產纖維素酶菌株為出發菌株，從混菌發酵的角度出發，進行細菌與霉菌之間的混合發酵試驗，在此基礎上，確定最佳復合菌組合。在上述試驗基礎上，添加了解脂假絲酵母，利用高粱秸稈作為主要碳源，研究了解脂假絲酵母、綠色木霉綠2和枯草芽孢桿菌S3這3株菌的混合生長及產酶情況。本試驗的目的旨在利用解脂假絲酵母來分解高粱秸稈的蠟質層，然后綠色木霉綠2將秸稈的纖維束結構崩解掉，最后細菌S3來吞食殘部。這樣的菌種混合發酵對分解高粱秸稈有很大的幫助。

1　材料與方法

1.1料與試劑

1.1.1劑

羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethylcellolose，CMC-Na）（分析純）：天津市科密歐試劑開發中心；微晶纖維素：國藥控股集團；水楊苷：美國Sigma公司；高粱秸稈、玉米芯粉、谷子秸稈：市售產品或自制；3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）：天津市科密歐試劑開發中心。

1.1.2種

3株綠色木霉（Trichodermaviride）（綠1～綠3）、6株枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）（S1～S6）、解脂假絲酵母（Candida lipolytica）均為山西農業大學微生物實驗室保藏。

1.1.3養基

（1）馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：去皮馬鈴薯200 g切塊，加水煮沸20min，用四層紗布過濾，然后再在濾液中加入20 g蔗糖和15～20 g瓊脂，加熱溶化后補水至1 000m L，pH自然，121℃滅菌30min。

（2）牛肉蛋白胨培養基：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1.0 g，氯化鈉0.5 g，水100m L，瓊脂2 g，pH 7.2，121℃滅菌20min。

（3）麥芽汁培養基：取一定量的大麥芽，研磨，加入麥芽量4倍水，在55～60℃保溫糖化，并不斷的攪拌3～4 h，用紗布過濾去渣，煮沸后再用濾紙或脫脂棉過濾一次，加水稀釋成10～12°Bx麥芽汁，加入2%瓊脂，pH自然，115℃滅菌20m in。

（4）混合發酵產酶培養基：麩皮5 g，蛋白胨0.3 g，（NH4）2SO40.3 g，KH2PO40.1 g，MgSO4·7H2O 0.03 g，NaCl 0.5 g，水100m L，pH自然，121℃滅菌20m in。

1.2器與設備

722E型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；TGL-16G高速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；奧林巴斯CX23雙目顯微鏡：奧林巴斯（上海）映像銷售有限公司；DHP-500型電熱恒溫培養箱：北京光明醫療儀器廠；HH-4數顯恒溫水浴鍋：金壇市科析儀器有限公司；YXQ-LS-50S11壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.3法

1.3.1維素酶活力的測定

纖維素酶活力的測定采用DNS法［8-9］。

1.3.2切葡聚糖酶活力的測定

在25m L刻度試管中加入0.5m L適當稀釋的澄清酶液和1.0m L用pH 4.8的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制的質量濃度1%的羧甲基纖維素懸浮液。蓋上塑料布，用橡皮筋扎緊。50℃水浴，振幅80mm，保溫30m in。取出迅速加入DNS溶液2m L，100℃煮沸5min，水浴冷卻后定容至25m L，搖勻，波長550 nm處測定吸光度值。反應生成的葡萄糖的量根據酶解葡萄糖標準方程（定容至25m L，測定CMC酶活）求得。酶活定義：在50℃、pH值4.8條件下，1min從底物溶液中分解產生1μg還原糖（表示為還原糖當量）所需要的酶量即為一個酶活單位，U/m L［10-12］。

1.3.3切葡聚糖酶活力的測定

在25m L刻度試管中加入0.5m L適當稀釋的澄清酶液和1.0m L用pH 4.8的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制的質量濃度1%的微晶纖維素懸浮液，測定外切葡聚糖酶活力，方法同上。

1.3.4-葡萄糖苷酶活力的測定

在25m L刻度試管中加入0.5m L適當稀釋澄清酶液和1.0m L用pH 4.8的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制成的質量濃度1%的水楊苷溶液，測定β-葡萄糖苷酶活力，方法同上。

1.3.5紙酶活力的測定

在25m L刻度試管中放入1 cm×6 cm的新華濾紙條，加入0.5m L適當稀釋澄清酶液和1.0m L pH 4.8的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，測定濾紙酶活（filter paperactivity，FPA），方法同上。

