ARTP誘變選育中溫α-淀粉酶高產菌株及其發酵條件優化

王興吉，劉文龍，錢娟娟（山東隆科特酶制劑有限公司，山東 臨沂 276400）

ARTP誘變選育中溫α-淀粉酶高產菌株及其發酵條件優化

王興吉，劉文龍*，錢娟娟
（山東隆科特酶制劑有限公司，山東 臨沂 276400）

利用常壓室溫等離子體（ARTP）技術，對產中溫α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌菌株進行誘變處理，通過平板、深孔板初篩及搖瓶復篩共篩選出3株酶活明顯提高的菌株，其中產酶活力最高的突變株BS-12，搖瓶酶活達到了801U/mL，較出發菌株提高了32.2%。通過單因素試驗，得到的最佳發酵條件為接種量6%，溫度36℃，發酵時間68 h。在此條件下，搖瓶酶活力達到1 395U/m L，經30 L發酵罐放大，酶活達到了1 553U/m L。

常壓室溫等離子體；中溫α-淀粉酶；發酵條件；優化；枯草芽孢桿菌

中溫α-淀粉酶是指一類最適反應溫度在50～70℃的α-淀粉酶，已經廣泛應用于淀粉糖［1］、焙烤工業［2-3］、啤酒釀造［4］、酒精工業等行業，也用于飼料、紡織［5-6］、造紙［7］、醫藥［8］等各個領域。目前，國內對中溫α-淀粉酶的研究不多，大多數科研院所已轉向耐高溫α-淀粉酶、酸性α-淀粉酶、堿性α-淀粉酶等領域。

常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變技術的射流溫度為25～35℃，且分布均勻，對于環境和人均無危害，無真空裝置，設備簡單易于操作，與生物大分子和細胞作用明顯，同時有獨特的SOS修復機制，基于以上優勢，已經成為誘變領域的研究熱點。本研究以枯草芽孢桿菌為出發菌株，通過ARTP誘變技術進行誘變處理［9-10］，并對高產突變菌株的發酵條件進行優化，提高了生產能力和發酵水平，對促進我國酶制劑工業的發展具有現實意義。

1　材料與方法

1.1料與試劑

1.1.1株與試劑

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：本公司省重點實驗室保藏菌株。

葡萄糖、氯化鈉、硫酸銨、磷酸氫二鈉、氯化鈣、瓊脂均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司；蛋白胨、酵母浸出物、酵母粉、營養肉湯：美國BD公司；糊精、玉米漿：青援食品有限公司；豆餅粉、玉米粉：市售。

1.1.2養基

斜面培養基：蛋白胨1%，酵母浸出物0.5%，氯化鈉1%，瓊脂2%，pH值自然。

種子培養基：蛋白胨1%，酵母浸出物0.5%，氯化鈉1%，pH值6.6。

平板篩選培養基：葡萄糖2%，氯化鈉0.2%，酵母粉0.2%，營養肉湯0.3%，蛋白胨0.5%，玉米淀粉1%，瓊脂1.3%，pH值7.0左右。

深孔板、搖瓶發酵培養基：糊精4.2%，硫酸銨0.4%，磷酸氫二鈉1.5%，氯化鈣0.27%，調pH值7.0，加入碳酸鈣1%。

30 L發酵培養基：玉米淀粉5%，玉米粉6%，豆餅粉1%，玉米漿1.4%，磷酸氫二鈉0.8%，消泡劑、液化酶適量，pH 6.5。

1.2器與設備

ARTP-IIS常壓室溫等離子體誘變系統：無錫思清源生物科技有限公司；ZWF-B3612搖瓶機、ZXSD-A 1270生化培養箱：上海智誠分析儀器制造有限公司；Plus384酶標儀：美國MD公司；5810R離心機：德國Eppendorf公司；30 L發酵罐：上海國強生化有限公司。

1.3法

1.3.1活測定方法

酶活的測定按照國家標準GB 8275—2009《食品添加劑—α-淀粉酶制劑》執行。

酶活定義：1m L液體酶于60℃，pH 6.0條件下，1 h液化1 g可溶性淀粉，即為1個酶活力單位，以U/m L表示。

1.3.2菌懸液的制備

離心收集培養至對數期的種子液，用生理鹽水洗滌兩次，然后用生理鹽水稀釋成濃度為106～108CFU/m L的菌懸液。

1.3.3ARTP誘變

吸取10μL菌懸液于載片中央并涂抹均勻，用無菌鑷子將載片放于ARTP系統操作室旋轉臺上的對應孔位，調整照射距離2mm，氣流量10 L/min，功率100W，然后進行誘變處理。本實驗將出發菌株分別處理0、5 s、10 s、15 s、20 s、25 s、30 s，通過菌落數計算菌株的致死率，并繪出致死率曲線［9］。致死率計算公式如下：

式中：m為經ARTP處理后平板上平均菌落數，CFU；n為未經ARTP處理平板上菌落數，CFU。

1.3.4變菌株篩選

初篩：采用平板和深孔板相結合的方法。將誘變后的菌液涂布于平板篩選培養基上，34℃培養36 h，挑選淀粉水解圈直徑與菌落直徑比值超過6.5的菌株；將這些菌落轉入深孔板，34℃培養36 h，培養結束后用酶標儀測定上清液酶活［11-12］。

