耐酸性布拉氏酵母的篩選及高密度培養條件優化

李飛龍，陳曉華，鄭　鑫，謝永振，譚之磊，賈士儒

耐酸性布拉氏酵母的篩選及高密度培養條件優化

李飛龍，陳曉華，鄭鑫，謝永振，譚之磊，賈士儒*

（天津科技大學 生物工程學院，工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

布拉氏酵母菌（Saccharomyces boulardii）是臨床上作為益生菌藥物治療腸道疾病使用的唯一一株酵母菌，作為微生態制劑，要保證其生物效果，必須能夠在胃腸道中保持一定的活菌數，研究發現影響布拉氏酵母菌在胃腸道中存活的最主要因素是低pH，為提高布拉氏酵母菌在低pH條件下的存活率，該研究采用常壓室溫等離子體（ARTP）誘變技術對S.boulardii進行誘變，最終篩選出3株對低pH值耐受性較好的突變株。對突變株耐低pH穩定性的研究結果表明，在傳代20次后，突變株YB-3具有較好的遺傳穩定性，其存活率為51.79%。在5 L發酵罐中，對突變株YB-3高密度培養條件進行優化，最終所得布拉氏酵母菌體干質量為58.79 g/L，比原始菌株提高了55.52%。

布拉氏酵母菌；室溫常壓等離子體誘變；高密度培養；耐酸性

布拉氏酵母（Saccharomyces boulardii）是法國科學家Henri Boulard在20世紀20年代初期于印尼水果荔枝中分離得到的一株非致病性酵母菌［1-2］。S.boulardii是臨床上作為益生菌藥物治療腸道疾病使用的唯一一株酵母菌［3-5］，目前廣泛用于預防和治療抗生素相關性腹瀉、艱難梭菌相關性腹瀉、胃腸道炎癥的藥物中。在許多國家，S.boulardii凍干制劑常作為用于預防兒童和成人的腹瀉藥物［2-6］。作為微生態制劑，S.boulardii常被用于治療由抗生素和微生物感染引起的腹瀉，維持胃腸道微環境平衡［6-9］。此外，其作為飼料添加劑的應用已得到包括中國、歐盟在內的世界上許多國家的認可，在畜牧業中也有廣闊的應用前景［10-12］。

研究表明，用S.boulardii處理感染艱難梭菌（Clostridium difficile）的限菌鼠一次，預防小鼠患結腸炎的有效率為16%，而當小鼠連續攝入S.boulardii時，有效率可達56%；進一步研究表明，這種保護作用不僅依賴于攝入S.boulardii的劑量，還和S.boulardii的活體細胞數有關［13］。在鼠腸道細胞上的研究結果證實了S.boulardii對霍亂弧菌（cholera toxin，CT）具有抑制作用，實驗組細胞中CT誘導環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的量比對照組下降了50%，經確認發揮作用的是一個120 ku的蛋白，如果將布拉氏酵母菌細胞加熱殺死時，酵母對cAMP的抑制作用也隨之消失［14-15］。

根據杜曉蒙［16］研究表明，影響攝入細胞活性的主要因素是膽汁鹽、胃腸道消化酶和pH值的變化，其中對S.boulardii活性影響最大的是pH。HUDSON L E等［17］使小鼠口服108個S.boulardii活細胞，4 h后從小鼠腸道只能回收到10～20個活細胞，直接證明了低pH對于S.boulardii菌存活率的影響。

由于S.boulardii對低pH耐受性較差，動物口服S.boulardii后到達腸道內的活菌數很少，作為飼料添加劑，要保證其生物效果，必須能夠在胃腸道中保持一定的活菌數［18-20］。為提高S.boulardii對低pH的耐受性和在胃腸道中存活效率，本研究通過常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變技術篩選出耐酸性的S.boulardii，提高S.boulardii對低pH的耐受性，并對篩選出的S.boulardii突變菌株高密度發酵條件進行了優化，提高S.boulardii的菌體產量，為其工業化應用打下基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

布拉氏酵母菌（S.boulardii）：由天津科技大學生化工程研究室保藏。

沙氏液體培養基：葡萄糖4%，蛋白胨1%，pH 5.5；

酵母浸出粉蛋白胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）固體培養基：葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨2%，瓊脂2%，pH 6.0；

