土壤微生物對(duì)鄰苯二甲酸二（乙基己）酯脅迫的生態(tài)響應(yīng)

夏慶兵，王軍，朱魯生，王金花，劉文軍

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，山東省高校農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安271018）

夏慶兵，王軍*，朱魯生*，王金花，劉文軍

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，山東省高校農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安271018）

為了探討和分析典型酞酸酯鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP）對(duì)土壤微生物的生態(tài)毒性效應(yīng)，采用室內(nèi)避光培養(yǎng)模擬實(shí)驗(yàn)，設(shè)定DEHP在土壤中的染毒濃度為0、0.1、1、10、50 mg·kg-1，取樣時(shí)間為7、14、21、28 d，考察了DEHP對(duì)3種土壤酶、土壤呼吸和土壤微生物生物量碳、氮的影響。結(jié)果表明：在染毒初期，過氧化氫酶活性受到明顯抑制，且隨DEHP濃度增大抑制作用減弱，抑制率為25.0%～14.3%；0.1～10 mg·kg-1處理組脫氫酶活性受到顯著抑制，抑制率分別為86.3%、54.7%和31.7%，但50 mg·kg-1處理組脫氫酶活性則是對(duì)照組的2.05倍；染毒前期脲酶對(duì)DEHP脅迫不敏感，染毒后期其活性受到抑制，且隨DEHP濃度增大抑制作用增強(qiáng)；過氧化氫酶和脲酶活性隨時(shí)間呈下降趨勢，而脫氫酶活性隨時(shí)間呈先上升后下降的趨勢。此外，在DEHP的脅迫下土壤呼吸強(qiáng)度和土壤微生物生物量碳及生物量氮均受到刺激，且隨DEHP濃度的增加均呈先升高后降低的趨勢，隨時(shí)間均呈下降的趨勢。總體來說，DEHP脅迫下，土壤酶活性、土壤呼吸強(qiáng)度和微生物生物量均發(fā)生明顯變化，土壤微生物生態(tài)環(huán)境受到一定影響。

鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP）；土壤呼吸；土壤酶；微生物量；生態(tài)效應(yīng)

夏慶兵，王軍，朱魯生，等.土壤微生物對(duì)鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯脅迫的生態(tài)響應(yīng)［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2016，35（7）：1344-1350.

XIA Qing-bing，WANG Jun，ZHU Lu-sheng，et al.Ecological effects of di（2-ethylhexyl）phthalate on soil microorganisms［J］.Journal of Agro-Environment Science，2016，35（7）：1344-1350.

酞酸酯（Phthalic acid esters，PAEs）又稱鄰苯二甲酸酯，主要作為增塑劑應(yīng)用于塑料行業(yè)，它是目前應(yīng)用最廣泛的一類增塑劑，約占全部增塑劑消費(fèi)量的70%［1］，同時(shí)其也是使用量最大的一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物［2］。PAEs易在人體內(nèi)蓄積［3］，給人體健康造成潛在的風(fēng)險(xiǎn)。目前，我國大部分地區(qū)農(nóng)業(yè)土壤中已普遍檢出PAEs［4-7］，其中鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯［Di（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP］和鄰苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate，DBP）的污染最為普遍。土壤中的PAEs通常來自農(nóng)田塑料薄膜、塑料廢品、垃圾和污水灌溉，塑料進(jìn)入農(nóng)田的主要途徑是農(nóng)膜的使用［8］，我國2014年塑料農(nóng)膜總產(chǎn)量約219萬t，若以添加30%的增塑劑來計(jì)算，則有近65.7萬t增塑劑進(jìn)入我國農(nóng)田土壤環(huán)境之中。這對(duì)我國農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)的健康發(fā)展是一個(gè)潛在的威脅。

