過氧化氫對人小梁細胞GRP78和CHOP表達的影響*

朱　艷,朱玉廣,孫寶琪,陳　晨,李　珺,李　霞

濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院眼科中心 濰坊 261053

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過氧化氫對人小梁細胞GRP78和CHOP表達的影響*

朱艷,朱玉廣#,孫寶琪,陳晨,李珺,李霞

濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院眼科中心 濰坊 261053

過氧化氫；氧化應激；人小梁細胞；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激

目的：觀察H2O2對人小梁細胞(HTCs)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白GRP78、CHOP及其mRNA表達的影響。方法：實驗分為對照組、H2O26 h組、H2O212 h組和H2O224 h組，分別以600 μmol/L H2O2作用于HTCs 0、6、12及24 h后，采用Real-time PCR和Western blot檢測細胞中CHOP、GRP78 mRNA和蛋白的表達。結(jié)果：對照組無GRP78和CHOP的表達；H2O2處理后HTCs GRP78、CHOP mRNA及蛋白的表達水平均升高，且隨著H2O2作用時間的延長，GRP78、CHOP mRNA及蛋白的表達水平升高(P均<0.05)。結(jié)論：H2O2可誘導HTCs發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，從而參與HTCs的氧化損傷。

原發(fā)性開角型青光眼(primary open-angle glaucoma,POAG)是我國主要致盲性眼病之一，眼內(nèi)壓升高是POAG的主要危險因素[1]。小梁細胞及其細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的功能及結(jié)構(gòu)異常是導致房水流暢系數(shù)降低、眼內(nèi)壓升高的主要原因。有研究[2]表明小梁細胞的氧化損傷可導致眼內(nèi)壓的升高。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、修飾和折疊的場所，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能發(fā)生紊亂的一種病理狀態(tài)，是機體的一種自我防御機制，過度的ERS將導致細胞凋亡，影響細胞的生理功能[3]。近年來研究[4-5]發(fā)現(xiàn)氧化應激、ERS與POAG的發(fā)生密切相關；小梁細胞的氧化應激可影響小梁細胞外基質(zhì)的表達，影響房水的流出阻力。GRP78、CHOP是ERS的標志性蛋白。該研究中作者建立了人小梁細胞氧化應激模型，并采用Real time-PCR和Western blot法觀察H2O2誘導的人小梁細胞中GRP78、CHOP在基因和蛋白水平表達的變化，以探討ERS在人小梁細胞氧化損傷中的作用及青光眼的發(fā)病機制。

1　材料與方法

1.1材料人小梁細胞株(HTC)購自上海復蒙公司。DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、Trizol試劑(Gibco公司)，Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(ABI公司)，兔抗人GRP78單克隆抗體(Santa Cruz公司)，兔抗人CHOP單克隆抗體(R&D公司)，F(xiàn)ITC標記羊抗兔二抗(Bethyl公司)，RNA提取試劑盒(Invitrogen公司)，RT試劑盒、PCR試劑盒(Casarray公司)，山羊抗兔 IgG (上海碧云天生物技術有限公司)。

1.2HTCs的培養(yǎng)與傳代液氮冷凍保存的HTCs快速解凍后，加入含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，吹打混勻后分裝、培養(yǎng)。3～4 d換液1次。待HTCs達 90%融合時，胰蛋白酶消化傳代。選擇傳3代的HTCs進行以下實驗。

1.3實驗分組取對數(shù)生長期的HTCs，分為對照組、H2O26 h組、H2O212 h組和H2O224 h組，后3組在細胞培養(yǎng)液中加入終濃度為600 μmol/L的H2O2，處理時間分別為6、12和24 h。

