鉻（ VI）和菲單一及復合污染對土壤微生物酶活性的影響

汪杏，沈根祥，胡雙慶*，顧海蓉，崔春燕，朱明遠，趙曉祥

（1.東華大學環境科學與工程學院，上海201620；2.上海市環境科學研究院，上海200233；3.華東理工大學中德工學院，上海200237）

鉻（ VI）和菲單一及復合污染對土壤微生物酶活性的影響

汪杏1，沈根祥2，胡雙慶2*，顧海蓉2，崔春燕1，朱明遠3，趙曉祥1

（1.東華大學環境科學與工程學院，上海201620；2.上海市環境科學研究院，上海200233；3.華東理工大學中德工學院，上海200237）

采集上海青浦現代農業園區稻田土壤，通過室內模擬試驗，研究鉻（Ⅵ）和菲單一及復合暴露對土壤微生物過氧化氫酶和脫氫酶活性的影響及交互作用方式。鉻（Ⅵ）和菲單一及復合暴露對兩種酶活性的影響表現出明顯的濃度-效應關系，整體上隨污染物濃度升高，酶活性降低，但低濃度菲對過氧化氫酶表現出略微激活效應。以暴露第7 d為評價終點，鉻（Ⅵ）暴露對土壤過氧化氫酶EC10和EC20分別為203.61、471.48 mg·kg-1，菲暴露對土壤過氧化氫酶EC10和EC20分別為299.89 mg·kg-1和大于800.00 mg·kg-1，復合暴露對土壤過氧化氫酶EC10和EC20分別為116.14、349.28 mg·kg-1；鉻（Ⅵ）暴露對土壤脫氫酶EC10和EC20都小于50.00 mg· kg-1，菲暴露對土壤脫氫酶EC10和EC20分別為113.63、223.49 mg·kg-1，復合暴露對土壤脫氫酶EC10和EC20都小于100.00 mg·kg-1。表明脫氫酶比過氧化氫酶更加敏感。采用酶活性凈變量法評價交互作用方式，結果表明鉻（Ⅵ）和菲復合污染對土壤微生物過氧化氫酶和脫氫酶的交互作用方式均表現為拮抗作用。

鉻；菲；復合污染；過氧化氫酶；脫氫酶

汪杏，沈根祥，胡雙慶，等.鉻（Ⅵ）和菲單一及復合污染對土壤微生物酶活性的影響［J］.農業環境科學學報，2016，35（7）：1300-1307.

WANG Xing，SHEN Gen-xiang，HU Shuang-qing，et al.Effects of single and joint pollution of chromium（Ⅵ）and phenanthrene on microbiological enzyme activities in soil［J］.Journal of Agro-Environment Science，2016，35（7）：1300-1307.

自然界中污染發生常常具有綜合性，重金屬和多環芳烴都是環境中的微量持久性污染物，往往同時或先后進入環境形成復合污染［1］。通常認為含碳有機物的不完全燃燒可形成多環芳烴，石油泄漏也會增加環境中多環芳烴的含量［2］。這些污染物質進入大氣環境中，絕大部分通過大氣沉降進入土壤，據估計，有90%的多環芳烴在土壤表面殘留［3］。劉增俊等［4］研究發現，蘇州和嘉興農田土壤中15種多環芳烴的總量范圍分別為45.4～3703 μg·kg-1和9.0～2421μg·kg-1，其中，菲、熒蒽、苯并［b］熒蒽為兩個地區土壤中多環芳烴的主要成分。菲在污染環境中的含量高，而且有著與致癌多環芳烴類似的區域結構，所以菲成為多環芳烴研究中的模式化合物［5］。土壤重金屬污染主要源于農業生產中化肥、農藥的過量施用，長期污水灌溉以及人類活動造成的大氣沉降等［6］。王京［7］對崇明島主要公路路邊土壤研究發現，Cr（Ⅵ）的濃度范圍為72.1～309.7mg·kg-1，平均含量為110.3mg·kg-1，且局部污染嚴重。近年來，隨著工農業生產的快速發展，鉻的用途越來越多，鉻污染風險越來越大［8］。

土壤中微生物酶的種類繁多，胞外酶過氧化氫酶和胞內酶脫氫酶都屬于氧化還原酶，在土壤有機質的氧化和腐殖質的形成方面起著重要作用。土壤酶對土壤環境質量的變化反應迅速，常被用來作為指示土壤環境質量的生物學指標［9］。曾有學者研究重金屬、多環芳烴對土壤酶活性的影響［10-11］，提出了脫氫酶活性是表征重金屬和多環芳烴污染的一項重要指標。過氧化氫酶被看作是好氧微生物的指示物，其活性與好氧微生物的數量、土壤肥力有密切聯系［12］。研究發現，土壤中有機污染物與重金屬復合污染對土壤酶活性的影響隨著污染物濃度以及培養時間的變化而有所不同［13-14］。