土壤生態(tài)系統(tǒng)的活力是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的首要前提，土壤質(zhì)量被認(rèn)為是評(píng)價(jià)環(huán)境質(zhì)量、食品安全和經(jīng)濟(jì)活力的綜合指標(biāo)［9］。因此，土壤常被作為土地可持續(xù)管理的潛在評(píng)價(jià)指標(biāo)。土壤酶是土壤中物質(zhì)代謝和能量轉(zhuǎn)化的重要因素，土壤中各種生化過程都是在土壤酶的參與下完成的，土壤酶活性反映了土壤中進(jìn)行的各種生物化學(xué)過程的動(dòng)力和強(qiáng)度。土壤呼吸可用來衡量土壤中微生物的總活性，是表征土壤代謝強(qiáng)度的重要生物學(xué)指標(biāo)，在碳循環(huán)過程中也有重要作用。土壤微生物生物量與土壤中的C、N等養(yǎng)分的循環(huán)關(guān)系密切，可直接或間接反映土壤肥力和土壤環(huán)境質(zhì)量變化［10］。因此關(guān)于土壤酶、土壤呼吸和土壤微生物生物量的研究，對(duì)評(píng)價(jià)土壤肥力的形成與提高、土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)等具有重要的意義。

目前關(guān)于PAEs類化合物的研究主要集中在毒理學(xué)和降解等方面［11-12］，在土壤生態(tài)中的研究較少且主要集中在微生物的毒性效應(yīng)方面。土壤微生物數(shù)量組成（細(xì)菌、放線菌、真菌）以及生物量、基礎(chǔ)呼吸、土壤酶等基本生理指標(biāo)可以用來表征PAEs土壤污染的生態(tài)環(huán)境效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)基于上述多個(gè)有代表性的指標(biāo)對(duì)DEHP的微生物生態(tài)效應(yīng)進(jìn)行了全面、細(xì)致的研究，旨在闡明這種典型PAEs類化合物進(jìn)入土壤后對(duì)土壤微生物生態(tài)效應(yīng)的影響規(guī)律，為該類化合物的安全使用和生態(tài)安全性評(píng)價(jià)提供依據(jù)，對(duì)維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的持續(xù)健康發(fā)展具有重要的意義。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1土壤材料

土壤樣品采集于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田（36°09′57.7″N，117°09′38.7″E，海拔131 m）。采用五點(diǎn)法取樣，除去土壤表面的雜草、枯葉和表層土后，采集耕作層土壤，采樣深度2～20 cm。土樣取回后，剔除石礫和植物殘?bào)w等雜物，過20目篩，裝入玻璃瓶，于25℃培養(yǎng)箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

土壤理化性質(zhì)的測定參照《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》［13］。其理化性質(zhì)見表1。

1.1.2主要藥劑及試劑

DEHP（德國DR認(rèn)證，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司）純度≥99.5%。丙酮（天津凱通）、正己烷（天津永大）、甲苯（天津凱通）、三羥甲基氨基甲烷Tris（北京化工廠）、氯化三苯基四氮唑（華東師范大學(xué)化工廠）、氫氧化鈉（天津凱通）、重鉻酸鉀（萊陽康德）、硫酸亞鐵銨（天津凱通）、硫酸鉀（天津凱通）、檸檬酸（天津凱通）、高錳酸鉀（天津大茂）、過氧化氫（天津凱通）、草酸鈉（上海廣諾）等均為分析純?cè)噭?/p>

1.1.3主要儀器設(shè)備

SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、紅外控溫消煮爐（北京通潤源）、KDY-9820凱式定氮儀（北京華威興業(yè)科技）、紫外分光光度計(jì)（日本島津）、萬分之一電子分析天平（德國Sartorius）、HPG-280B光照培養(yǎng)箱（哈爾濱東聯(lián)電子）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1土壤染毒

向過篩后的土壤樣品中加蒸餾水，調(diào)節(jié)其含水量至最大田間持水量的60%。土壤染毒共設(shè)50、10、1、0.1、0 mg·kg-1（丙酮空白對(duì)照，CK）5個(gè)濃度梯度。分別取5000、1000、100、10 mg·L-1的DEHP標(biāo)準(zhǔn)工作液8 mL和丙酮溶液8 mL，與800 g前處理過的土壤充分混合。將同濃度染毒后的土樣分裝至12個(gè)棕色小瓶中，于25℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，取樣時(shí)間分別設(shè)在染毒后第7、14、21、28 d。

表1　土壤理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of soil

1.2.2土壤呼吸的測定

土壤呼吸的測定采用密閉靜置培養(yǎng)測CO2法［14］。利用一定濃度的NaOH溶液吸收土壤呼吸作用釋放出的CO2，再根據(jù)NaOH溶液的消耗量計(jì)算出CO2的含量。