1.3.6萄糖標準曲線的制作

用無水葡萄糖（105℃烘干至質量恒定）配制成1 mg/m L的葡萄糖標準溶液，分別取此標準溶液0、0.2m L、0.4m L、0.6m L、0.8m L、1.0m L、1.2m L于比色管中，補水至2.0m L，加入2.0m LDNS試劑，具塞沸水浴5min，立即冷卻，終止反應，定容至25m L，搖勻后，在波長550 nm處測定吸光度值，每管重復測3次，結果取平均值。以吸光度值為縱坐標，葡萄糖含量為橫坐標繪制曲線并建立回歸方程。

1.3.7菌組合的接種方式、比例和時間的確定

分別在綠色木霉和枯草芽孢桿菌中進行篩選，通過比較其產酶的影響，得出最佳菌株組合。并繼續與解脂假絲酵母進行組合，以三種復合菌株降解秸稈，并得出最佳接種量、時間以及接種比例。

2　結果與分析

2.1萄糖標準曲線的繪制

圖1　葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1可知，葡萄糖標準曲線回歸方程為y=0.560 7x-0.007 5，相關系數R2為0.999 1，表明標準曲線線性關系良好。

2.2 S系列枯草芽孢桿菌酶活力的測定

取250m L三角瓶，裝入100m L發酵產酶培養基，取8%細菌種子培養液接種到發酵產酶培養基上，35℃、150 r/min搖床振蕩培養。培養液4 000 r/m in、4℃離心20 m in，上清液為酶液。分別取發酵1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d的粗酶液0.5m L測定其內切酶、外切酶、β-葡萄糖苷酶酶活和濾紙酶活，所得結果見表1。

表1　六株枯草芽孢桿菌各酶活之間的比較Table 1 Com parison ofenzyme activity ofsix strains of Bacillus subtilis

由表1可知，以內切酶活和外切酶活為例，枯草芽孢桿菌S2、S3、S4、S5酶活峰值較高，但枯草芽孢桿菌S2、S3、S4的峰值出現較早，分別在第4、第3天達到酶活最高值；以β-葡萄糖苷酶活和濾紙酶活為例，枯草芽孢桿菌S3、S4、S5酶活峰值較高，但枯草芽孢桿菌S3、S4的峰值出現較早。綜合考慮，枯草芽孢桿菌S3和S4的酶活較高，而且峰值出現較早，選擇S3和S4進行菌株混合試驗。

2.3色木霉酶活力的測定

酶液處理方法同2.2。分別取1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d的粗酶液0.5m L測定其內切酶、外切酶、β-葡萄糖苷酶酶活和濾紙酶活，所得結果見表2。

表2　三株綠色木霉各酶活之間的比較Table 2 Compa rison of enzym e ac tivity of three strains of Trichoderma viride

由表2可知，綠1、綠2酶活峰值較高，而且峰值出現較早，分別在第4、第3天達到酶活最高值，選擇綠1和綠2進行菌株混合試驗。

2.4佳混合菌組合確定

由于天然單菌的酶組分單一、配比不均衡，故將不同菌種進行混合培養，優勢互補，有利于完善纖維素酶組分、提高酶活、縮短產酶周期、提高纖維素降解效率，因此本試驗選用酶活峰值較高，并且峰值出現較早的枯草芽孢桿菌S3、S4和綠色木霉綠1、綠2作為混合菌研究對象，以比例1∶1進行組合，以篩選出最佳菌種組合，實驗結果見表3。

表3　四種混合菌各酶活之間的比較Table 3 Com parison of enzyme activity of four kinds of m ixed strain cu lture

由表3可知，四個組合所達到的最大酶活與四株單菌相比有不同程度的增加。說明組合后形成較好的生物降解體系。另外，據測得的酶活大小得出，組合2的內切葡聚糖酶活分別是出發菌枯草芽孢桿菌S3的2.24倍和綠色木霉綠2的2.15倍；外切葡聚糖酶活分別是出發菌枯草芽孢桿菌S3的2.81倍和綠色木霉綠2的2.55倍；β-葡萄糖苷酶活分別是出發菌枯草芽孢桿菌S3的3.00倍和綠色木霉綠2的3.34倍；濾紙酶活分別是出發菌枯草芽孢桿菌S3的2.03倍和綠色木霉綠2的2.06倍；綜合考慮，組合2的4種酶活都比較高而且出現的峰值也較早。因此，選擇枯草芽孢桿菌S3與綠色木霉綠2（1∶1）為最佳組合。