目前研究主要集中在單一重金屬、多環芳烴，以及重金屬和農藥復合污染對土壤酶活性的影響方面，鉻（Ⅵ）和菲復合污染對土壤酶活性的影響尚無報道。本文采用上海青浦現代農業園區稻田土，以土壤脫氫酶和過氧化氫酶活性作為指標，通過室內模擬試驗，研究了鉻（Ⅵ）和菲單一及復合污染對脫氫酶和過氧化氫酶活性的影響，并通過濃度-效應關系評價兩種污染物的聯合作用類型，以期為環境標準制定和復合污染的生態風險評價提供理論依據。

1　材料和方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗土壤

試驗土壤為上海青浦現代農業園區稻田土，土壤質地為青紫泥，采集0～20 cm表層土樣，剔除植物殘根及石礫等雜物，經風干、磨碎后過1 mm篩，保存備用。常規方法測定土壤基本理化性質［15-16］，見表1。

表1　試驗土壤理化性質Table 1 Physical-chemical properties of soil tested

1.1.2試劑和儀器

試劑：過氧化氫、鹽酸、高錳酸鉀、草酸鈉、葡萄糖、甲醇均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；重鉻酸鉀、菲、硫酸、三-羥甲基-氨基甲烷、三苯甲臜均為分析純，購自中國醫藥（集團）上海化學試劑公司。

儀器：紫外分光光度計（UV-7504，上海欣茂儀器有限公司），人工氣候箱（MLR-352-PC，松下健康醫療器械株式會社），電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9246A，上海精宏實驗設備有限公司），振蕩器（HY-2，國華電器有限公司），pH計（S220，梅特勒-托多儀器（上海）有限公司），電子天平（YP2001N，上海精密科學儀器有限公司）。

1.2試驗方法

1.2.1鉻（Ⅵ）和菲單一及復合暴露試驗

根據污染場地中鉻（Ⅵ）監測濃度［7］設計暴露濃度范圍（0～800 mg·kg-1），鉻污染土樣配置方法為：將重鉻酸鉀溶于去離子水中，配制成不同濃度梯度的溶液，然后加入到稱量好的過篩土樣中，使得鉻（Ⅵ）污染濃度（以純鉻記，下同）分別為0、50.00、100.00、200.00、400.00、800.00 mg·kg-1。

按照酶活性凈變化量（ΔI）［17］的計算要求，復合污染物濃度比為1：1，因此菲的暴露濃度范圍也是0～800 mg·kg-1。菲污染土樣配置方法為：將菲溶于少量有機溶劑丙酮中，配制成不同濃度梯度的溶液，加入到稱量好的過篩土樣中，充分混勻，放入通風櫥中，待丙酮完全揮發，使得菲污染濃度分別為0、50.00、100.00、200.00、400.00、800.00 mg·kg-1。

鉻和菲復合污染土樣采用上述相同方法配置，使得復合污染土壤中鉻（Ⅵ）和菲的污染濃度分別為0、50.00、100.00、200.00、400.00、800.00 mg·kg-1和0、50.00、100.00、200.00、400.00、800.00 mg·kg-1。

添加污染物后，反復攪拌，使污染物在100 g過篩干土中均勻分布，再用去離子水調節至最大持水量的60%。將處理好的土樣移入到150 mL的小燒杯中，覆蓋無菌封口膜，防止水分過量蒸發，然后放在24℃人工氣候箱中恒溫培養。分設空白對照組和助溶劑對照組，每組設有3個平行。分別在處理后第1、3、5、7、10 d取樣，測定過氧化氫酶和脫氫酶活性以及土樣的含水率。所有結果均以每克土壤干重表示，鮮重按照烘干法測得的濕度換算成干重。

1.2.2脫氫酶和過氧化氫酶活性測定

脫氫酶的測定采用TTC比色法［18］。稱取3.0 g土樣置于100 mL三角瓶中，加入4 mL TTC-葡萄糖-Tris緩沖液，置于37℃人工氣候箱黑暗條件下培養24 h；取出后用10 mL左右甲醇提取，定性濾紙過濾，再用50 mL比色管定容；濾液即刻用紫外分光光度計在485 nm波長下測定吸光度。脫氫酶活性以土樣中TPF μg·g-1表示。

過氧化氫酶的測定采用高錳酸鉀滴定法［19］。稱取3.0 g土樣置于100 mL三角瓶中，加入40 mL蒸餾水和5 mL 0.3%過氧化氫溶液；將三角瓶放在振蕩器上振蕩20 min后，加入5 mL 3.0 mol·L-1硫酸，用以穩定未分解的過氧化氫；將瓶中懸液用定性濾紙過濾，量取25 mL濾液，用0.1 mol·L-1高錳酸鉀滴定至淡粉紅色終點。過氧化氫酶活性以單位干土消耗的0.1 mol· L-1高錳酸鉀的毫升數表示。