1.2.3土壤脲酶活性的測定

土壤脲酶活性的測定采用靛酚藍(lán)比色法［14］。脲酶是一種高度專性的酶，能酶促尿素的水解，因此可通過測定產(chǎn)生的氨量來表示脲酶的活性。土壤浸提液中的NH+4，在強(qiáng)堿性介質(zhì)中與次氯酸鹽和苯酚反應(yīng)，生成水溶性染料靛酚藍(lán)，其深淺與溶液中的NH+4-N含量成正比，在波長578 nm處測得樣品的吸光度值，根據(jù)由NH+4-N標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出氨態(tài)氮量，脲酶活性以每克土的NH+4-N的微克數(shù)表示。

1.2.4土壤脫氫酶活性的測定

土壤脫氫酶活性的測定采用2，3，5，-三苯基四氮唑氯化物（2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC）比色法［14］，以土壤中H+的微升數(shù)表示。取5 g土壤樣品于具塞三角瓶中，每個(gè)三角瓶加入2 mL 1%的TTC溶液和2 mL蒸餾水，充分混勻，置于37℃恒溫箱中避光培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)結(jié)束后，加入5 mL甲醇，劇烈振蕩1 min，后靜置5 min，再振蕩20 s，然后靜置5 min。將三角瓶中的物質(zhì)全部過濾到比色管中，并用少量的甲醇洗滌三角瓶2～3次，洗滌液也全部過濾到比色管中，定容到25 mL，于485 nm下測定吸光度值。

1.2.5過氧化氫酶活性的測定

過氧化氫酶活性的測定采用高錳酸鉀滴定法［14］。取2 g土樣，置于250 mL三角瓶中，注入40 mL蒸餾水和5 mL 0.3%H2O2溶液。同時(shí)設(shè)置CK，即三角瓶中注入40 mL蒸餾水和5 mL H2O2溶液而不加入土樣。將三角瓶于120 r·min-1振蕩20 min后加入5 mL 1.5 mol·L-1硫酸，以穩(wěn)定未分解的H2O2。再將瓶中懸濁液用中速濾紙過濾。吸取25 mL濾液，用0.02 mol·L-1KMnO4溶液滴定至粉紅色終點(diǎn)。以單位土重消耗的0.02 mol·L-1KMnO4溶液毫升數(shù)（對(duì)照與實(shí)驗(yàn)測定的差）表示土壤過氧化氫酶活性。

1.2.6土壤微生物生物量碳、氮的測定

土壤微生物生物量碳的測定采用熏蒸提取-容量分析法，土壤微生物生物量氮的測定采用熏蒸提取-全氮測定法［14］。新鮮土壤經(jīng)氯仿熏蒸24 h后，加入0.5 mol·L-1K2SO4溶液提取土樣。用一定濃度的重鉻酸鉀（0.018 mol·L-1）-硫酸（12 mol·L-1）混合液氧化微生物生物量碳，剩余的重鉻酸鉀用硫酸亞鐵（0.05 mol·L-1）滴定，根據(jù)消耗的重鉻酸鉀量計(jì)算微生物生物量碳含量。吸取過濾液10 mL于消煮管中，同時(shí)加入5 mL濃硫酸，2 g混合催化劑，充分混勻，于375℃消煮，消煮完畢用凱式定氮儀定氮，然后用硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定溜出液，滴定終點(diǎn)為紫紅色，根據(jù)硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量計(jì)算土壤微生物生物量氮含量。

1.3數(shù)據(jù)分析

所有的處理設(shè)置三個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)分析采用Excel 2010軟件。顯著性檢驗(yàn)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，利用單因素方差分析（ANOVA）不同處理之間的差異，P＜0.05為顯著性水平。

2　結(jié)果與分析

2.1DEHP對(duì)土壤脲酶活性的影響

DEHP對(duì)土壤脲酶活性的影響如圖1所示。在培養(yǎng)期內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組土壤中脲酶活性隨時(shí)間均呈降低的趨勢，且在第7～14 d下降尤為明顯；脲酶對(duì)DEHP脅迫不敏感，且出現(xiàn)一定的滯后性。在第7 d，雖然各處理組脲酶活性略高于CK，但它們之間并無顯著性差異。第14 d時(shí)各實(shí)驗(yàn)組的酶活性明顯降低，處理組與CK相比開始表現(xiàn)出一定的刺激或抑制效應(yīng)，具體表現(xiàn)為：0.1 mg·kg-1處理組的脲酶活性與CK相比降低了4.9%，1～50 mg·kg-1處理組的酶活性則分別升高了16.4%、50.0%和36.1%。第21 d和第28 d脲酶活性持續(xù)下降，但下降幅度不大；處理組脲酶活性受到抑制，且表現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系：DEHP濃度越高抑制作用越強(qiáng)。第28 d時(shí)，50 mg·kg-1的DEHP對(duì)脲酶活性的抑制率能達(dá)到40.4%。

