二次發酵降低葡萄酒中雙乙酰的含量

李　憑，石婷婷，肖冬光（天津科技大學 生物工程學院，工業微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津 300457）

二次發酵降低葡萄酒中雙乙酰的含量

李憑，石婷婷，肖冬光*
（天津科技大學 生物工程學院，工業微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津 300457）

該文通過在葡萄酒發酵后期添加蔗糖，促使酵母進行二次發酵降低雙乙酰的含量。結果表明，二次發酵的最適加糖量為28 g/L，與常規發酵相比，二次發酵后雙乙酰含量降低了29.87%；在此基礎上，對酵母菌株WY1、WY1-1、WY1-2和WY1-12進行加糖二次發酵試驗，測定出4株菌均可降低發酵液中雙乙酰的含量，其中菌種WYI-12的發酵液中雙乙酰的含量最低，為4.05mg/L，比常規發酵降低了37.21%，改善了葡萄酒的感官質量。

葡萄酒；二次發酵；雙乙酰

雙乙酰是葡萄酒中一種重要的風味物質。適量的雙乙酰會增加葡萄酒的香氣，改善葡萄酒的風味。一般情況下，當葡萄酒中雙乙酰含量為1～4mg/L時，可增加葡萄酒的口感及風味復雜性，呈現悅人的黃油味或奶酪味；當含量超過5～7mg/L時，就可能產生令人生厭的“餿飯味”，葡萄酒表現變質跡象［1-2］。不同的酒體中雙乙酰的感覺閾值有所不同，其不僅與消費者的喜好有很大的相關性［3］，而且很大程度上依賴于葡萄酒中存在的其他成分［4-5］，如MARTINEAU B等［6］報道的紅葡萄酒中雙乙酰出現“餿飯味”的閾值為10mg/L，而BARTOWSKY E J等［7］報道赤霞珠紅葡萄酒雙乙酰的閾值為2.8mg/L。由于雙乙酰的風味閾值較低，在生產實踐中，除了合理的生產工藝，還必須考慮雙乙酰的生成途徑與消除方法。

雙乙酰是丙酮酸到2，3-丁二醇還原過程的中間產物，由α-乙酰乳酸氧化脫羧形成［8］。在葡萄酒釀造過程中雙乙酰的產生機制主要有酵母菌主導的酒精發酵和乳酸菌引發的蘋果酸-乳酸發酵（malolactic fermentation，MLF）（簡稱蘋-乳發酵）。在酒精發酵過程中，雙乙酰的產生主要有3條途徑：其一是由糖酵解的中間產物—丙酮酸酶促產生；其二是由α-乙酰乳酸分泌到胞外基質中，由非酶氧化脫羧反應而直接形成［9］；其三是與酵母的纈氨酸生物合成有關［10］。乳酸菌在蘋-乳發酵中，L-蘋果酸除了轉化為L-乳酸外，還轉化為丙酮酸，丙酮酸脫羧生成活性乙醛-焦磷酸硫胺素復合物（thiamine pyrophosphate，TPP-C2*），后者再與丙酮酸生成α-乙酰乳酸，經氧化脫羧生成雙乙酰；TPP-C2*也可再生成乙酰輔酶A（acetyl coenzyme A，acetyl-CoA），后者與TPP-C2*結合，直接生成雙乙酰［11］。

雙乙酰是葡萄酒釀造過程中酒精發酵和蘋-乳發酵的副產物，一般只進行酒精發酵的葡萄酒中雙乙酰的含量都在閾值以內，但是口感較差。蘋-乳發酵能夠降低葡萄酒的酸度，增加細菌穩定性的同時，還會增加葡萄酒口味和香氣復雜性，改變其風味。而經過蘋-乳發酵后，葡萄酒中雙乙酰含量會得到很大提高，以至于超過葡萄酒規定的閾值。釀酒酵母不僅具有雙乙酰的合成能力，還有較強的還原能力［12］，將雙乙酰還原為乙偶姻，進一步還原成2，3-丁二醇，后兩者在葡萄酒中的感官閾值很高，分別為150mg/L和600mg/L，因此對葡萄酒風味影響不大［13］。本研究旨在不改變葡萄酒蘋-乳發酵特征的基礎上，進一步降低葡萄酒中雙乙酰的含量。通過在葡萄酒后期發酵過程中添加蔗糖，使酵母進行二次發酵的方法降低雙乙酰的含量，同時比較不同菌株采用加糖二次發酵后雙乙酰的降解效果，篩選發酵性能良好并且可降低雙乙酰含量的優良菌株，以更好地提高葡萄酒的風味質量。

