幾種叢枝菌根真菌對菲污染土壤中球囊霉素含量的影響

楊振亞，闕弘，朱雪竹，周紫艷，陳爽，凌婉婷*

（1.江蘇省環境科學研究院，江蘇省環境工程重點實驗室，南京210036；2.南京農業大學土壤有機污染控制與修復研究所，南京210095）

幾種叢枝菌根真菌對菲污染土壤中球囊霉素含量的影響

楊振亞1，2，闕弘2，朱雪竹2，周紫艷2，陳爽2，凌婉婷2*

（1.江蘇省環境科學研究院，江蘇省環境工程重點實驗室，南京210036；2.南京農業大學土壤有機污染控制與修復研究所，南京210095）

以菲為多環芳烴（PAHs）的代表，選用密色無梗囊霉（Acaulospora scrobculata，A.s）、摩西球囊霉（Glomus mosseae，G.m）、根內球囊霉（Glomus intraradices，G.i）、幼套球囊霉（Glomus etunicatum，G.e）和縮球囊霉（Glomus constrictum，G.c），宿主植物為紫花苜蓿（Medicago sativa L.），研究了接種叢枝菌根真菌（AMF）對菲污染土壤中球囊霉素相關土壤蛋白（GRSP，以下簡稱球囊霉素）含量的影響。供試時間（30～90 d）內，5種AMF均能對宿主植物根良好侵染，與紫花苜蓿建立共生關系，促進菲污染土壤中植物莖葉部和根部的生長；紫花苜蓿對5種AMF的菌根依賴性為108%～249%；接種AMF提高了土壤中GRSP的含量。90 d后接種G.i、G.e、G.m、G.c和A.s處理的土壤中總球囊霉素（T-GRSP）和易提取球囊霉素（EE-GRSP）含量分別達2.90～4.61、0.87～1.33 mg·g-1，比不接種對照組（CK）分別高26.1%～100.0%和10.1%～68.4%；隨著培養時間（30～90 d）延長，接種G.i的處理土壤中T-GRSP和EE-GRSP含量顯著增大。接種同一AMF菌種（G.i）處理的土壤中T-GRSP和EE-GRSP含量與菲殘留量間呈極顯著負相關。

叢枝菌根真菌；球囊霉素；多環芳烴；菌根修復

楊振亞，闕弘，朱雪竹，等.幾種叢枝菌根真菌對菲污染土壤中球囊霉素含量的影響［J］.農業環境科學學報，2016，35（7）：1338-1343.

YANG Zhen-ya，QUE Hong，ZHU Xue-zhu，et al.Impacts of arbuscular mycorrhizal fungi on glomalin content in soils contaminated with phenanthrene［J］. Journal of Agro-Environment Science，2016，35（7）：1338-1343.

叢枝菌根真菌（AMF）是土壤微生物區系中生物量最大、最重要的成員之一，能與80%以上的陸生植物和絕大多數速生草本植物形成共生體系［1-3］。以往大量研究表明，接種AMF能促進土壤中多環芳烴（PAHs）的降解，進而提出了叢枝菌根修復技術［4］。AMF也可顯著地影響植物吸收PAHs。程兆霞等［4］研究得出，接種摩西球囊霉（Glomus mosseae）或幼套球囊霉（Glomus etunicatum）顯著提高了三葉草根的芘含量、積累量和根系富集系數；Gao等［5］發現，Glomus mosseae和Glomus etunicatum促進了PAHs（苊）在黑麥草根中的積累，并進一步分析了叢枝菌根中PAHs的亞細胞分布。然而，對于AMF影響土壤中PAHs降解和植物吸收的內在本質，國內外仍然缺乏深入的了解。有學者推測，這可能與AMF菌絲分泌的球囊霉素有關［6］。

球囊酶素（Glomalin）是AMF菌絲產生并脫落進入土壤中的一類糖蛋白，近年來，土壤中球囊酶素的生態和環境效應備受學者關注。1996年，Wright和Upadhyaya［7］首次從土壤中提取并發現了球囊酶素，這也是迄今發現的唯一一類由AMF產生并釋放到土壤中的蛋白質；后來，Rillig［8］和Lovelock等［9］進一步將其命名為球囊酶素相關土壤蛋白（GRSP，以下簡稱球囊酶素）。Driver等［10］發現，球囊酶素不會直接釋放到土壤中，而是牢牢地固定在菌絲細胞壁和真菌孢子中，并隨著二者衰亡和降解后進入土壤。球囊酶素難溶于水，不被蛋白酶水解、難于降解，在土壤中含量豐富且自然狀態下極為穩定。大量數據表明，球囊酶素是土壤有機質的重要組成部分，是土壤中最重要的碳庫之一，其含量是腐殖質的2～24倍，占土壤有機碳源的比例可達27%［6］。球囊酶素也是土壤團聚體形成的重要粘合劑，據報道，其粘結土壤顆粒的能力比其他土壤熱水提取的碳水化合物強3～10倍，這對于土壤團聚化過程、土壤質地改良、土壤質量提升等意義重大［11］。近些年來，球囊酶素在污染土壤中的作用和功能已成為環境領域研究的一個熱點。然而遺憾的是，接種AMF后PAHs污染土壤中球囊酶素如何響應？球囊酶素與土壤中PAHs降解間有何關系？國內外至今對此仍少有了解。