2.5合菌對不同秸稈的降解效果

為了研究綠色木霉與枯草芽孢桿菌酶系之間的互補作用，以內切酶、外切酶、β-葡萄糖苷酶酶活和濾紙酶活為考察指標，確定最佳混合菌組合。根據參考文獻［13-15］以水解濾紙的酶活力代表纖維素酶的總活力（FPA酶活）為考察指標。并采用折中的方法，取混合菌的培養溫度為33℃。

取250m L三角瓶，裝入100m L混合發酵產酶培養基，取組合2混合菌（綠色木霉綠2∶枯草芽孢桿菌S3=1∶1）培養液，以接種量8%接種到發酵產酶培養基上、33℃、150 r/m in搖床振蕩培養。培養液4 000 r/m in、4℃離心20min，上清液為酶液。發酵原料是選自同一產地的高粱秸稈、谷子秸稈和玉米芯，粉碎過40目篩網，接種混合菌組合2培養液，適宜條件下培養6 d，測定FPA酶活。將玉米芯為唯一碳源時測得的FPA酶活定義為100%，比較相對FPA酶活的大小，結果見圖2。

圖2　不同秸稈對產酶的影響Fig.2 Effects of different straw on enzyme production

由圖2可知，混合菌組合2對高粱秸稈的降解效果優于谷子秸稈和玉米芯，故后續試驗采用高粱秸稈為發酵原料，即高粱秸稈作為主要碳源。

2.6色木霉與枯草芽孢桿菌接種方式、接種比例以及時間的確定

取250m L三角瓶，裝入100m L發酵產酶培養基，高粱秸稈作為主要碳源，33℃、150 r/min搖床振蕩培養。培養液4 000 r/min、4℃離心20min，上清液為酶液，取培養液進行試驗。

2.6.1合菌接種方式對秸稈降解效果的影響

取組合2混合菌培養液8%接種到發酵產酶培養基上，在接種總量一定的條件下，將綠色木霉綠2和枯草芽孢桿菌S3按1∶1的比例采用同時接種、先接綠色木霉綠2，隔12 h接枯草芽孢桿菌S3和先接枯草芽孢桿菌S3，隔12 h接綠色木霉綠2三種接種方式，分別測定FPA酶活，結果見表4。

表4　不同接種方式對FPA酶活的影響Table 4 Effects of diffe rent inoculation m ethods on FPA activity

由表4可知，不同的接種方式酶活存在著差異。先接綠色木霉綠2，隔12 h接種枯草芽孢桿菌S3，這種接種方式其FPA酶活最高，為332.17U/m L。

2.6.2合2混合菌的接種比例對秸稈降解效果的影響

取組合2混合菌培養液在接種總量一定（8%）的條件下，先后接種到發酵產酶培養基上，按照先接綠色木霉綠2，隔12h接枯草芽孢桿菌S3的接種方式，采用綠色木霉綠2∶枯草芽孢桿菌S3=1∶1、綠色木霉綠2∶枯草芽孢桿菌S3=1∶2、綠色木霉綠2∶枯草芽孢桿菌S3=2∶1三種接種比例，分別測定FPA酶活，結果見表5。

表5　不同接種比例對FPA酶活的影響Table 5 Effects of different inoculation ratio on FPA activity

由表5可以看出，當綠色木霉綠2∶枯草芽孢桿菌S3接種量為1∶2（即綠色木霉綠2接種量2.67%，芽孢異菌S3接種量5.33%）時，其FPA酶活最高，為341.11U/m L。

2.6.3合菌的接種時間對秸稈降解效果的影響

取組合2混合菌培養液接種到發酵產酶培養基上，在接種總量為8%的條件下，按照先接綠色木霉綠2，再接枯草芽孢桿菌S3的接種方式，綠色木霉綠2∶枯草芽孢桿菌S3=1∶2的接種比例，采用不同的接種時間∶先接綠色木霉，隔12 h、24 h、36 h、48 h、60 h接枯草芽孢桿菌S3的種子液接入發酵培養基中發酵6 d，測定FPA酶活，結果見表6。

表6　枯草芽孢桿菌接種時間對FPA酶活的影響Table 6 Effects of Bacillus subtilis inocu lation time on FPA activity

由表6可以看出，菌齡對纖維素酶的生產有較大影響。當時間過短時，由于菌體數量不足，酶活較低；當時間過長時，酶活反而降低。所以，最適宜的接種時間為12 h，此時FPA酶活最高，為341.11U/m L。