1　材料與方法

1.1料與試劑

1.1.1株

葡萄酒酵母（Saccharomyces ellipsoideus）WYI、WYI-1（WYI改造菌株，過表達雙乙酰還原酶基因bdh1）、WYI-2（WYI改造菌株，過表達雙乙酰還原酶基因bdh2）和WYI-12（WYI改造菌株，同時過表達雙乙酰還原酶基因bdh1和bdh2）、乳酸菌（lactic acid bacteria）：工業發酵微生物教育部重點實驗室保藏。

1.1.2養基

種子培養基采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeastextract peptonedextrose，YEPD）培養基：葡萄糖2.0%，蛋白胨2.0%，酵母粉1.0%，pH 6.0。

1.1.3料及化學試劑

玫瑰香葡萄：天津漢沽葡萄園；蔗糖：上海試劑二廠；鄰苯二胺（分析純）：天津市四通化工廠；雙乙酰（98%）：天津市化學試劑一廠；濃鹽酸（38%）：北京化工廠。

1.2器與設備

UVm ini-1240分光光度計：島津儀器（蘇州）有限公司；ETT-SYXZL雙乙酰蒸餾裝置、IS-RDS3恒溫搖床：上海制成儀器制品有限公司；JW-JJJ-3酒精計：天津市津武儀器儀表有限公司；pHSJ-4A型實驗pH計：上海科學儀器有限公司；PERKIN ELMERAutosystem氣相色譜儀：北京安捷倫科技有限公司。

1.3法

1.3.1萄酒加工工藝流程

操作要點：將葡萄分選除雜后進行破碎除梗，同時加入50～100mg/L SO2（添加量根據葡萄的損壞程度而定），用蔗糖調整葡萄漿的糖濃度，固定pH值為3.3，接入5%酵母菌，在25℃條件下進行酒精發酵4 d，發酵液進行皮渣分離后，接入5%乳酸菌，于18℃進行蘋-乳發酵，為啟動酵母二次發酵，在蘋-乳發酵4 d后于發酵液中添加蔗糖（添加量和前期蔗糖添加量總和為210 g/L），二次發酵4 d后結束發酵，對發酵液進行過濾、貯存后殺菌裝罐。

1.3.2次發酵加糖量的確定

葡萄酒發酵時，葡萄汁含糖量必須在17%以上才能生成10%vol的酒，只有10%vol以上的酒才能保存長久。如糖分不足，則需要人為提高原料的含糖量，從而提高葡萄酒的酒精度。一般要求葡萄汁的初始糖含量≥200 g/L，在常規葡萄酒發酵過程中，一般將葡萄汁的初始含糖量調整為210 g/L。為確保葡萄酒發酵液的殘糖和酒精度在規定范圍內，以及驗證酵母在二次加糖后是否啟動二次發酵，故在加糖二次發酵時，使初始糖含量和二次加糖量的總量仍為210 g/L。

按照表1，將葡萄汁初糖含量分別調至相應的值，于25℃條件下接入酵母WY1進行酒精發酵，對發酵液進行皮渣分離，接入乳酸菌進行蘋-乳發酵，待后發酵4 d后，按表1于發酵液中加入蔗糖進行發酵。通過測定發酵液中的殘糖量、酒精度和雙乙酰含量，以確定葡萄酒二次發酵的最適加糖量。

表1　葡萄酒二次發酵加糖量Table 1 Sugar addition during w ine secondary ferm entation

1.3.3同菌株加糖發酵試驗

按照1.3.1對葡萄汁成分進行調整之后，將待篩選菌株WYI、WYI-1、WYI-2和WYI-12分別加入發酵液中進行葡萄酒常規發酵和加糖二次發酵，測定兩種發酵方式條件下各發酵液的基本釀造指標（pH值、總酯含量和風味物質），并進行比較，同時測定加糖二次發酵后各發酵液中雙乙酰的含量。

1.3.4析方法

酒精度采用酒精計法測定［14］；殘糖量的測定采用菲林試劑法測定［14］；pH值采用pH計測定；總酯含量的測定采用皂化法測定［14］；風味物質采用高效氣相色譜法測定；雙乙酰含量的測定采用鄰苯二胺比色法［15-16］。

2　結果與分析

2.1次發酵加糖量的確定

2.1.1次加糖量對葡萄酒殘糖量和酒精度的影響

以二次發酵不加糖的發酵液作為對照，在不同的加糖量條件下進行葡萄酒發酵試驗。為驗證葡萄酒發酵前期和加糖后酵母的發酵能力以及加糖量對葡萄酒發酵的影響，分別在前期發酵結束后（第4天）和加糖二次發酵結束后（第12天）測定發酵液中的殘糖量和酒精度，以確定葡萄酒二次發酵的最適加糖量，二次發酵中加糖量對葡萄酒殘糖量和酒精度的影響結果分別見表2和表3。