復篩：將初篩篩選出的誘變菌株分別進行搖瓶發酵，34℃培養50h，每組設置3個平行試驗，發酵結束測定酶活。

1.3.5酵條件優化單因素試驗

在原有發酵工藝基礎上，在裝液量100m L/500m L，搖床轉速200 r/m in的條件下進行搖瓶培養，分別對接種量、溫度、發酵時間進行優化。

接種量的確定：采用2%、4%、6%、8%和10%的接種量，34℃發酵50 h后測定酶活，以確定最佳接種量。

溫度的確定：采取恒溫發酵的方式，以32℃、34℃、36℃、38℃、40℃作為培養溫度、按6%的接種量接種，發酵50 h后測定酶活，以確定最佳培養溫度。

發酵時間的確定：按6%的接種量接種，36℃培養，發酵24 h后，每隔4 h測定酶活，以確定最佳發酵時間。

1.3.6優條件下的搖瓶實驗

根據1.3.5的試驗結果，選取最優發酵條件，進行搖瓶培養，發酵結束測定酶活。

1.3.730 L發酵罐放大實驗

為了驗證優化后發酵條件效果，采用30 L發酵罐對發酵條件進行放大實驗。固定裝液量60%，接種量6%，溫度36℃，罐壓0.06MPa，通氣量3m3/h，發酵時間68 h。發酵結束后，測定酶活力。

1.3.8變菌株的遺傳穩定性實驗

誘變株在平板上進行6次傳代培養，對每1代菌株進行搖瓶發酵，測定酶活力，以檢測誘變菌株的遺傳穩定性［13-15］。

2　結果與分析

2.1變菌株的篩選結果

2.1.1ARTP誘變致死率曲線的測定

按方法1.3.3對出發菌株誘變致死率進行計算，并獲得致死率曲線，結果如圖1所示。

圖1　枯草芽孢桿菌的ARTP致死率曲線Fig.1 Fatality ra te curve of Bacillus subtilis with the ARTP treatm ent

由圖1可知，隨著誘變時間的增加，致死率不斷上升。當誘變時間為15 s時，致死率＞90%，而時間達到20 s時，致死率＞99%，本實驗將致死率設定為90%以上即可，故誘變處理時間確定為15 s。

2.1.2變菌株初篩

共挑選出1 600個淀粉水解圈直徑與菌落直徑比值超過6.5的菌落。通過深孔板篩選出酶活提高15%以上的誘變菌株共36株。

2.1.3變菌株復篩

將初篩篩選出的誘變菌株分別進行搖瓶發酵，測定其酶活力，搖瓶發酵后酶活測定結果見表1。由表1可知，菌株BS-12的發酵水平最高，所以選用BS-12進行后續實驗。

表1　菌株復篩結果Tab le 1 Secondary screening results of the m utan t strains

2.2酵條件優化結果

2.2.1種量對酶活力的影響

接種量對菌株發酵酶活力的影響見圖2。由圖2可知，接種量＜6%時，酶活力隨接種量的增大而增高，接種量＞6%時，酶活力隨接種量的增大反而降低，當接種量為6%時，酶活力最高。接種量的多少主要影響菌體的生長速度和代謝強度，接種量小，延遲期長，不利于菌體快速大量繁殖；接種量大，菌體過早衰老，產酶期短，最終活力不高。故選擇接種量為6%。

圖2　接種量對α-淀粉酶活力的影響Fig.2 Effectof inoculum onα-am ylase activity

2.2.2度對酶活力的影響

溫度對菌株發酵酶活力的影響見圖3。由圖3可知，溫度對發酵活力有較大影響，溫度低于36℃，菌體生長緩慢，不易形成高密度發酵；溫度高于36℃，菌體生長快，自溶也快，發酵活力反而降低。溫度36℃時，酶活力最高，為1 050 U/m L，因此最佳培養溫度為36℃。

圖3　溫度對α-淀粉酶活力的影響Fig.3 Effecto f tem perature onα-am ylase activity

2.2.3酵時間對酶活力的影響

發酵時間對酶活力的影響見圖4。由圖4可知，24 h以后發酵液酶活力逐漸升高，隨著時間的延長在發酵68 h時酶活力達到最高，68 h以后酶活力隨著發酵時間的延長逐漸降低，故選擇發酵時間為68 h。

圖4　發酵時間對α-淀粉酶活力的影響Fig.4 Effectof different fermentation time onα-am ylase activity

2.2.4優條件下的搖瓶實驗結果

在最優的發酵條件下，3批搖瓶培養，酶活力分別為1 383 U/m L、1 416 U/m L、1 395 U/m L，平均酶活達到1 395U/m L，較優化前提高了74.2%。

2.330 L發酵罐放大實驗結果

在最優條件下采用30 L發酵罐對發酵條件進行放大實驗，3批放大實驗的酶活力分別為1 523U/m L、1 561U/m L、1 576 U/m L，平均酶活達到1 553U/m L，因此優化的發酵條件是可行的。