1.44組HTCs GRP78和CHOP mRNA的檢測

采用Real time-PCR法檢測CHOP和GRP78 mRNA的表達。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。CHOP上游引物5’-CAGAACCAGCAGAG GTCACA-3’， 下游引物5’-AGCTGTGCCACTTTC CTTTC-3’；GRP78上游引物5’-TGATTCCAAGGAA CACAGT-3’， 下游引物:5’-GTCAGATCAAATGTAC CCA-3’；內(nèi)參β-actin上游引物5’-GTGAAGGTGA CAGCAGTCG-3’， 下游引物5’-GATGGCAAGGGACT TCCTG-3’。 反應體系(50 μL)：Power SYBR Green PCR Master Mix 25 μL，上下游引物各2.5 μL，cDNA 5 μL，ddH2O 15 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共45個循環(huán)。目的基因 mRNA的表達量以目的基因和β-actin的熒光值的比值表示。實驗重復3次。

1.54組HTCs GRP78和CHOP蛋白的檢測

1.6統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較各組HTCs中GRP78和CHOP mRNA和蛋白表達水平的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2　結(jié)果

4組HTCs GRP78、CHOP蛋白的表達見圖1。對照組細胞中無GRP78、CHOP mRNA及蛋白的表達。各H2O2處理組HTCs GRP78、CHOP mRNA及蛋白的表達水平均升高，且隨著H2O2作用時間的延長，GRP78、CHOP mRNA及蛋白的表達水平升高，見表1、2。

1：對照組；2：H2O2 6 h組；3：H2O2 12 h組；4：H2O2 24 h組。圖1　4組HTCs GRP78和CHOP蛋白的表達

表1　各H2O2組HTCs GRP78、CHOP mRNA表達水平的比較

*：組間兩兩比較，P均<0.05。

表2　各H2O2組HTCs GRP78、CHOP 蛋白表達水平的比較

*：組間兩兩比較，P均<0.05。

3　討論

POAG的病因及發(fā)病機制未明，臨床上尚無有效的防治方法。研究[5]發(fā)現(xiàn)，在青光眼中，氧化應激可能通過損傷小梁網(wǎng)而導致眼壓的升高。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、折疊與分泌的細胞器，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是實現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的基本條件。氧化應激等多種因素可導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，形成ERS。ERS是細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能發(fā)生紊亂的一種病理狀態(tài)，是機體的一種自我防御機制，過度的 ERS將導致細胞凋亡，影響細胞的生理功能[3]。近年來研究[6]發(fā)現(xiàn)，POAG患者的小梁細胞發(fā)生了ERS，ERS在POAG發(fā)生中可能起到非常重要的作用。

GRP78和CHOP均是ERS的標志性蛋白。H2O2是人眼房水中的主要氧化物質(zhì)，作者利用H2O2作用于HTCs以模擬人小梁細胞氧化應激的狀態(tài)。以往實驗[7]中作者選擇600 μmol/L H2O2處理HTCs 2 h，既不影響HTCs的生存，又能模擬氧化應激。作者[4]前期對豬小梁細胞的研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激可以誘導豬小梁細胞NF-κB通路的激活，同時促進小梁細胞MMPs/TIMPs的表達，提示氧化應激可能參與調(diào)控小梁網(wǎng)ECM的重塑，影響房水流出，導致眼內(nèi)壓的升高[5,8-9]。

該研究結(jié)果顯示：對照組HTCs中無GRP78和CHOP的表達；H2O2處理能明顯促進HTCs GRP78、CHOP mRNA及蛋白的表達，且隨著H2O2作用時間的延長，各H2O2處理組GRP78和CHOP mRNA及蛋白的表達水平升高，提示H2O2可以誘導HTCs發(fā)生ERS。推測H2O2作用后可能引起細胞鈣穩(wěn)態(tài)發(fā)生改變和ERS，為維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，GRP78 mRNA增多，使GRP78蛋白表達增多，以減輕H2O2所引起的ERS作用。除了GRP78表達增多，H2O2作用HTCs后還可以誘導CHOP mRNA和蛋白的表達增多，進一步誘導細胞通過ERS途徑發(fā)生氧化損傷。