圖1　DEHP對(duì)土壤脲酶活性的影響Figure 1 Effect of DEHP on soil urease activity

2.2DEHP對(duì)土壤過氧化氫酶活性的影響

由圖2可以看出，不同濃度DEHP處理的土壤過氧化氫酶活性大體呈現(xiàn)先被抑制后被激活的狀態(tài)。第7 d時(shí)，由于受到DEHP脅迫，各處理組土壤過氧化氫酶活性均被顯著（P＜0.05）抑制，且隨濃度增高抑制作用減弱，0.1～50 mg·kg-1抑制率分別為25.0%、19.1%、14.3%和13.9%。到第14 d，0.1 mg·kg-1和1 mg·kg-1處理組過氧化氫酶活性基本不變，但是10 mg·kg-1和50 mg·kg-1兩個(gè)處理組的過氧化氫酶活性與第7 d相比分別升高14.6%和13.2%，達(dá)到與CK基本一致的水平。第21～28 d，處理組的過氧化氫酶活性轉(zhuǎn)為被激活的狀態(tài)，且酶活性隨DEHP濃度增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，10 mg·kg-1處理組過氧化氫酶活性最高。染毒后期處理組與CK間的差異性較染毒前期減小。后期過氧化氫酶活性被激活的原因可能為DEHP被逐漸降解，毒性降低并可作為部分土壤微生物的能量被利用，從而使過氧化氫酶的活性相應(yīng)增強(qiáng)。

圖2　DEHP對(duì)土壤過氧化氫酶活性的影響Figure 2 Effect of DEHP on soil catalase activity

2.3DEHP對(duì)土壤脫氫酶活性的影響

DEHP對(duì)土壤脫氫酶活性的脅迫效應(yīng)如圖3所示，各實(shí)驗(yàn)組土壤脫氫酶活性隨時(shí)間呈先升高后降低的趨勢，其中50 mg·kg-1的DEHP對(duì)土壤脫氫酶始終表現(xiàn)為激活作用。第7 d，0.1～10 mg·kg-1處理組對(duì)脫氫酶活性均有顯著（P＜0.05）抑制作用，抑制率分別為86.3%、54.7%和31.7%，而50 mg·kg-1處理組脫氫酶活性比CK高了104.9%。第14 d，各實(shí)驗(yàn)組脫氫酶活性明顯上升，1～10 mg·kg-1處理組脫氫酶活性轉(zhuǎn)變?yōu)楸患せ顮顟B(tài)，其酶活性已超過CK。第21 d，各實(shí)驗(yàn)組脫氫酶活性又普遍降低，且1～10 mg·kg-1處理組酶活性又重新被抑制。在實(shí)驗(yàn)后期，脫氫酶的活性趨于平穩(wěn)，除最高濃度組外，其余各組土壤脫氫酶的活性與CK相比已無顯著差異（P＞0.05）。

圖3　DEHP對(duì)土壤脫氫酶活性的影響Figure 3 Effect of DEHP on soil dehydrogenase activity

2.4DEHP對(duì)土壤呼吸強(qiáng)度的影響

DEHP對(duì)土壤呼吸作用的影響如圖4所示。染毒后第7 d，土壤呼吸強(qiáng)度隨染毒濃度的增加呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢，以10 mg·kg-1為拐點(diǎn)，50 mg·kg-1的染毒濃度已產(chǎn)生部分毒性，抑制了部分微生物的呼吸作用，但部分微生物適應(yīng)后呼吸作用增強(qiáng)，仍高于CK值；4個(gè)處理組的土壤呼吸強(qiáng)度均被顯著（P＜0.05）激活，0.1～50 mg·kg-1處理組呼吸強(qiáng)度分別為CK的1.73、1.89、2.78倍和2.00倍，其中10 mg·kg-1DEHP處理的土樣呼吸作用最強(qiáng)。第14 d，各處理組CO2釋放量顯著降低，但除了10 mg·kg-1處理組外，其余處理組與CK相比差異性依然達(dá)到顯著（P＜0.05）水平。第21 d，4個(gè)濃度處理組CO2釋放量趨于穩(wěn)定。第28 d，各處理組土壤呼吸強(qiáng)度與CK基本一致。