初始發酵培養基：葡萄糖1%，酵母膏1.2%，KH2PO40.08%，MgSO40.05%，pH 5.5。

1.2儀器與設備

ARTP-IIS ARTP育種儀：無錫源清天木生物科技有限公司；BIOTECH-5BG-7000A 5 L全自動發酵罐：上海保興生物設備工程有限公司；IS-RDS3疊加式恒溫培養振蕩器：美國精騏生物工程有限公司；BioSpectrometer basic生物紫外分光光度計：德國Eppendorf公司；Bioscreen全自動生長曲線分析儀：芬蘭OY Growth Curves公司。

1.3方法

1.3.1S.boulardii的培養

將S.boulardii接種到裝液量為100 mL/500 mL沙氏液體培養基中，30℃、180 r/min振蕩培養24 h。

S.boulardii種子液的制備：將上述S.boulardii菌液按10%的接種量接種到裝液量為90 mL/500 mL沙氏液體培養基中，30℃、180 r/min振蕩培養12 h。

1.3.2 ARTP誘變方法

將培養至對數期的S.boulardii種子液于4℃、4 000 r/min離心5 min，收集菌體，用生理鹽水重懸浮后調節OD600nm至0.7，吸取10 μL菌液均勻涂布在載片表面，將載片置于載物臺上，設置ARTP育種儀2 mm射距照射，分別照射0、5 s、10 s、15 s、20 s、25 s、30 s、35 s、40 s、45 s、50 s。將經過誘變處理后的載片置于裝有1 mL生理鹽水的離心管中，振蕩均勻后稀釋涂布YPD固體培養基上，每個梯度3個平行，采用稀釋涂布法測定菌落數，以菌落數來反映活菌數，計算致死率。致死率計算公式如下：

1.3.3耐酸性S.boulardii突變株的初篩

將經過ARTP誘變處理的S.boulardii稀釋涂布于YPD固體培養基上，30℃靜置培養48 h，挑取單菌落接種至裝液量為50 mL/250 mL pH 2.0的沙氏液體培養基中，30℃、180 r/min振蕩培養12 h，在波長600 nm處測定其光密度OD600nm值，選擇OD600nm值較高的培養液中的菌株進行復篩。

1.3.4耐酸性S.boulardii突變株的復篩及耐酸性測定

制備初篩得到單菌落種子液后，以10%的接種量接種至裝液量為50mL/250mLpH2.0的沙氏液體培養基中，30℃、180 r/min振蕩培養6 h，采用稀釋涂布法測定菌落數，并按照下列公式計算存活率。

1.3.5S.boulardii突變菌株高密度培養條件優化

杜曉蒙［16］對搖瓶培養S.boulardii的培養基進行了優化，本文在此基礎上對S.boulardii突變菌株YB-3高密度培養條件經行了優化。將制備的種子液按一定比例接種至裝有3 L發酵培養基的5 L自動發酵罐中，30℃發酵36 h，分別考察接種量（5.0%、7.5%、10.0%、12.5%和15.0%）、pH（4.0、4.5、5.0、5.5和6.0）、溶氧水平（dissolved oxygen，DO）（15%、20%、25%、30%和40%）和發酵過程中葡萄糖質量濃度（0.5 g/L、2.5 g/L、5 g/L、7.5 g/L和10 g/L）對S.boulardii干質量的影響，確定高密度培養S.boulardii的最適條件。

1.3.6分析檢測方法

菌體干質量（dry cell mass，DCM）的測定：取8 mL發酵液，4 000 r/min離心5 min，用去離子水清洗菌體2～3次，離心后棄上清液，于95℃條件下烘干至恒質量，計算菌體干質量。

發酵液葡萄糖質量濃度的測定：取8 mL發酵液，4 000 r/min離心5min，取上清液適當稀釋，用SBA-40E生物傳感分析儀測定其中葡萄糖的質量濃度。

2　結果與分析

2.1 ARTP誘變致死曲線的測定

根據1.3.2所述方法對S.boulardii進行ARTP誘變，得到致死率曲線，結果如圖1所示。

由圖1可知，等離子體對S.boulardii的殺傷有一個突變的過程，當ARTP處理時間＜15 s時，S.boulardii的致死率不足20%；當ARTP處理時間為35 s，S.boulardii的致死率約為97.38%；40 s以后檢測不到有活性的S.boulardii，此時致死率達到100%。為保持有一個較高的突變率，因此設定ARTP誘變時間為35 s，這與金麗華等［21-22］選擇的誘變致死率基本一致。