1.2.3數據分析與聯合作用評價

試驗數據為3次平行試驗的算術平均值，數據采用Excel進行初步計算及處理。采用SPSS統計分析軟件對數據進行單因素方差分析。

酶活性抑制率計算［20］：

式中：R為抑制（激活）率；a為對照組測定值；b為處理組測定值。

采用計算酶活性凈變化量（ΔI）［17］的方法來判斷鉻（Ⅵ）和菲對土壤酶活性的聯合作用：

式中：ICr（VI）+Phe、ICr（Ⅵ）、IPhe和ICK為同時或分別加入鉻（Ⅵ）和菲土壤的酶活性以及空白對照土樣的酶活性。

ΔI=0，鉻（Ⅵ）和菲之間無交互作用；ΔI＞0，鉻（Ⅵ）和菲之間存在拮抗作用；ΔI＜0，鉻（Ⅵ）和菲之間存在協同作用。

2　結果與討論

2.1菲單一暴露對脫氫酶和過氧化氫酶活性的影響

以菲的暴露時間為橫坐標，以脫氫酶及過氧化氫酶的活性為縱坐標作圖，如圖1。隨著暴露時間的延長，各處理組土樣中脫氫酶活性出現一定波動，時間-效應關系不明顯，只有最高暴露濃度（800.00 mg·kg-1）酶活性隨著暴露時間的增加而明顯降低。暴露濃度為50.00 mg·kg-1和100.00 mg·kg-1時，對脫氫酶的抑制作用不顯著。從整體來看，隨著菲暴露濃度的增加，脫氫酶活性逐漸降低，其濃度-效應關系明顯，當暴露第10 d時，高濃度處理組中土壤脫氫酶活性抑制率達到64.38%。

在暴露的第1 d，暴露濃度為50.00 mg·kg-1時過氧化氫酶活性有略微升高，表現出激活作用；從整體來看，過氧化氫酶的活性隨著菲暴露濃度的增加而降低，暴露濃度為400.00 mg·kg-1和800.00 mg·kg-1時，菲對過氧化氫酶的抑制率達到了極顯著差異（P＜0.01）。菲對過氧化氫酶活性影響并未表現出明顯的時間-效應關系，而是出現波動變化，過氧化氫酶抑制率最高僅為20%左右。

圖1　菲單一暴露對土壤脫氫酶和過氧化氫酶活性的影響Figure 1 Effects of single phenanthrene on dehydrogenase and catalase activities in soil

多環芳烴對土壤酶的影響與其濃度有關，低濃度的菲對兩種土壤酶活性并無抑制作用，反而表現出一定的激活作用，主要是微生物對污染物的適應或是利用外源污染物作為碳源和能量所致［21］。這與宮璇等［22］的研究結果相似，土壤中過氧化氫酶的活性也沒有顯著變化，可以認為向土壤中添加菲對土壤中好氧微生物的影響不大。高濃度的多環芳烴會抑制土壤中多種酶活性，菲對土壤過氧化氫酶和脫氫酶產生抑制作用的原因可能是其經轉化后參與酶促反應過程，進而影響微生物的生長和代謝。

2.2鉻（Ⅵ）單一暴露對脫氫酶和過氧化氫酶活性的影響

以鉻（Ⅵ）的暴露時間為橫坐標，以脫氫酶及過氧化氫酶的活性為縱坐標作圖，如圖2。隨著鉻暴露濃度的升高，鉻（Ⅵ）對脫氫酶的抑制作用總體來看逐漸增加，表現出一定濃度-效應關系。整個暴露階段，不同濃度組鉻（Ⅵ）對脫氫酶的抑制作用都非常明顯，即使最低濃度暴露組（50.00 mg·kg-1），脫氫酶活性也受到較強影響（最低抑制率為81.69%）。

隨著暴露時間的延長，各處理組過氧化氫酶活性出現一定波動，但時間-效應關系不明顯。在暴露的第3 d和第5 d，暴露濃度為50.00 mg·kg-1時，過氧化氫酶的活性高于各自的空白對照組，表現出一定程度的激活作用。這與魏威等［23］的研究結果相似，低濃度鉻（Ⅵ）處理對過氧化氫酶有一定刺激作用。從整體來看，隨著暴露濃度的增加，鉻（Ⅵ）對過氧化氫酶的抑制作用逐漸增加，且濃度-效應關系明顯。高濃度處理組中過氧化氫酶活性抑制率最高為47.56%，與段雄偉等［24］的研究結果相似，較高濃度鉻（Ⅵ）處理顯著降低了過氧化氫酶活性。但是隨著暴露時間的延長，高濃度暴露組（800 mg·kg-1）對過氧化氫酶活性的抑制率降低，這可能與土壤中部分鉻（Ⅵ）轉變為鉻（Ⅲ）有關。