2.5DEHP對(duì)土壤微生物生物量碳的影響

圖4　DEHP對(duì)土壤呼吸的影響Figure 4 Effect of DEHP on soil respiration

DEHP對(duì)土壤微生物生物量碳的影響如圖5所示。DEHP對(duì)生物量碳的影響規(guī)律是：生物量碳隨時(shí)間呈降低趨勢，隨濃度升高大體呈先上升后下降的趨勢。第7 d，0.1 mg·kg-1處理組生物量碳與CK基本持平，而1～50 mg·kg-1處理組生物量碳則被顯著（P＜0.05）激活，分別是CK的2.18、2.94倍和1.97倍。第14 d，0.1 mg·kg-1處理組的生物量碳低于CK，而濃度為1～50 mg·kg-1的土壤微生物生物量碳含量依然明顯高于CK，達(dá)到顯著差異（P＜0.05）水平。第21 d和第28 d，處理組與CK之間的差距減小，土壤微生物生物量碳趨于穩(wěn)定。

2.6DEHP對(duì)土壤微生物生物量氮的影響

DEHP對(duì)土壤微生物生物量氮的影響如圖6所示。總體上，不同濃度的DEHP對(duì)土壤微生物生物量氮均有激活作用，且生物量氮隨DEHP濃度升高呈先上升后下降的趨勢。第7 d，4個(gè)處理組的土壤微生物生物量氮均升高且與CK相比達(dá)到顯著差異（P＜0.05）水平，當(dāng)DEHP濃度低于1 mg·kg-1時(shí)，生物量氮隨濃度升高呈上升趨勢，當(dāng)DEHP濃度高于1 mg· kg-1時(shí)，生物量氮呈下降趨勢。第14 d，各處理組生物量氮明顯下降，但與CK依然有顯著差異（P＜0.05），當(dāng)DEHP濃度為10 mg·kg-1時(shí)，土壤微生物量氮最高。第21 d時(shí)，各組之間的差距減小，但0.1 mg·kg-1處理組生物量氮受到抑制。第28 d，DEHP處理過的土壤中生物量氮依然是被激活的狀態(tài)，與CK相比分別激活了31.2%、50.0%、105.6%和66.7%。

圖5　DEHP對(duì)土壤微生物生物量碳的影響Figure 5 Effect of DEHP on soil microbial biomass carbon（MBC）

圖6　DEHP對(duì)土壤微生物生物量氮的影響Figure 6 Effect of DEHP on soil microbial biomass nitrogen（MBN）

3　討論

土壤酶是推動(dòng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化的生物催化劑，土壤酶的活性大致反映了某一種土壤生態(tài)狀況下生物化學(xué)過程的相對(duì)強(qiáng)度。土壤脲酶活性與土壤中的微生物數(shù)量、有機(jī)質(zhì)含量、全氮和速效氮含量呈正相關(guān)，人們常用土壤的脲酶活性表征土壤的氮素狀況。在本實(shí)驗(yàn)的染毒濃度和時(shí)間內(nèi)，DEHP對(duì)土壤脲酶活性的影響存在滯后性，王玉蓉等［15］的研究也指出土壤中的脲酶對(duì)DEHP污染不敏感。但王鑫宏［16］的研究發(fā)現(xiàn)DBP/ DEHP對(duì)脲酶均表現(xiàn)為抑制作用。龐國飛等［17］的研究也表明，高濃度的DEHP對(duì)土壤酶活性的影響較DBP有一定的滯后效應(yīng)，且在同等污染濃度下DEHP對(duì)脲酶的影響較DBP不明顯。出現(xiàn)滯后現(xiàn)象的原因可能為DEHP在降解過程中降解產(chǎn)物與脲酶作用，破壞了脲酶的結(jié)構(gòu)，使脲酶活性受到抑制。Kurane等［18］的研究指出，酞酸酯類化合物的生物降解過程中將出現(xiàn)鄰苯二甲酸、醇、酮、雙酚化合物、有機(jī)酸、CO2和H2O等多種化合物，特別是雙酚化合物的出現(xiàn)很可能對(duì)脲酶產(chǎn)生抑制作用，已有研究表明，鄰苯二酚是脲酶強(qiáng)有力的抑制劑［19］。