本文以菲為PAHs的代表，以紫花苜蓿（Medicago sativa L.）為宿主植物，分別研究了接種5種AMF對菲污染土壤中總球囊霉素（T-GRSP）和易提取球囊霉素（EE-GRSP）含量的影響，揭示土壤中球囊霉素含量的變化與菲殘留的關系，為下一步探討土壤中球囊霉素對PAHs環境行為的影響提供基礎數據。

1　材料與方法

1.1實驗材料

菲購自德國Fluka試劑公司，純度＞98%，其分子量為178.23 g·mol-1。二氯甲烷、正己烷、丙酮、甘油、乳酸、層析柱硅膠（200～300目）和無水硫酸鈉均為分析純；甲醇為色譜純。

供試植物為紫花苜蓿（Medicago sativa L.）。供試AMF購自北京市農林科學院“中國叢枝菌根真菌種質資源庫（BEC）”。5種AMF分別為密色無梗囊霉Acaulospora scrobculata（A.s）、摩西球囊霉Glomus mosseae（G.m，BGC GD01A）、根內球囊霉Glomus intraradices（G.i，BGC HEB07D）、幼套球囊霉Glomus etunicatum（G.e，BGC SD03B）、縮球囊霉Glomus constrictum（G.c，BGC NM03B）。

供試土樣采自南京市江寧區，為旱作水稻土表層（0～20 cm），土壤類型為黃棕壤，其pH為6.08，有機質含量24.3 g·kg-1，沙粒、粉粒和粘粒含量分別為13.5%、61.8%和24.7%。土樣采集后風干，過2 mm篩。實驗用沙為河沙，水洗后晾干，過2 mm篩。將土樣與河沙按3：1比例混合，121℃下高壓滅菌2 h，以殺死原有的AMF孢子，晾干備用。

污染土樣制備［12］：配制含菲的丙酮溶液，加入到上述土樣中，待丙酮揮發后，充分攪拌混勻后過2 mm篩，制得菲污染土樣，置于儲藏架上靜置15 d后備用。測得污染土樣中菲起始含量為52.79 mg·kg-1。

1.2實驗方法

稱取避光保存的污染土樣250 g置于盆缽中，稱取菌劑15 g均勻覆于上面，再覆150 g污染土壤，加水至50%田間最大持水量，靜置過夜。紫花苜蓿種子用10%H2O2表面消毒10 min、于室溫下過夜催芽，待種子白露后播于盆缽中。經2～3 d出苗，出苗1周時兩次間苗，每盆留苗6株。實驗設置不接種AMF對照處理（CK）和分別接種5種AMF（G.e、A.s、G.m、G.i、G.c）處理，其中CK為接種等量的滅菌后的菌劑，以保證開始各處理土壤微生物區系一致。分設30、45、60、75、90 d 5個采樣時間。每一處理3個重復（共4盆）。實驗在溫室中進行，自然采光，每5 d隨機交換盆缽位置，整個植物生長過程中定期澆水。分別收獲植株地上部和根部，先后用自來水、去離子水清洗植物樣品，用濾紙蘸干其表面水分，置于低溫冰箱中保存，待分析。

1.3樣品提取及分析

侵染率測定［13］：取新鮮根樣，剪成1 cm根段，隨機取出部分根樣用曲利苯藍-直線截獲法測定根系侵染率，并在顯微鏡下觀察叢枝菌根侵染狀況。

植物生物量測定：將植株莖葉部與根部分開，超低溫冷凍干燥后分別測定干重。

土壤樣品中菲含量測定［14］：取適量冷凍干燥后的土樣置于研缽中，磨碎混勻后過2mm篩，取2g土樣于30mL玻璃離心管中，加入10mL二氯甲烷溶液后超聲萃取1h，4000r·min-1離心10min，取3mL上清液過2 g硅膠柱，用11 mL的二氯甲烷和正己烷溶液（體積比1：1）洗脫，洗脫液收集至旋轉蒸發瓶，于40℃下濃縮蒸干。用色譜甲醇定容至4mL，過0.22μm孔徑有機相濾膜后用高效液相色譜儀（HPLC）分析。土壤樣品中菲的加標回收率為104.4%，相對標準偏差為1.74%。