低濃度鉻（Ⅵ）暴露對過氧化氫酶產生激活作用的原因一方面可能是土壤有機質對土壤酶的保護作用和對鉻的吸附緩沖作用，導致其對土壤酶毒害較小，表觀上表現為激活作用；另一方面可能由于酶作為蛋白質，重金屬離子作為輔基，有利于酶活性中心與底物的配位結合，使酶分子與酶活性中心保持一定的專性結構，改變酶促反應的平衡性和酶蛋白的表面電荷，從而增強酶活性［25］。較高濃度重金屬對過氧化氫酶的抑制作用是因為重金屬離子與酶分子的-SH，-NH2，-OH，-COOH等官能團形成牢固的共價鍵，使酶的立體結構變形，酶活性部位封閉，酶活性得以抑制［26］。

鉻（Ⅵ）對脫氫酶活性產生抑制作用，其機理可能是因酶分子中的活性部位——巰基和含咪唑的配位結合，形成較穩定的絡合物，產生了與底物的競爭性抑制作用，或者可能是由于重金屬通過抑制土壤微生物的生長和繁殖，減少體內酶的合成和分泌，最終導致酶活性下降［27］。有研究表明，銅、汞、銀離子通過蛋白質凝固來破壞細胞結構，使細胞滅活，對細菌有直接毒害作用，而重金屬鉻（Ⅵ）也常被用于制造農藥殺菌劑。高秀麗等［28］指出過氧化氫酶、脫氫酶活性可以用于表征土壤重金屬污染的程度。這表明脫氫酶對土壤鉻（Ⅵ）污染特別敏感，可以作為土壤鉻（Ⅵ）污染的重要指標。

2.3鉻（Ⅵ）和菲復合暴露對脫氫酶和過氧化氫酶活性的影響

以復合污染的暴露時間為橫坐標，酶活性為縱坐標作圖，如圖3。隨著暴露時間的延長，各處理組土樣過氧化氫酶活性出現一定波動，但時間-效應關系不明顯。從整體來看，鉻（Ⅵ）和菲復合暴露對過氧化氫酶活性影響的濃度-效應關系明顯，即隨著暴露濃度的增加，過氧化氫酶活性逐漸降低，最高復合暴露濃度為1 600.00 mg·kg-1時，過氧化氫酶活性抑制率約為30%。

圖2　鉻（Ⅵ）單一暴露對土壤脫氫酶和過氧化氫酶活性的影響Figure 2 Effects of single Cr（Ⅵ）on dehydrogenase and catalase activities in soil

圖3　鉻（Ⅵ）和菲復合暴露對土壤脫氫酶和過氧化氫酶活性的影響Figure 3 Effects of Cr（Ⅵ）and phenanthrene in combination on dehydrogenase and catalase activities in soil

相比而言，脫氫酶活性受到明顯抑制，從整體來看，隨著暴露濃度的增加，鉻（Ⅵ）和菲復合暴露對脫氫酶的抑制作用逐漸增加，其濃度-效應關系明顯。最高復合暴露濃度為1 600.00 mg·kg-1時，脫氫酶活性抑制率最高達到95.02%。隨著暴露時間的延長，各處理組土樣脫氫酶活性出現一定波動，但時間-效應關系不明顯。

鉻（Ⅵ）和菲單一及復合暴露條件下對土壤脫氫酶的影響都高于過氧化氫酶。脫氫酶是一種僅在細胞內有活性的酶，因此其活性更能反映污染物對土壤微生物的影響［29-30］。鉻（Ⅵ）對土壤酶活性的影響高于菲，因為菲屬于有機物，低濃度的菲可被細菌作為碳源和能量。在存在鉻（Ⅵ）污染的條件下，酶活性都會受到明顯抑制，并且鉻（Ⅵ）對脫氫酶活性的影響明顯大于過氧化氫酶活性。

2.4鉻（Ⅵ）和菲單一及復合暴露條件下兩種酶活性抑制率與污染物的濃度-效應關系

在暴露第7 d時，酶活性變化基本達到穩定，所以選擇暴露第7 d作為評價終點。鉻（Ⅵ）和菲單一及復合污染條件下，對土壤過氧化氫酶和脫氫酶活性抑制率與其相應濃度進行Probit擬合，如表2。可見，兩種土壤酶活性變化率與其濃度對數之間存在較好的線性關系，而且從其EC10和EC20可以看出，土壤脫氫酶比過氧化氫酶敏感。

在《農用地土壤環境質量標準（二次征求意見稿）》［31］中，提出水田（6.5＜pH≤7.5）總鉻的限值為300 mg·kg-1。對照本研究結果可知，該值低于鉻（Ⅵ）單一及復合污染對過氧化氫酶的EC20值，因而在限值條件下對土壤過氧化氫酶不會產生顯著影響；但高于對脫氫酶的EC20值，因此在最大限值濃度時會對土壤脫氫酶產生毒性。目前農田土壤環境尚未制定菲的限值標準，參考《上海市場地土壤環境健康風險評估篩選值（試行）》中敏感用地菲的土壤健康風險篩選值（381 mg·kg-1），發現篩選值均高于菲單一或復合污染對兩種酶的EC10值，表明土壤中菲污染在不引起健康風險時，也不能忽視其可能存在的生態環境風險。