土壤過氧化氫酶活性與土壤呼吸強(qiáng)度和土壤微生物活動(dòng)有關(guān)，在一定程度上反映了土壤微生物學(xué)過程的強(qiáng)度。王玉蓉等［20］研究了DEHP對(duì)土壤過氧化氫酶和轉(zhuǎn)移酶活性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DEHP處理濃度在100 mg·kg-1范圍之內(nèi)時(shí)，主要表現(xiàn)為激活作用，超過100 mg·kg-1時(shí)主要表現(xiàn)為抑制作用，這說明在一定濃度范圍內(nèi)DEHP可被微生物分解利用。但當(dāng)土壤中DEHP濃度達(dá)到某一閾值并進(jìn)一步提高后，DEHP對(duì)土壤微生物產(chǎn)生毒性作用，抑制了過氧化氫酶活性。

土壤脫氫酶反映土壤微生物新陳代謝的整體活性，可以作為微生物氧化還原能力的指標(biāo)，在研究生物動(dòng)力學(xué)中極受人們的重視。秦華等［21］利用盆栽實(shí)驗(yàn)研究了100 mg·kg-1濃度的DEHP對(duì)黃棕壤中脫氫酶活性的影響，其結(jié)果表明施加DEHP顯著抑制了土壤脫氫酶的活性，30 d時(shí)與CK相比降低了約30%，60 d時(shí)盡管有緩慢的回升，但仍明顯低于對(duì)照。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本研究結(jié)果不盡相同，分析原因可能是秦華等設(shè)置的DEHP濃度明顯高于本研究，導(dǎo)致了DEHP在長時(shí)間內(nèi)對(duì)脫氫酶活性的持續(xù)抑制。Aldén等［22］的研究表明，碳源是耕地和森林土壤中微生物生長的主要限制因素。一方面，DEHP被部分好氧微生物降解，從而為其提供了大量降解產(chǎn)物作為碳源，使微生物種群數(shù)量上升，相應(yīng)的土壤酶活性也增強(qiáng)；另一方面DEHP對(duì)部分微生物產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致部分微生物的活性降低，土壤酶活性的降低說明了這一點(diǎn)。

人們通常把測定土壤呼吸強(qiáng)度看作是衡量土壤微生物總的活性指標(biāo)，或者作為評(píng)價(jià)土壤肥力的指標(biāo)之一。王志剛等［23］研究了DMP對(duì)黑土土壤呼吸和酶學(xué)活性的影響，發(fā)現(xiàn)黑土微生物呼吸速率和微生物代謝熵受低濃度DMP促進(jìn)、高濃度DMP抑制，且抑制效應(yīng)隨DMP污染濃度增加而增大。這與本研究不同濃度DEHP對(duì)土壤呼吸均是促進(jìn)作用的研究結(jié)果不盡一致，可能與酞酸酯種類及土壤類型不同有關(guān)。高軍等［24］的研究結(jié)果表明，添加PAEs初期土壤基礎(chǔ)呼吸被激活，且激活作用隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸減弱，但并未出現(xiàn)抑制效應(yīng)，這一現(xiàn)象與本研究結(jié)果相同。郭楊等［25］的研究也發(fā)現(xiàn)PAEs污染初期的土壤基礎(chǔ)呼吸被激活，但這種激活作用隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而減弱。其原因可能為50 mg·kg-1DEHP尚未超過土壤微生物的耐受范圍，當(dāng)?shù)蜐舛菵EHP進(jìn)入土壤后，DEHP不但未對(duì)土壤微生物造成毒性作用，還為部分微生物提供了養(yǎng)料，使微生物數(shù)量增加，土壤呼吸作用增強(qiáng)。到了染毒處理的中后期，大部分DEHP被降解，微生物的生存環(huán)境開始穩(wěn)定，土壤呼吸強(qiáng)度趨于穩(wěn)定。