2.4變菌株的遺傳穩定性

誘變株BS-12在平板上進行6次傳代培養，對每1代菌株進行搖瓶發酵，測定酶活力，結果見表2所示。

表2　BS-12遺傳穩定性結果Table 2 Genetic stability experiments resultof strain BS-12

由表2可知，經ARTP誘變的BS-12菌株具有良好的遺傳穩定性，經6次傳代后，搖瓶發酵活力都維持在1300U/m L左右。

3　結論

對ARTP誘變處理的枯草芽孢桿菌進行篩選，獲取高產中溫α-淀粉酶的突變株BS-12，搖瓶酶活達到了801U/m L，較出發菌株提高了32.2%。該菌株具有良好的遺傳穩定性，6次傳代后搖瓶發酵活力維持在1 300U/m L左右。

對誘變菌株發酵條件進行優化，確定的最佳發酵條件為接種量6%，溫度37℃，發酵時間68 h。在此條件下，搖瓶酶活力達到1 395U/m L，經30 L發酵罐放大，酶活達到了1 553 U/m L。

［1］YAO W R，YAO H Y.Adsorbent characteristics of porous starch［J］. Starch，2002，54（6）:260-263.

［2］孫曉云，王小生.α-淀粉酶對面包品質的影響［J］.食品工業科技，2005，26（11）：65-67.

［3］汪釗，鄭裕國，葉月恒.真菌α-淀粉酶應用于面包生產的研究［J］.食品科學，1998，19（7）：29-32.

［4］趙望鋒，周晶.枯草芽孢桿菌產淀粉酶條件的優化［J］.湖北農業科學，2011，11（6）：2315-2317.

［5］HENDRIKSEN H V，PEDERSEN S，BISGARD FH.A process for textilewarp sizing using enzymaticallymodified starches:patentapplication WO99/35325［P］.1999.

［6］呂晶，陳水林.酶及其在紡織加工中的應用［J］.紡織學報，2002，2（23）：155-157.

［7］BRUINENBERGPM，HULST A C，FABERA，etal.A process for surface sizing or coating of paper:European Patent Application EP 0，690，170A1［P］.1996.

［8］李志鵬.解淀粉芽孢桿菌的選育及產中溫α-淀粉酶的研究［D］.無錫：江南大學碩士論文，2010.

［9］范新蕾，肖成建，顧秋亞，等.ARTP誘變選育葡萄糖氧化酶高產菌株及發酵條件優化［J］.工業微生物，2015，45（1）：15-19.

［10］MA Y FF，YANGH Q，CHEN X Z，etal.Significantly improving the yield recombinantproteins in Bacillus subtilis by a novel powerfulmutagenesis tool（ARTP）:Alkalineα-amylase as a case study［J］.Protein Expres Purif，2015，114:82-88.

［11］蔡友華，李文鋒，盧偉寧，等.新型常壓室溫等離子體（ARTP）快速誘變高產蘇氨酸的突變株［J］.現代食品科技，2013，29（8）：1888-1892.

［12］金麗華，方明月，張翀，等.常壓室溫等離子體快速誘變產油酵母的條件及其突變株的特性［J］.生物工程學報，2011，27（3）：461-467.

［13］楊穎，玉王寧，金一，等.常壓室溫等離子體快速誘變綠色糖單孢菌篩選木聚糖酶高產菌株及其酶學性質研究［J］.微生物學通報，2013，40（5）：905-915.

［14］王方方，孫沛勇，銀會娟，等.常壓室溫等離子體快速誘變酒精酵母及其突變株的特性研究［J］.中國釀造，2013，32（10）：117-119.

［15］陳泉，吳遠征，扈進冬，等.高產M onacolin K紅曲霉菌種的篩選及液態發酵條件研究［J］.中國釀造，2015，34（6）：43-47.

Screening of medium-temperature α-amylase high-yield strains by ARTP and its fementation conditions optimization

WANG X ingji，LIUWenlong*，QIAN Juanjuan
（Shandong Long Kete Enzyme Co.，Ltd.，Linyi276400，China）

The Bacillus subtilis strainswhich producemedium-temperature α-amylase weremutated by atmospheric and room temperature plasma（ARTP）mutagenesis.Three strains which had higherα-am ylase activity were screened through plate and deep hole plate screening and flask secondary screening.Thestrain BS-12 had the highestenzyme-producing activity of 801 U/m l，which was32.2%higher than thatof the original strain. A ftersingle factorexperiment，theoptimal fermentation conditionswereas follows:inoculum 6%，fermentation temperature 37℃and time 68 h.Under the condition，the enzyme activitywas1 395 U/m l in flask.However，the experimentwas scaled-up by 30 L fermentation tank，and the enzyme activity reached 1 553 U/m l.

atmospheric and room temperatureplasma；medium-temperatureα-amylase；fermentation conditions；optim ization；Bacillus subtilis

TQ925

0254-5071（2016）01-0078-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．017

2015-10-27

王興吉（1970-），男，工程師，碩士，研究方向為酶制劑生產與開發。

劉文龍（1982-），男，工程師，碩士，研究方向為酶制劑生產與開發。