綜上可知，混合菌的接種方式為先接綠色木霉綠2，隔12 h接枯草芽孢桿菌S3、接種比例為綠色木霉綠2∶接枯草芽孢桿菌S3=1∶2。

2.7脂假絲酵母與混合菌對高粱秸稈降解的最佳接種量，接種時間的確定

取250m L三角瓶，裝入100m L發酵產酶培養基，高粱秸稈作為主要碳源，33℃、145 r/m in搖床振蕩培養。培養液4 000 r/min、4℃離心20min，上清液為酶液。在得出綠色木霉與枯草芽孢桿菌的接種條件后，再與解脂假絲酵母進行復配，得出三種混合菌的接種條件。

2.7.1脂假絲酵母與混合菌對秸稈降解的最佳接種量的確定

先將解脂假絲酵母的種子培養液按照不同的接種量1%、2%、3%、4%、5%、6%接種到發酵產酶培養基上，隔12 h再取8%組合2混合菌培養液按照優化的條件接種到發酵產酶培養基上，測定其FPA酶活，結果見表7。

表7　解脂假絲酵母接種量對FPA酶活的影響Table 7 Effects of C andida lipo lytica inoculum on FPA activity

由表7可知，解脂假絲酵母是可以將高粱秸稈表面的蠟質層分解掉，當解脂假絲酵母的接種量過高或過低時，其FPA酶活都很低，而當接種量為3%時，FPA酶活最高，為369.82U/m L。

2.7.2脂假絲酵母與混合菌對秸稈降解的最佳接種時間的確定

先將解脂假絲酵母的種子培養液按照3%的接種量接種到發酵產酶培養基上，分別隔0、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h后，隔24 h將綠色木霉綠2的孢子懸浮液按照2.67%的接種量接種到發酵產酶培養基中，再隔12 h將枯草芽孢桿菌S3的種子培養液按照5.33%的接種量接種到發酵產酶培養基中，測定其FPA酶活，結果見表8。

表8　綠色木霉接種時間對FPA酶活的影響Table 8 Effects of Trichoderma viride inoculation time on FPA activity

由表8可以看出，先將解脂假絲酵母的種子培養液按照3%的接種量接種到發酵產酶培養基中，隔24 h將綠色木霉綠2的孢子懸浮液按照2.67%的接種量接種到發酵產酶培養基中，再隔12h將枯草芽孢桿菌S3的種子培養液按照5.33%的接種量接種到發酵產酶培養基中，其測定的FPA酶活最高，為389.89U/m L，FPA酶活比未優化前提高了14.30%。

3　結論

研究了綠色木霉與枯草芽孢桿菌共9株菌的生長及產酶情況，通過比較4組混合菌的酶活大小，綜合確定組合綠色木霉綠2與枯草芽孢桿菌S3是產酶酶活最高的混合菌，在此基礎上，采用解脂假絲酵母處理高粱秸稈。先將解脂假絲酵母的種子培養液按照3%的接種量接種到發酵產酶培養基中，隔24 h將綠色木霉綠2的孢子懸浮液按照2.67%的接種量接種到發酵產酶培養基中，再隔12 h將枯草芽孢桿菌S3的種子培養液按照5.33%的接種量接種到發酵產酶培養基中，其測定的FPA酶活最高，即389.89U/m L，其FPA酶活比未優化前提高了14.30%。

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Multi-strains fermentation for cellulose production and straw pretreatment with biological method

BA IChunyan，WEIRuteng，HOU Hongping*
（College ofFood Science and Engineering，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China）

The grow th and enzyme production conditions of three strains of Trichoderma viride and six strainsof Bacillus subtilis screened were studied.The results showed that the combination of T.viride 2 and B.subtilis S3 had the highest cellulose-producing activities.On this basis，sorghum straw was preprocessed by Candida lipolytica.Firstly，the seed cultureof C.albicans was inoculated into the fermentationmedium w ith inoculum 3%. Then after 24 h，spore suspension of T.viride 2 was inoculated into the fermentationmedium w ith inoculum 2.67%.Lastly，after 12 h，the seed culture of B.subtilis S3 was inoculated into the fermentationmedium w ith inoculum 5.33%.Under this condition，the FPA activity was highest of 389.89 U/m l，which increased by 14.30%than beforeoptim ization.

TS262．2

0254-5071（2016）01-0057-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．013

2015-09-29

山西省科技攻關項目（No.201403110192）

白春艷（1988-），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物與發酵技術。

侯紅萍（1965-），女，教授，碩士，研究方向為食品與發酵工程。