土壤微生物生物量是土壤養(yǎng)分的儲(chǔ)存庫和植物生長可利用養(yǎng)分的重要來源，它能反映微生物在土壤中的實(shí)際含量和作用潛力。南開大學(xué)的陳強(qiáng)等［26］研究了DEHP與土壤微生物之間的作用，結(jié)果表明，DEHP對(duì)微生物產(chǎn)生影響的最低可見響應(yīng)濃度（LOEC）為10 mg·kg-1，在濃度＜10 mg·kg-1時(shí)，DEHP可促進(jìn)細(xì)菌的生長。同時(shí)，他們還指出高濃度的DEHP對(duì)微生物具有抑制作用，但不同生物對(duì)DEHP的靈敏度不同。吳雪峰［27］的研究也發(fā)現(xiàn)，DEHP濃度為10、20 mg·kg-1的處理對(duì)土壤微生物生物量碳、氮影響不大，50、100、200、400 mg·kg-1處理對(duì)土壤微生物生物量碳、氮表現(xiàn)出一定的抑制效應(yīng)，各處理組的生物量碳、氮與CK相比，差異顯著。以上的研究結(jié)果與本研究結(jié)果有諸多相似之處，實(shí)驗(yàn)說明土壤微生物可以將低濃度的DEHP作為碳源或氮源利用，當(dāng)DEHP濃度升高到一定值，土壤微生物生物量碳、氮下降，DEHP的毒性作用開始顯現(xiàn)。

4　結(jié)論

（1）DEHP脅迫下，3種土壤酶的活性均有變化。脫氫酶和過氧化氫酶活性隨DEHP濃度增加呈先降低后升高的趨勢，但脲酶的活性變化對(duì)DEHP污染不敏感。過氧化氫酶和脲酶活性隨時(shí)間呈降低趨勢且脲酶活性下降趨勢更明顯，但脫氫酶活性隨時(shí)間呈先升高后降低的趨勢。

（2）在DEHP污染的影響下，土壤呼吸強(qiáng)度和土壤微生物生物量的變化趨勢以激活效應(yīng)為主，且土壤呼吸和土壤微生物生物量的響應(yīng)與DEHP處理濃度之間呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，即隨DEHP濃度增加呈先升高后降低的趨勢。

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Ecological effects of di（2-ethylhexyl）phthalate on soil microorganisms

XIA Qing-bing，WANG Jun*，ZHU Lu-sheng*，WANG Jin-hua，LIU Wen-jun
（College of Resource and Environment，Shandong Agricultural University，Key Laboratory of Agricultural Environment in Universities of Shandong，Tai′an 271018，China）

Pollution by phthalic acid esters（PAEs）is becoming more and more serious in the soil environment.Here，a laboratory experiment was performed to evaluate the ecological toxicological effects of di（2-ethylhexyl）phthalate（DEHP），a typical phthalate，on some soil enzymes（urease，catalase，and dehydrogenase），respiration，and microbial biomass in soil under different DEHP rates（0，0.1，1，10 mg and 50 mg DEHP per kg soil）on the 7th，14th，21st，and 28th day after treatments with DEHP.Results showed that soil catalase activity was significantly inhibited and decreased by 25.0%～14.3%compared with the control on the 7th day.Soil dehydrogenase activity decreased by 86.3%～31.7%at 0.1～10 mg·kg-1treatments but increased by 105%at 50 mg·kg-1.However，DEHP suppressed soil urease activity more during later period than during early period.Furthermore，soil urease activity significantly decreased over time，which may relate to nitrogen contents in soil.With DEHP increasing，soil respiration and soil microbial biomass carbon and biomass nitrogen increased，but decreased at higher rates.Compared with the control，however，they were all stimulated，whereas these parameters decreased over time.In conclusion，DEHP has significant ecological effects on soil microbes.

di（2-ethylhexyl）phthalate（DEHP）；soil respiration；soil enzyme；microbial biomass；ecological effect

S154.3

A

1672-2043（2016）07-1344-07

10.11654/jaes.2016.07.017

2015-12-24

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41001152，21377075，21277083）；中國博士后基金項(xiàng)目（2013M541947）；山東省博士后創(chuàng)新項(xiàng)目（201303054）；山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目（J12LC01）

夏慶兵（1990—），男，碩士研究生，主要從事土壤微生物生態(tài)學(xué)方面的研究。E-mail：qingbingxia@sina.com

王軍E-mail：jwang@sdau.edu.cn；朱魯生E-mail：lushzhu@sdau.edu.cn