圖1　布拉氏酵母菌的ARTP致死率曲線Fig.1 Lethal rate curve ofS.boulardiiby ARTP

2.2耐酸性S.boulardii突變株篩選

經ARTP誘變處理后，從酸性平板上共挑取1 025株S.boulardii進行二次初篩，共篩選出118株長勢明顯優于出發菌的突變株；經過復篩后得到11株S.boulardii突變株，其在pH 2.0條件下的存活率如表1所示。

表1　S.boulardii突變株在pH 2.0條件下培養6 h的存活率Table 1 Survival rate ofS.boulardiimutant strains under the conditions of pH 2.0 for 6 h

由表1可知，突變株YB-1、YB-2和YB-3在pH 2.0條件下培養6 h的存活率為分別29.63%、23.77%和50.83%，比出發菌株（存活率為11%）分別提高了169.36%、116.09%和462.09%。這三株菌對低pH的耐受性明顯優于出發株與其他誘變株，因此選定這三株菌作為突變菌進行下一步研究。2.3S.boulardii突變株耐低pH穩定性的測定

圖2　突變株在pH 2.0條件下的傳代培養Fig.2 Generation culture of mutant strains under the conditions of pH 2.0

為確定誘變菌株的遺傳穩定性，對篩選出的突變株YB-1、YB-2和YB-3進行20代的傳代培養，每周傳代一次，測定其存活率，結果如圖2所示。

由圖2可知，傳代20次之后的突變株YB-1、YB-2和YB-3分別在pH 2.0條件下培養6 h后的存活率，分別是10.93%，23.77%和51.79%。突變株YB-1對低pH的耐受性變差，而突變株YB-2、YB-3對低pH的耐受性保持較好的遺傳穩定性，說明ARTP誘變技術選育耐低pHS.boulardii突變株是可行的。突變株YB-3的在低pH條件下存活率較高且穩定性較好，因此，選用突變株YB-3進行后續發酵優化試驗。

2.4 5 L發酵罐高密度培養S.boulardii條件的優化

2.4.1接種量的選擇

接種量對高密度培養S.boulardii菌體干質量的影響，結果見圖3。

圖3　接種量對布拉氏酵母菌菌體干質量的影響Fig.3 Effect of inoculum on dry cell mass ofS.boulardii

由圖3可知，當接種量為5.0%～10.0%時，菌體干質量隨接種量的增而增加；當接種量為10%時，所得到菌體干質量達到最大值，為53.41 g/L，繼續增加接種量，菌體干質量稍有下降因此，選擇接種量10%為宜。

2.4.2 pH的確定

pH對高密度培養S.boulardii菌體干質量的影響，結果見圖4。

圖4　pH對布拉氏酵母菌菌體干質量的影響Fig.4 Effect of pH on dry cell mass ofS.boulardii

由圖4可知，S.boulardii的干質量隨著pH的增高呈現出先升高后降低的趨勢，其中在pH 5.5時，菌體干質量達到最高，為53.95 g/L。同時為了防止發酵初期pH過高發酵液染菌，在高密度培養初期采用pH 5.0，當培養至對數期時pH再改為5.5。

2.4.3溶氧水平的確定

溶氧水平對高密度培養S.boulardii菌體干質量的影響，結果見圖5。

圖5　溶氧水平對布拉氏酵母菌菌體干質量影響Fig.5 Effect of dissolved oxygen level on dry cell mass ofS.boulardii

由圖5可知，S.boulardii干質量在一定范圍內隨著發酵液中溶氧水平的增加變化不顯著，發酵結束之后，不同組別之間S.boulardii干質量差別不大，其中在溶解氧水平為30%時，菌體干質量達到最高，為54.33 g/L。因此溶氧水平選擇30%為宜。