EE-GRSP提?。?，15］：稱取0.25 g待測土樣于塑料離心管中，加入2 mL檸檬酸鈉浸提劑（20 mmol·L-1、pH 7.0），蓋緊后搖勻，置于滅菌鍋（103 kPa、121℃）中提取30 min，取出離心管濾干外表面水分，離心6 min（轉速10 000 r·min-1），收集上清液。

T-GRSP提取［7，15］：稱取0.25g待測土樣于塑料離心管中，加入2mL檸檬酸鈉浸提劑（50mmol·L-1、pH7.0），蓋緊后搖勻?？偳蚰颐顾匦枰貜吞崛?次，每次加入浸提劑后搖勻土樣，使土樣與浸提劑充分接觸，之后置于滅菌鍋（103 kPa、121℃）中提取60 min，取出離心管濾干外表面水分，離心6min（轉速10000r·min-1），將表面上浮物分離并收集上清液于離心管中，4℃備用。

提取液中EE-GRSP和T-GRSP的測定［7］：吸取0.5 mL待測樣品上清液于比色管中，加入5 mL經過過濾的考馬斯亮藍G-250染色劑，蓋緊后顛倒，顯色10 min并進行比色測定（波長595 nm）。測定試驗前先配制牛血清蛋白（BSA）標準液，考馬斯亮藍顯色后比色測定，繪制牛血清蛋白標準曲線。通過標線比照計算出土壤樣品的易提取球囊霉素和總球囊霉素相關土壤蛋白含量，以每克土壤中蛋白質的微克數表示。

2　結果分析與討論

2.1菌根侵染率

菌根侵染率反映了菌根真菌與宿主植物共生關系的親合程度，也是衡量真菌在宿主植物根系擴展能力的重要指標，侵染率越高，說明其在宿主根系上擴展的能力越大［16］。60 d和90 d后，接種5種不同AMF的紫花苜蓿均能被AMF侵染，菌根侵染率分別為42.4%～74.1%和29.4%～48.2%（圖1）。但不同AMF間存在差異，其中G.i的侵染率最大，60 d和90 d時分別達74.1%和48.2%，A.s的侵染率最小，60 d和90 d時分別為42.4%和29.4%。隨著培養時間（30～90 d）延長，菌根侵染率呈先增大后減小的趨勢。以G.i為例，培養期內（30～90 d），G.i侵染率為18.5%～74.1%（圖2）。培養時間由30 d延長到60 d，G.i侵染率呈顯著增大的趨勢。這與肖敏等［17］的研究結果相一致。但60～90 d內隨著培養時間延長，G.i侵染率則由74.1%下降為54.9%。這一方面可能與供試時間內AMF叢枝的衰老、退化、消解有關［6］，另一方面受盆缽和土量制約，植物生長后期所需營養受限所致。

2.2紫花苜蓿生物量和菌根依賴性

圖1　60 d和90 d時AMF菌根侵染率Figure 1 Colonization rate of alfalfa by AMFs after 60 and 90 days

圖2　30～90 d時G.i侵染率Figure 2 Colonization rate of alfalfa by G.i after 30～90 days

以往大量研究表明，接種AMF促進了植物根系生長，進而增強了植物對土壤中碳、氮和磷的吸收，改善了植株生長所處的水分狀況，并提高了植物葉綠素的含量［18］。本研究發現，與對照相比，90 d收獲時接種5種不同AMF均增加了紫花苜蓿地上部、地下部以及整株植株生物量（表1）。但供試5種AMF對紫花苜蓿生長的促進作用存在差異，接種不同AMF處理的植株地上部干重為1.88～3.64 g·pot-1、根干重為1.34～3.78 g·pot-1、整株植株總干重為3.22～7.42 g·pot-1。接種G.i組地上部、地下部和植株總干重最大，分別達3.64、3.78、7.42 g·pot-1，是對照組的2～3倍；接種A.s組的地上部、地下部和植株總干重最小，分別為1.88、1.34、3.22 g·pot-1，與對照組間無顯著差異。

Gerdemann首先提出“菌根依賴性”（Mycorrhizal Dependence，MD）的概念，即“在一定土壤肥力條件下植物產生最大生長量對菌根的依賴程度”［19］；Menge等［20］以菌根植株干物質量占非菌根植株干物質量的百分數來表示植物對菌根的依賴性，即：