表2　鉻（Ⅵ）和菲單一及復合暴露對土壤過氧化氫酶和脫氫酶活性濃度-效應關系統計分析結果Table 2 Statistical analysis of concentration-effect relationship of catalase and dehydrogenase activities exposed separately or jointly to Cr（Ⅵ）and phenanthrene

2.5鉻（Ⅵ）和菲復合暴露條件下對兩種酶活性影響的交互作用

采用計算酶活性凈變量（ΔI）的方法來判斷鉻（Ⅵ）和菲復合污染對土壤過氧化氫酶活性的影響是否存在交互作用，計算結果見表3。從整體來看，鉻（Ⅵ）和菲對土壤過氧化氫酶活性的交互作用表現為拮抗。隨著污染物濃度的升高，拮抗效應有增強趨勢；隨著樣品暴露時間的延長，相應濃度下的拮抗效應減弱。

由表4可知，從整體來看，鉻（Ⅵ）和菲復合污染對土壤脫氫酶活性的交互作用表現為拮抗作用。隨著污染物濃度的升高，鉻（Ⅵ）和菲的拮抗效應更加明顯。但隨樣品暴露時間的延長，相應濃度下的拮抗效應減弱。

表3　鉻（Ⅵ）和菲1：1復合暴露下土壤過氧化氫酶活性的ΔITable 3 Net change of catalase activity in soil co-exposed to Cr（Ⅵ）and phenanthrene at concentration ratio of 1：1

鉻（Ⅵ）和菲復合暴露對土壤過氧化氫酶和脫氫酶的交互作用都表現為拮抗作用。這與沈國清等［14］研究重金屬Zn和多環芳烴苯并［a］芘的交互作用結果相似，其對脲酶和脫氫酶也都表現出拮抗作用。Moreau等［32］認為，菲對Zn的拮抗作用可能是因為菲改變了溶酶體膜的穩定性及功能，從而解除Zn的毒害作用。Teisseire等［33］認為，敵草隆與銅之間的拮抗作用是由于前者可消除由Cu誘導產生的氧化脅迫，同時敵草隆還可促進酶活性（如谷胱甘肽還原酶、抗過氧化物酶等），提高了細胞抗氧化能力。谷盼妮等［34］認為，重金屬與有機物復合污染的聯合毒性效應產生機理可能是競爭結合位點、影響微生物及酶活性、干擾生物生理活動及生物大分子的合成等。

分析鉻（Ⅵ）和菲發生拮抗作用的機理，可能是鉻以六價離子態存在于土壤溶液中，易被靜電吸附，降低土壤表面負荷，促進土壤對菲的吸附固定，從而減弱鉻（Ⅵ）與菲的生物有效性。此外，鉻（Ⅵ）具有強氧化性，添加到土壤中后，可被其中的還原劑如有機質還原，部分鉻（Ⅵ）會轉變成鉻（Ⅲ）［35］。同時，土壤pH值、氧化還原電位等因素也會影響污染物形態和微生物活性。Liao等［36］研究發現在高pH值土壤中，微生物能有效修復土壤中的鉻（Ⅵ）污染。潘勝強等［37］研究發現土壤理化性質如黏土礦物、土壤pH值、土壤有機質、土壤質地、土壤氧化還原電位會對土壤酶活性產生一定影響。因此在復合暴露條件下，菲的添加也可能引起土壤肥力和理化性質的變化。但由于復合暴露的作用機制受污染物種類與濃度、污染物結構與性質、土壤肥力等多種因素的影響，鉻（Ⅵ）和菲復合暴露具體的聯合作用致毒機理還有待于進一步研究。

3　結論

（1）鉻（Ⅵ）和菲單一及復合暴露對土壤微生物過氧化氫酶和脫氫酶活性的影響表現出明顯的濃度-效應關系，整體上隨污染物濃度升高，酶活性降低，但低濃度菲對過氧化氫酶表現出略微激活效應。

表4　鉻（Ⅵ）和菲1：1復合暴露下土壤脫氫酶活性的ΔITable 4 Net change of dehydrogenase activity in soil co-exposed to Cr（Ⅵ）and phenanthrene at concentration ratio of 1：1

（2）以暴露第7 d為評價終點，鉻（Ⅵ）暴露對土壤過氧化氫酶EC10和EC20分別為203.61、471.48 mg·kg-1，菲暴露對土壤過氧化氫酶EC10和EC20分別為299.89 mg·kg-1和大于800.00 mg·kg-1；鉻（Ⅵ）暴露對土壤脫氫酶EC10和EC20都小于50.00 mg·kg-1，毒性效應較強，菲暴露對土壤脫氫酶EC10和EC20分別為113.63、223.49 mg·kg-1。

（3）鉻（Ⅵ）對土壤微生物酶活性的影響高于菲，鉻（Ⅵ）和菲單一及復合污染條件下對脫氫酶的影響都高于過氧化氫酶。

（4）鉻（Ⅵ）和菲復合暴露對土壤微生物過氧化氫酶和脫氫酶的交互作用均表現為拮抗作用。

［1］沈國清，陸貽通，周培.土壤環境中重金屬和多環芳烴復合污染研究進展［J］.上海交通大學學報：農業科學版，2005，23（1）：102-106. SHEN Guo-qing，LU Yi-tong，ZHOU Pei.Advances of research on combined pollution of heavy metals with polycyclic aromatic hydrocarbons（PAHs）in soil environment［J］.Journal of Shanghai Jiaotong University：Agricultural Science，2005，23（1）：102-106.