2.4.4發酵過程中葡萄糖質量濃度的測定

發酵過程中葡萄糖質量濃度對高密度培養S.boulardii菌體干質量的影響，結果見圖6。

圖6　發酵過程中葡萄糖質量濃度對布拉氏酵母菌菌體干質量影響Fig.6 Effect of glucose content during the fermentation on dry cell mass ofS.boulardii

由圖6可知，研究發酵過程中葡萄糖的質量濃度對S.boulardii菌體干質量的影響發現，隨著發酵液中葡萄糖含量的提高，S.boulardii菌體干質量逐漸減低，當葡萄糖濃度分別維持在0.5 g/L時，發酵結束時S.boulardii的干質量最高可達58.79 g/L。因而發酵過程中選擇將葡萄糖的質量濃度維持在0.5 g/L左右。

2.4.6高密度培養S.boulardii的耐酸性測定

為了驗證高密度培養對是否對S.boulardii突變株YB-3的耐酸性有影響，取上述優化高密度培養條件結束后的S.boulardii突變株YB-3于pH 2.0的沙氏液體培養基中，30℃、180 r/min振蕩處理6 h后，計算其存活率。

結果表明，突變株YB-3的存活率為40.19%，相比于誘變結束時的存活率（50.83%），降低了26.47%。分析其原因可能是高密度發酵結束時，S.boulardii處于穩定期末開始進入衰亡期，此狀態下的S.boulardii對外界環境的適應性較差，因而在低pH條件下的存活率有了明顯的降低。后續研究表明，將此狀態下的S.boulardii接種至新鮮沙氏液體培養基培養至對數期，測定其耐酸性，發現其在低pH條件下的存活率能恢復至50%的水平，說明突變株YB-3的耐酸性具有良好的穩定性。

3　結論

通過ARTP誘變的方法對S.boulardii進行了篩選，共獲得了3株對低pH耐受性較好的菌株，其中突變株YB-3在pH 2.0條件下培養6 h的存活率為50.83%，相比于原始菌株的11%提高了462.1%，有效地提高了對低pH的耐受性，達到了本次試驗的目的。

同時以誘變株YB-3為出發菌株優化了高密度培養S.boulardii的條件，最終確定液態高密度培養S.boulardii的條件為：接種量為10%，溶氧水平30%，發酵過程中葡萄糖質量濃度維持在0.5 g/L左右，發酵初期pH 5.0，當培養至對數期時pH改為5.5，30℃培養36 h。發酵結束時所得S.boulardii菌體干質量為58.79 g/L，比原始菌株提高了55.52%。

本研究篩選出了對低pH的耐受性較好的S.boulardii突變菌株，有助于提高S.boulardii在胃腸道中的存活率，對于其在養殖業上的應用具有深遠的意義。

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Screening of an acid-resistantSaccharomyces boulardiiand optimization of its high density cultivation conditions

LI Feilong，CHEN Xiaohua，ZHENG Xin，XIE Yongzhen，TAN Zhilei，JIA Shiru*
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

Saccharomyces boulardiiis the only strain of yeast as clinical probiotic drugs for the treatment of intestinal diseases.As a microecology preparation，in order to ensure its biological effect，it must be able to maintain a certain number of viable bacteria in the gastrointestinal tract.Research showed that low pH was the most important factor affectingS.boulardiisurvival rate in the gastrointestinal tract.To improve the survival rate ofS.boulardiiin low pH condition，atmospheric and room temperature plasma（ARTP）was used forS.boulardiimutagenesis.Finally，three mutant stains with thelow pH-resistant were selected.The results of stability of the mutant strains resistant to low pH showed that after 20 times generation，mutant YB-3 had good genetic stability and its survival rate was 51.79%.In 5 L fermentor，the high density cultivation conditions of mutant YB-3 were optimized.The dry cell weight ofS.boulardiiobtained was 58.79 g/L，which was increased by 55.52%than that of the original strain.

Saccharomyces boulardii；atmospheric and room temperature plasma；high density cultivation；acid resistant

Q815

0254-5071（2016）07-0015-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.004

2016-03-10

長江學者和創新團隊發展計劃資助（IRT1166）

李飛龍（1988-）男，碩士研究生，主要從事飼料添加劑方面的研究工作。

賈士儒（1954-）男，教授，博士，主要從事生物防腐劑、發菜、細菌纖維素等的研究工作。