表2　二次發酵中加糖量對發酵液殘糖量的影響Table 2 Effect of sugar addition on residual sugar of fermentation liquid in seconda ry ferm entationg/L

由表2可知，隨著二次加糖量的增多，初始加糖量的減少，最后發酵液的殘糖量呈現由小變大的趨勢。當二次加糖量為42 g/L和56 g/L時，與二次發酵不加糖的發酵液相比，發酵液中殘糖量明顯增加，說明二次加糖后酵母幾乎沒有發酵。后期發酵乳酸菌會消耗一部分蔗糖使酒精度下降，同時由于后期發酵溫度較低，酵母菌酒精發酵速度慢，也會導致發酵液殘糖偏高。

表3　二次發酵中加糖量對發酵液酒精度的影響Tab le 3 Effect of sugar addition on alcohol content of ferm entation liquid in secondary ferm entation

由表3可知，當二次加糖量為14 g/L和28 g/L時，與前期發酵相比，發酵后的酒精度有所增加。隨著二次加糖量的增多，初始加糖量的減少，二次發酵液的酒精度呈現由大變小的趨勢。這可能是由于初始加糖量較少，酵母可利用的糖不足，酵母發酵能力弱，即使在后期發酵過程中加糖，激活起來的酵母量也相應較少，使后期加的糖不能被利用而積累到最后，導致最后酒精度明顯降低。

結果表明，按照國標GB 15077—2006《葡萄酒》干型葡萄酒的要求（殘糖量≤4.0g/L，酒精度在8.5%vol～15.0%vol）內。因此，綜合考慮，初步確定二次發酵加糖量為14 g/L和28 g/L。

2.1.2糖二次發酵與常規發酵雙乙酰含量比較

在前期發酵及加糖二次發酵（第12天）結束后測定兩種加糖量條件下發酵液中雙乙酰含量，并與不加糖常規發酵進行比較，確定葡萄酒二次發酵的最適加糖量，結果見圖1。

圖1　二次發酵加糖量對發酵液中雙乙酰含量的影響Fig．1 Effectof sugar addition on diacetylcontentof fermentation liquid in secondary fermentation

由圖1可知，加糖二次發酵后，發酵液中雙乙酰含量比常規蘋-乳發酵明顯降低，其中常規發酵時發酵液雙乙酰含量為11.35mg/L，二次加糖量為14 g/L和28 g/L時，發酵液中雙乙酰含量分別為9.72mg/L和7.96mg/L，與常規蘋-乳發酵相比，雙乙酰含量分別降低了14.36%和29.87%。后期加糖使酵母產生二次發酵，提高了其對發酵液中雙乙酰的還原活性，使雙乙酰含量降低。加糖量為28 g/L與14 g/L相比，較多的糖用于后期發酵，使酵母二次發酵更充分。同時，當酵母與乳酸菌同時發酵時，二者具有相互抑制的作用，酵母對雙乙酰還原的同時，還使得乳酸菌代謝的雙乙酰量較少。故確定二次發酵的最適加糖量為28 g/L。

2.1.3糖二次發酵與常規蘋-乳發酵發酵的常規指標的比較

為考察加糖二次發酵對葡萄酒中其他釀造指標的影響，按照方法1.3.4對該加糖量條件下的發酵液的pH值、總酯和風味物質進行測定，并與酒精發酵后和常規蘋-乳發酵后的相應指標進行比較。結果見表4。

表4　葡萄酒pH值、總酯含量和風味物質的測定Table 4 Determination of pH，totalester contentand flavor com pounds in w ine

由表4可知，加糖二次發酵后發酵液中pH值、總酯含量和風味物質含量與常規發酵相比略有偏差，但變化不大。葡萄酒中乳酸菌發酵可以起到降酸的作用，在發酵后期加糖后促使酵母進行二次發酵，對乳酸菌有一定的抑制作用，使最后發酵液的pH值與常規蘋-乳發酵相比略有增大，但影響不大。后期乳酸菌發酵在調節發酵液“酸堿平衡”的同時，其代謝活動也會改變葡萄酒中的酯類和一些高級醇等風味物質的含量，對葡萄酒的風味起到一定的修飾作用，提高葡萄酒的風味復雜性。加糖量為28 g/L的加糖二次發酵綜合了酒精發酵和常規蘋-乳發酵的優勢，既降低了葡萄酒中雙乙酰的含量，又使葡萄酒的粗糙、酸澀等特征消失，提高了葡萄酒的風味質量。