菌根依賴性（MD，%）=菌根植物干重/非菌根植物干重×100%

紫花苜蓿對5種AMF均表現出菌根依賴性。一般而言，菌根真菌對植物根系的侵染狀況越好，則對植物生長的促進作用也越顯著。本研究中，5種AMF均能與紫花苜蓿建立良好的共生關系（表1），特別是G.i的菌根依賴性最高，達到249%，相比對照組提高了149%；A.s的菌根依賴性最小（108%）。這些結果表明，接種供試AMF有助于紫花苜蓿生長。

2.3AMF對土壤中球囊霉素含量的影響

接種AMF有利于土壤中球囊酶素（GRSP）的產生。培養90 d時，接種G.i、G.e、G.m、G.c和A.s組土壤中總球囊酶素（T-GRSP）含量為2.90～4.61 mg·g-1，比不接種對照組（2.30 mg·g-1）高26.1%～100.0%（圖3）。易提取球囊酶素（EE-GRSP）與T-GRSP具有相似的規律。90 d時，接種5種不同AMF的土壤中EEGRSP含量為0.87～1.33 mg·g-1，比不接種對照組（0.79 mg·g-1）高10.1%～68.4%（圖4）。與T-GRSP相比，土壤中EE-GRSP較低，各AMF處理土壤中EE-GRSP占T-GRSP的比例為28.9%～37.0%。

表1　90 d時不同AMF對紫花苜蓿生物量和菌根依賴性的影響Table 1 Effects of AMF on the plant biomass and mycorrhizal dependency of alfalfa after 90 days

進一步分析了不同時間（30～90 d）下接種AMF對土壤中T-GRSP和EE-GRSP含量的影響，結果如圖5所示。以G.i處理組為例，隨著培養時間（30～90 d）的延長，接種G.i組的土壤中T-GRSP和EE-GRSP含量均呈增大的趨勢，分別由30 d時的1.04、0.43 mg·g-1增大為90 d時的4.10、1.33 mg·g-1。30～90 d內，不接種AMF對照組土壤中EE-GRSP含量沒有表現出顯著的變化，但其T-GRSP含量由0.78 mg·g-1增大至2.30 mg·g-1。與對照處理相比，接種G.i組的土壤中T-GRSP和EE-GRSP含量要高28.7%～82.3%和26.4%～92.5%，且隨著培養時間由30 d延長到90 d，接種G.i組的土壤中T-GRSP和EE-GRSP含量與對照組差距變大，90 d時G.i組的T-GRSP和EE-GRSP含量分別比對照組高82.3%和92.5%。上述結果表明，接種AMF可顯著增加土壤中T-GRSP和EE-GRSP含量。另外，不管對照組還是接種AMF處理組，其土壤中EE-GRSP要比T-GRSP低得多，僅占T-GRSP的27.1%～43.0%。

圖3　90 d時接種不同AMF土壤中T-GRSP含量Figure 3 The content of T-GRSP in soils with AMF inoculation after 90 days

圖4　90 d時接種不同AMF土壤中EE-GRSP含量Figure 4 The content of EE-GRSP in soils with AMF inoculation after 90 days

2.4土壤中球囊霉素含量與菲殘留的關系

不同處理土樣中菲的殘留動態如圖6。供試土樣中菲起始含量均為52.79 mg·kg-1。90 d時，接種5種不同AMF處理土樣中菲的殘留濃度為0.53～0.96 mg·kg-1，均低于不接種對照處理（G.e和A.s處理與對照間差異未達到顯著水平），5種不同AMF處理土樣中菲的去除率均＞98.1%。

以接種G.i處理組為例，不同時間土壤中菲的殘留動態結果見圖7。30～90 d隨培養時間延長，有植物接種G.i處理、無植物不接種AMF對照處理、有植物不接種AMF對照處理的土樣中菲含量均呈不斷下降的趨勢。但不同處理間差異較大，各處理間土壤中菲含量大小順序為無植物不接種AMF對照＞有植物不接種AMF對照＞有植物接種G.i處理。接種G.i顯著促進了土壤中菲的去除。30～90 d內，接種G.i土壤中菲的殘留含量為0.53～2.13mg·kg-1，分別比相應有植物無AMF對照低25.7%～44.6%。

進一步統計分析了土壤中菲殘留與GRSP含量的關系，如圖8所示。接種同一AMF菌種（G.i）的各處理間，土壤中T-GRSP和EE-GRSP含量均與菲殘留含量呈極顯著負相關，即土壤中GRSP含量越高，該土壤中菲殘留含量越低、去除率越大。