綜上所述，作者從氧化應激的角度出發(fā)，利用H2O2構(gòu)建氧化應激HTCs模型，結(jié)果表明H2O2可誘導人小梁細胞發(fā)生ERS，從而參與人小梁細胞的氧化損傷。由于體內(nèi)外環(huán)境的不同，有必要進一步研究青光眼模型，探討氧化應激以及ERS對小梁網(wǎng)ECM重塑的影響，為臨床青光眼的防治提供理論依據(jù)。

[1]IGLESIAS AI,SPRINGELKAMP H,RAMDAS WD,et al.Genes, pathways, and animal models in primary open-angle glaucoma[J].Eye(Lond),2015,29(10):1285

[2]SIEGFRIED CJ,SHUI YB,BAI F,et al.Central corneal thickness correlates with oxygen levels in the human anterior chamber angle[J].Am J Ophthalmol,2015,159(3):457

[3]PATTERSON SE,DEALY CN.Mechanisms and models of endoplasmic reticulum stress in chondrodysplasia[J].Dev Dyn,2014,243(7):875

[4]朱玉廣,王杰,朱艷,等.氧化應激介導的NF-κB信號通路對豬小梁細胞MMPs/TIMPs表達的作用研究[J].山東大學學報(醫(yī)學版),2012,50(5):51

[5]王杰,朱玉廣,王希娟,等.IL-1α對豬小梁細胞MMP-2,MMP-3及TIMP-1表達的影響[J].中華實驗眼科雜志,2011,29(9):800

[6]PETERS JC,BHATTACHARYA S,CLARK AF,et al.Increased endoplasmic reticulum stress in human glaucomatous trabecular meshwork cells and tissues[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2015,56(6):3860

[7]孫寶琪,陳晨,李珺,等.氧化應激介導的 NF-κB 信號通路在人小梁細胞表達的作用研究[J].濰坊醫(yī)學院學報,2015,37(4):262

[8]朱玉廣,王杰,吉艷艷,等.IL-1α對豬小梁細胞ELAM-1、 MAPK通路蛋白表達的影響[J].眼科新進展,2011,31(9):812

[9]朱玉廣,王杰,范曉軍,等.壓力對豬眼小梁細胞表達ELAM-1、MMPs/TIMPs的影響[J].山東大學學報(醫(yī)學版),2011,49(8):67

(2015-11-12收稿責任編輯徐春燕)

Effects of H2O2on expressions of GRP78 and CHOP in human trabecular meshwork cells

ZHUYan,ZHUYuguang,SUNBaoqi,CHENChen,LIJun,LIXia

OphthalmicCenter，theAffiliatedHospital,WeifangMedicalUniversity,Weifang261053

H2O2;oxidative stress;human trabecular meshwork cell;endoplasmic reticulum stress

Aim: To observe the effects of H2O2on expressions of endoplasmic reticulum stress(ERS) markers GRP78 and CHOP in human trabecular meshwork cells(HTCs),so as to explore the role of ERS in the oxidative damage of HTCs.Methods: The experiment included control group, H2O26 h group, H2O212 h group and H2O224 h group, and HTCs were treated with 600 μmol/L H2O2for 0,6,12 and 24 h,respectively. The expressions of GRP78 and CHOP mRNA and protein were determined by Real-time PCR and Western blot, respectively.Results: Compared with control group, the expression levels of GRP78 and CHOP mRNA and protein in various H2O2treatment groups increased; the expressions levels of GRP78 and CHOP mRNA and protein tended to increase along with the prolongation of H2O2treatment(P<0.05).Conclusion: Exogenous H2O2could induce ERS in HTCs,which is involved in the oxidative damage of HTCs.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.024

*山東省衛(wèi)生廳科技計劃資助項目2015WS0047

，男，1972年4月生，博士，副教授，研究方向：白內(nèi)障、青光眼的防治，E-mail:yg_zhu.md@tom.com

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