2.2產雙乙酰葡萄酒釀酒酵母的篩選

2.2.1同菌株對雙乙酰含量的影響

以葡萄酒酵母WYI作為對照，考察改造菌株WYI-1、WYI-2和WYI-12加糖二次發酵后對發酵液中雙乙酰含量的影響，結果見圖2。

圖2　不同菌株對葡萄酒發酵雙乙酰含量的影響Fig.2 Effectof different strains on diacetyl contentofw ine

由圖2可知，葡萄酒酵母WYI、WYI-1、WYI-2和WYI-12在加糖二次發酵后，發酵液中雙乙酰含量分別為7.60mg/L、4.57mg/L、5.06mg/L和4.05mg/L。與常規發酵相比分別降低了33.04%、41.63%、41.43%和37.21%；改造菌株與菌株WY1相比，在加糖二次發酵的基礎上，改造菌分別使雙乙酰含量進一步降低了39.87%、33.42%和46.71%。由于改造菌株在WY1的基礎上提高了雙乙酰還原酶的還原能力，可使雙乙酰更多的還原為乙偶姻和2，3-丁二醇。改造菌WYI-1、WYI-2和WYI-12均能更好的加快雙乙酰的降解，其中菌株WY1-12的降解效果最好。

2.2.2同菌株二次發酵性能的比較

以菌株WY 1作為對照，分別考察突變菌WY 1-1、WY 1-2和WY1-12發酵后對葡萄酒釀造指標的影響，結果見表5。

由表5可知，菌株WY1-1經加糖二次發酵后發酵液的殘糖量、酒精度、pH值及其中的總酯和風味物質與菌株WY 1發酵結果基本一致；菌株WY 1-2發酵后發酵液的殘糖量、酒精度和pH值與菌株WY1相差不大，但總酯和風味物質明顯降低。而突變株WY1-12發酵后發酵液的殘糖量和pH值降低，酒精度升高的同時，總酯和風味物質含量明顯升高，由于酯類也是葡萄酒中的重要風味物質，較多的酯類有助于提高葡萄酒的風味，且風味物質在葡萄酒的呈香過程中起到至關重要的作用。故綜上可得，菌株WY1-12的發酵性能較好。

表5　不同菌株對葡萄酒釀造指標的影響Tab le 5 Effectof different strains on brew ing indexes in w ine

3　結論

本研究通過在葡萄酒常規蘋-乳發酵的基礎上，于葡萄酒后期發酵過程中添加蔗糖，使酵母菌進行二次發酵降低雙乙酰的含量。結果表明，加糖二次發酵的最適加糖量為28 g/L，與常規發酵相比，該加糖量下進行二次發酵后雙乙酰含量降低了29.87%。在此基礎上對菌株WY1改造后提高了雙乙酰還原酶活力的菌株WY1-1、WY1-2和WY 1-12進行葡萄酒發酵試驗，篩選出一株發酵性能良好并且對雙乙酰降解效果較好的菌株WY 1-12，與菌株WY 1相比，在加糖二次發酵的基礎上，該菌使雙乙酰含量進一步降低了46.71%，并且對發酵液的其他釀造指標沒有顯著影響。加糖二次發酵綜合了酒精發酵和蘋-乳發酵的優勢，既降低了葡萄酒中雙乙酰的含量，同時使葡萄酒的粗糙、酸澀等特征消失，使酒變得圓潤、柔和，對提高葡萄酒的風味質量具有十分重要的意義。

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Reduction of diacetyl inw ine through secondary fermentation

LIPing，SHITingting，X IAO Dongguang*
（Tianjin Key Laboratory of IndustrialM icrobiology，Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry ofEducation，College ofBiotechnology，Tianjin University ofScienceand Technology，Tianjin 300457，China）

Diacetyl content was reduced through yeast secondary fermentation w ith sugar addition into w ine during post fermentation.The results showed that the diacetyl content reduced by 29.87%at theoptimum sugar content28 g/L during secondary fermentation.On thebasisof theoptimum sugar content，the secondary fermentation of w inew ith sugar addition was carried outw ith yeast strainsWYI，WYI-1，WYI-2 and WYI-12.The experiments results indicated that four strains all could reduce the diacetyl content in fermentation liquid.The diacetyl content in strainWYI-12 fermentation liquid was the lowest（4.05mg/L），reduced 37.21%com pared w ith the conventional fermentation，which im proved sensory quality ofw ine.

w ine；secondary fermentation；diacetyl

Q815

0254-5071（2016）01-0115-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．025

2015-11-05

天津市科技支撐計劃（15ZCZDNC00110）

李憑（1990-），女，碩士研究生，研究方向為現代釀造技術。

肖冬光（1956-），男，教授，博士，研究方向為現代釀造技術。