［2］馬恒亮，占新華，張曉斌，等.小麥/苜蓿套作對菲污染土壤酶活性的影響［J］.環境科學，2009，30（12）：3684-3690. MA Heng-liang，ZHAN Xin-hua，ZHANG Xiao-bin，et al.Enzymatic activities of phenanthrene contaminated soil in wheat and clover intercropping system［J］.Environmental Science，2009，30（12）：3684-3690.

［3］Wild S R，Jones K C.Polynuclear aromatic hydrocarbons in the United Kingdom environment：A preliminary and budget［J］.Environmental Pollution，1995，88（1）：91-108.

［4］劉增俊，滕應，黃標，等.長江三角洲典型地區農田土壤多環芳烴分布特征與源解析［J］.土壤學報，2010，47（6）：1110-1117. LIU Zeng-jun，TENG Ying，HUANG Biao，et al.Distribution and sources analysis of PAHs in farmland soils in areas typical of the Yangtze River Delta，China［J］.ActaPedologicaSinica，2010，47（6）：1110-1117.

［5］夏穎.多環芳烴菲對微生物生態毒理研究、菲降解菌的分離鑒定及降解基因克隆與表達［D］.杭州：浙江大學，2004：2-3. XIA Ying.Studies on microbial ecology toxicity of phenanthrene and isolation，characterization of phenanthrene degrader as well as cloning and expression of degradation genes［D］.Hangzhou：Zhejiang University，2004：2-3.

［6］Huang Y Z，Hu Y，Liu Y X.Heavy metal accumulation in iron plaque and growth of rice plants upon exposure to single and combined contamination by copper，cadmium and lead［J］.ActaEcologicaSinica，2009，29（6）：320-326.

［7］王京.崇明島主要公路重金屬污染研究［D］.上海：華東師范大學，2007：20-21. WANG Jing.Heavy metal pollution in high way of Chongming island［D］. Shanghai：East China Normal University，2007：20-21.

［8］李晶晶，彭恩澤.綜述鉻在土壤和植物中的賦存形式及遷移規律［J］.工業安全與環保，2005，31（3）：31-33. LI Jing-jing，PENG En-ze.Summarization on the existing form and transferring rules of chromium in soil［J］.Industrial Safety and Environmental Protection，2005，31（3）：31-33.

［9］邊雪廉，岳中輝，焦浩，等.土壤酶對土壤環境質量指示作用的研究進展［J］.土壤，2015，47（4）：634-640. BIAN Xue-lian，YUE Zhong-hui，JIAO Hao，et al.Soil enzyme indication on soil environmental quality：A review［J］.Soils，2015，47（4）：634-640.

［10］龔平，李培軍，孫鐵珩.Cd、Zn、菲和多效唑復合污染土壤的微生物生態毒理效應［J］.中國環境科學，1997，17（1）：58-62. GONG Ping，LI Pei-jun，SUN Tie-heng.Ecotoxicological effects of Cd，Zn，phenanthrene and MET combined pollution on soil microbe［J］. ChinaEnvironmental Science，1997，17（1）：58-62.

［11］蔡少華，和文祥，呼蕾，等.六價鉻對土壤脫氫酶活性的影響［J］.西北農業學報，2008，17（5）：208-214. CAI Shao-hua，HE Wen-xiang，HU Lei，et al.Soil dehydrogenase activity affected by chromium（Ⅵ）［J］.Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica，2008，17（5）：208-214.

［12］Margesin R，Walder G，Schinner F.The impact of hydrocarbon remediation（diesel oil and polycyclic aromatic hydrocarbons）on enzyme activities and microbial properties of soil［J］.Acta Biotechnologica，2000，20：313-333.

［13］Wang M E，Zhou Q X.Joint stress of chlorimuron-ethyl and cadmium on wheat Triticum aestivum at biochemical levels［J］.Environmental Pollution，2006，144（2）：572-580.

［14］沈國清，陸貽通，洪靜波.重金屬和多環芳烴復合污染對土壤酶活性的影響及定量表征［J］.應用與環境生物學報，2005，11（4）：479-482. SHEN Guo-qing，LU Yi-tong，HONG Jing-bo.Quantitative expression and effect of combined pollution of heavy metals and polycyclic acromatic hydrocarbons on soil enzyme［J］.Chinese Journal of Applied and Environmental Biology，2005，11（4）：479-482.