接種AMF能加速土壤中PAHs的去除，這主要與植物根系分泌作用有關［21］。接種AMF處理提高了植物根系生物量，增加了植物根系分泌物的產生和向土壤中的輸入，流入土壤的根系分泌物可促進土壤微生物的生長與繁殖，進而促進土壤中PAHs的降解和去除。AMF侵染也會產生大量GRSP，而GRSP可以保護菌絲免受微生物的侵襲［22］。這種保護機制可以促進菌絲生長，這些伸向土壤中的數量龐大的菌絲可以從土壤中吸收植物營養物質，促進植物生長，間接導致植物向土壤中釋放更多的根系分泌物，進而提高了根際微生物的數量和活性，促進土壤PAHs的降解，導致“土壤菲殘留量和GRSP含量間顯著負相關”這一表觀現象。然而，對于GRSP如何影響土壤中PAHs的遷移轉化過程，該領域研究國內外仍幾近空白，有待進一步探索。

圖5　不同時間接種G.i土壤中球囊酶素的含量變化Figure 5 The contents of GRSP in soils with G.i inoculation as a function of cultivation time

圖6　90 d時接種不同AMF的土壤中菲殘留量Figure 6 Concentrations of phenanthrene in soils with AMF inoculation after 90 days

圖7　接種不同時間G.i處理土壤中菲的殘留量Figure 7 Concentrations of phenanthrene in soils with G.i inoculation as a function of cultivation time

圖8　接種G.i處理的土壤中GRSP含量與菲殘留量的關系Figure 8 Correlation of GRSP contents with phenanthrene concentrations in soils with G.i inoculation

3　結論

（1）5種AMF均能與紫花苜蓿建立良好的共生關系，促進菲污染土壤中植物莖葉部和根部的生長。紫花苜蓿對5種AMF的菌根依賴性為108%～249%。

（2）接種AMF有利于土壤中GRSP的產生。接種AMF 90 d的土壤中T-GRSP和EE-GRSP含量分別達2.90～4.61 mg·g-1和0.87～1.33 mg·g-1，比不接種對照組高26.1%～100.0%和10.1%～68.4%。隨著培養時間（30～90 d）延長，接種AMF（G.i）處理土壤中T-GRSP和EE-GRSP含量顯著增大。

（3）接種同一AMF菌種（G.i）的土壤中，T-GRSP和EE-GRSP含量與菲殘留量間極顯著負相關。

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Impacts of arbuscular mycorrhizal fungi on glomalin content in soils contaminated with phenanthrene

YANG Zhen-ya1，2，QUE Hong2，ZHU Xue-zhu2，ZHOU Zi-yan2，CHEN Shuang2，LING Wan-ting2*
（1.Jiangsu Key Laboratory of Environmental Engineering，Jiangsu Provincial Academy of Environmental Science，Nanjing 210036，China；2.Institute of Organic Contaminant Control and Soil Remediation，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

Currently there is little information available about the responses of glomalin-related soil proteins（GRSP）to arbuscular mycorrhizal fungi（AMF）in soils contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons（PAHs）.Here an investigation was conducted to examine the impacts of five AMFs on GRSP content in soils contaminated with phenanthrene as a representative PAH.The experimental AMFs were Acaulospora scrobculata（A.s），Glomus mosseae（G.m），Glomus intraradices（G.i），Glomus etunicatum（G.e）and Glomus constrictum（G.c）. Host plant was alfalfa（Medicago sativa L.）.These five AMFs had good colonization with alfalfa roots after 30～90 days.Inoculating AMFs enhanced GRSP content in phenanthrene-contaminated soils.Total extractable GRSP（T-GRSP）and easily extractable GRSP（EE-GRSP）were respectively 2.90～4.61 mg·g-1and 0.87～1.33 mg·g-1in soils inoculated with AMFs after 90-day cultivation，which were 26.1%～100.0%and 10.1%～68.4%higher than those in soils without AMF inoculation（CK）.T-GRSP and EE-GRSP content in soils with AMF（G.i as a representative）was increased with cultivation time from 30 to 90 days，and significantly negatively correlated with residual concentrations of phenanthrene in soils.

arbuscular mycorrhizal fungus；glomalin；polycyclic aromatic hydrocarbons；rhizoremediation

S154.3

A

1672-2043（2016）07-1338-06

10.11654/jaes.2016.07.016

2016-04-03

國家自然科學基金項目（21477056，31270574）；農業部公益性行業（農業）科研專項（201503107）

楊振亞（1981—），男，江蘇金湖人，工程師，主要研究方向為環境污染評價與控制。E-mail：0517jhyzy@163.com

凌婉婷E-mail：lingwanting@njau.edu.cn