［15］鮑士旦.土壤農化分析［M］.北京：中國環境科學出版社，1997：25-151. BAO Shi-dan.Soil agro-chemistrical analysis［M］.Beijing：China Environmental Science Press，1997：25-151.

［16］劉兆云，章明奎.杭嘉湖平原典型水耕人為土的碳庫構成與13C穩定性同位素分布特征［J］.浙江大學學報：農業與生命科學版，2010，36（3）：275-281. LIU Zhao-yun，ZHANG Ming-kui.Components of organic carbon pool and profile distribution of δ13C values in typical stagnic anthrosols from Hangzhou-Jiaxing-Huzhou Plain［J］.Journal of Zhejiang University：Agricuture&Life Science，2010，36（3）：275-281.

［17］周啟星.復合污染生態學［M］.北京：中國環境科學出版社，1995. ZHOU Qi-xing.Combined-pollution ecology［M］.Beijing：China Environmental Science Press，1995.

［18］Chander K，Brookes P C.Is the dehydrogenase assay invalidas a method to estimate microbial activity in copper-contaminated soils［J］. Soil Biology Biochemistry，1991，23（10）：909-915.

［19］關松蔭.土壤酶及其研究法［M］.北京：農業出版社，1986. GUAN Song-yin.Soil enzyme and its research method［M］.Beijing：China Agricuture Press，1986.

［20］傅麗君，劉智任，楊磊.鎘、銅、鉛復合污染對枇杷園土壤微生物的生態毒理效應［J］.生態毒理學報，2009，4（6）：881-888. FU Li-jun，LIU Zhi-ren，YANG Lei.Ecotoxicological effect of Cd-Cu-Pb compound pollution on loquat soil microbe［J］.Asian Journal of Ecotoxicology，2009，4（6）：881-888.

［21］Baran S，Bielinska J E，Oleszczuk P.Enzymatic activity in an airfield soil polluted with polycyclic aromatic hydrocarbons［J］.Geoderma，2004，118（3/4）：221-232.

［22］宮璇，李培軍，張海榮，等.菲對土壤酶活性的影響［J］.農業環境科學學報，2004，23（5）：981-984. GONG Xuan，LI Pei-jun，ZHANG Hai-rong，et al.Effects of phenanthrene contamination on enzyme activity in soil［J］.Journal of Agro-Environment Science，2004，23（5）：981-984.

［23］魏威，王丹，王松山，等.銅鉻復合污染對有、無作物種植的土壤酶活性影響［J］.農業環境科學學報，2010，29（10）：1971-1978. WEI Wei，WANG Dan，WANG Song-shan，et al.Eco-toxicology effects of Cu-Cr co-contamination on soil enzymes with and without plants［J］.Journal of Agro-Environment Science，2010，29（10）：1971-1978.

［24］段雄偉，劉亞玲，黎華壽，等.高氯酸鹽和鉻復合污染對土壤酶活性及微生物數量的影響［J］.農業環境科學學報，2014，33（2）：322-331. DUAN Xiong-wei，LIU Ya-ling，LI Hua-shou，et al.Effects of combined pollution of perchlorate and hexavalent chromium on soil enzyme activities and microbial population［J］.Journal of Agro-Environment Science，2014，33（2）：322-331.

［25］Mazadori C，Ciavatta C，Montecchio D，et al.Effects of lead pollution on different soil enzyme activities［J］.Biology and Fertility of Soils，1996，22（1/2）：53-58.

［26］孟慶峰，楊勁松，姚榮江，等.單一及復合重金屬污染對土壤酶活性的影響［J］.生態環境學報，2012，21（3）：545-550. MENG Qing-feng，YANG Jin-song，YAO Rong-jiang，et al.Influence of single and combined pollutions of heavy metal on soil enzyme activity［J］.Ecology and Environmental Sciences，2012，21（3）：545-550.

［27］周禮愷.土壤酶學［M］.北京：科學出版社，1987：118-159. ZHOU Li-kai.Soil enzymology［M］.Beijing：Science Press，1987：118-159.

［28］高秀麗，邢維芹，冉永亮，等.重金屬積累對土壤酶活性的影響［J］.生態毒理學報，2012，7（3）：331-336. GAO Xiu-li，XING Wei-qin，RAN Yong-liang，et al.Effects of accumulation of heavy metals in soils on enzyme activities［J］.Asian Journal of Ecotoxicology，2012，7（3）：331-336.

［29］Brookes P C.The use of microbial parameters in monitoring soil pollution by heavy metals［J］.Biology and Fertility of Soils，1995，19（4）：269-279.

［30］Xie W，Zhou J，Wang H，et al.Short-term effects of copper，cadmium and cypermethrin on dehydrogenase activity and microbial functional diversity in soils after long-term mineral or organic，fertilization［J］.A-griculture Eco-systems and Environment，2009，129（4）：450-456.

［31］環境保護部和國家質量監督檢驗檢疫總局.GB 15168—2015農用地土壤環境質量標準（二次征求意見稿）［S］.北京：中國標準出版社，2015. Ministry of Environmental protection of PRC and general administration of quality supervision，inspection and quarantine of PRC.GB 15168—2015 Soil environmental quality standard for agricultural land（The second draft）［S］.Beijing：China Standards Press，2015.

［32］Moreau C J，Klerks P L，Haas C N.Interaction between phenanthrene and zinc in their toxicity to the sheepshead minnow（Cyprinodon variegates）［J］.Archives of Environmental Contamination and Toxicology，1999，37（2）：251-257.

［33］Teisseire H，Couderchet M，Vernet G.Toxic responses and catalase activity of Lemna minor L.exposed to folpet，copper，and their combination［J］.Ecotoxicology and Environment Safety，1998，40（3）：194-200.

［34］谷盼妮，王美娥，陳衛平.環草隆與鎘復合污染對城市綠地重金屬污染土壤有機氮礦化量、基礎呼吸和土壤酶活性的影響［J］.生態毒理學報，2015，10（4）：65-87. GU Pan-ni，WANG Mei-e，CHEN Wei-ping.Combined effects of siduron and cadmium on organic nitrogen mineralization，basal respiration and enzyme activities in heavy metal polluted urban soil［J］.Asian Journal of Ecotoxicology，2015，10（4）：65-87.

［35］閆峰.影響土壤中Cr（Ⅵ）吸持與Cr（Ⅲ）氧化的主要土壤理化性質分析［D］.楊凌：西北農林科技大學，2010. YAN Feng.Environmental behave of Cr（Ⅵ）uptake and Cr（Ⅲ）oxidation as affected by soil properties［D］.Yangling：North West Agriculture and Forestry University，2010.

［36］Liao Y P，Min X B，Yang Z H，et al.Physicochemical and biological quality of soil in hexavalent chromium-contaminated soils as affected by chemical and microbial remediation［J］.Environmental Science and Pollution Research，2014，21：379-388.

［37］潘勝強，王鐸，吳山，等.土壤理化性質對重金屬污染土壤改良的影響分析［J］.環境工程，2013，31（增刊）：600-603. PAN Sheng-qiang，WANG Duo，WU Shan，et al.Impact of soil properties on improvement of heavy metal contaminated soil［J］.Environmental Engineering，2013，31（Suppl）：600-603.

Effects of single and joint pollution of chromium（Ⅵ）and phenanthrene on microbiological enzyme activities in soil

WANG Xing1，SHEN Gen-xiang2，HU Shuang-qing2*，GU Hai-rong2，CUI Chun-yan1，ZHU Ming-yuan3，ZHAO Xiao-xiang1
（1.College of Environmental Science and Engineering，Donghua University，Shanghai 201620，China；2.Shanghai Academy of Environmental Sciences，Shanghai 200233，China；3.Sino-German College of Technology，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China）

Soils have suffered from single or combined pollution by various pollutants including heavy metals and polycyclic aromatic hydrocarbons（PAHs）.However，the interactive and toxic effects of chromium（Ⅵ）and phenanthrene on soil microbiological enzymes activities remain unknown.In an indoor simulation test，the effects of single and co-exposure of chromium（Ⅵ）and phenanthrene on soil catalase and dehydrogenase activities were examined in a paddy soil collected from Qingpu modern agricultural park in Shanghai.There were significant correlations between enzyme activity and concentrations of chromium（Ⅵ）and phenanthrene.Basically，the enzymatic activities decreased with increasing pollutant concentrations.However，at low concentrations of phenanthrene，the activity of catalase was promoted. For catalase，the 7 d-EC10and 7 d-EC20values of chromium（Ⅵ）were 203.61 mg·kg-1and 471.48 mg·kg-1，respectively，while those of phenanthrene were 299.89 mg·kg-1and over 800.00 mg·kg-1，respectively.For dehydrogenase，the 7 d-EC10and 7 d-EC20values of chromium（Ⅵ）were both less than 50.00 mg·kg-1，whereas those of phenanthrene were 113.63 mg·kg-1and 223.49 mg·kg-1，respectively. These results indicated that dehydrogenase was more sensitive to both chromium（Ⅵ）and phenanthrene pollution than catalase was.The interaction of chromium（Ⅵ）and phenanthrene showed antagonistic effects on catalase and dehydrogenase activities.The present findings would provide useful information for ecological risk assessments of combined pollution of soils.

chromium（Ⅵ）；phenanthrene；combined pollution；catalase；dehydrogenase

X172

A

1672-2043（2016）07-1300-08

10.11654/jaes.2016.07.011

2015-12-25

上海市2014年度“科技創新行動計劃”社會發展領域項目（14231200500）；上海市自然科學基金（15ZR1401500）

汪杏（1992—），女，湖南常德人，碩士研究生，從事生態毒理研究。E-mail：wangxingsusu@163.com

胡雙慶E-mail：husq@saes.sh.cn