SH-SY5Y細胞α7尼古丁受體基因沉默對tau蛋白磷酸化水平及p38 MAPK信號通路的影響

周　飛，　吳昌學，　李　毅，　官志忠，　齊曉嵐

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SH-SY5Y細胞α7尼古丁受體基因沉默對tau蛋白磷酸化水平及p38 MAPK信號通路的影響

周飛，吳昌學，李毅，官志忠，齊曉嵐

目的研究α7尼古丁受體 (nAChR)沉默對SH-SY5Y細胞tau蛋白磷酸化水平和p38 MAPK通路的影響，探討α7 nAChR對tau蛋白磷酸化的調節作用及其與p38 MAPK通路的關系。方法Real-time PCR法和Western blotting法分別測定α7 nAChR沉默細胞中α7 nAChR在mRNA和蛋白表達水平的變化；Western blotting法檢測細胞tau蛋白、p-tau (S404)、p-tau (S214)、p38 MAPK和p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)蛋白水平。結果α7 nAChR沉默組與空質粒組相比，α7 nAChR mRNA和蛋白質水平分別降低了91%(P<0.01) 和80% (P<0.01)；tau蛋白水平升高了79% (P<0.01)；p-tau (S404)蛋白水平升高了74%(P<0.01)；p-tau (S214)蛋白水平升高了72%(P<0.01)；p38蛋白水平升高了64%(P<0.01)；p-p38蛋白水平升高了67%(P<0.01)。結論α7 nAChR沉默可導致tau蛋白過度磷酸化，這可能和激動p38 MAPK通路有一定關系。

阿爾茨海默??；tau；α7 nAChR；p38 MAPK

阿爾茨海默病 (Alzheimer’s disease,AD) 是一種神經元退行性病變疾病，是癡呆病中主要類型，臨床上主要表現為進行性認知功能障礙和記憶力減退等[1]。病理學上以β-淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)沉積形成的老年斑 (senile plaques,SPs) 以及tau蛋白過度磷酸化引起的神經原纖維纏結 (neurofibrillary tangles,NFTs)為主要特征[2]。病理學相關研究發現AD患者出現癡呆的嚴重程度與其腦組織中的NFTs數量呈正相關[3]，tau蛋白去磷酸化受阻或過度磷酸化是造成NFT形成的關鍵因素[4]。

在AD發病機制中神經型尼古丁乙酰膽堿能受體(neuronal nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)研究頗多，其具有調節大腦記憶學習、智力發展、識別能力等方面功能和顯著的神經保護作用[5]，尼古丁受體含有多種亞單位，其中α7 nAChR較為常見，在AD相關病變研究中扮演重要角色。研究表明在AD患者大腦海馬、皮質區nAChR數目減少，α7 亞單位蛋白表達降低，其與神經毒性作用緊密相連[6]，體內選擇性激動α7 nAChR，引起tau蛋白磷酸化水平下降[7]，α7 nAChR表達增加，能對抗岡田酸促使的tau蛋白磷酸化[8]。也有研究表明，尼古丁作用SH-SY5Y細胞，tau蛋白磷酸化程度明顯升高[9]。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號轉導通路由相關激動的絲/蘇氨酸蛋白激酶組成，其在哺乳類動物中已發現6種亞群，分別是細胞外信號調節蛋白激酶1/2 (extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶1/2/3 (c-Jun NH2-terminal kinase,JNK1/2/3)、p38 MAPK (p38 α/β/γ/δ)、ERK7/8、ERK3/4和ERK5[10]。其中p38 MAPK參加調節神經細胞存活的整個生命過程，在神經受損及細胞壞死中涉及較多。通過體外激動α7 nAChR，可以促進nAChR 離子通道對Ca2+通透性，伴隨Ca2+水平升高，MAPK通路被激活并發揮作用，調節神經細胞受損后相關基因表達[11]。有報告顯示p38 MAPK具有磷酸化tau蛋白功能，這些磷酸化位點與AD患者大腦中抽提的NFTs中所含一樣。同時，p38 MAPK對tau蛋白磷酸化程度也具有一定調節功能[12]。因此，本實驗將研究AD中α7 nAChR對tau蛋白磷酸化影響及其與p38 MAPK通路的關系，為進一步探討α7 nAChR調節tau蛋白的神經庇護相關機制做鋪墊。

1　材料與方法

1.1源于人腦的SH-SY5Y神經細胞由本課題組保存；穩定轉染α7 nAChR shRNA 沉默載體和空載體的SH-SY5Y細胞由本課題組液氮保存；DMEM培養基、血清、0.25%胰酶均來源于Hyclone公司；嘌呤霉素購于Sigma公司；Trizol試劑購于Invitrogen公司；α7 nAChR、β-actin引物由上海生物工程公司設計并合成；RNA逆轉錄試劑盒購于Thermo公司；兔抗人tau單克隆抗體(ab32057)、兔抗人p-tau (S404)單克隆抗體(ab92676)、兔抗人p-Tau (S214)多克隆抗體(ab10891)均購于英國Abcam公司；兔抗人p38 MAPK單克隆抗體(8690s)、兔抗人P-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) 單克隆抗體(4511s)均購于美國Cell Signaling公司；鼠抗人Actin 單克隆抗體(M20010)購于美國Abmart公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(7074s)來源于美國Cell Signaling公司；辣根酶標記的羊抗鼠二抗(ZB2305)來源于中杉金橋公司、蛋白Marker來源于美國Thermo公司；5×蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PMSF蛋白酶抑制劑、顯影液、定影液均購自上海碧云天生物技術有限公司；蛋白磷酸酶抑制劑混合物、RIPA高效裂解液均來源于北京索萊寶公司；PVDF膜、ECL-Plus發光試劑購自美國Millipoe公司；膠片購于中國柯達公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養空白組SH-SY5Y細胞以DMEM為培養基，其中添加10%血清、1%雙抗(青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)，轉染α7 nAChR shRNA Plasmid(h)實驗組和轉染Control shRNA Plasmid-B空載體組SH-SY5Y細胞以添加13%胎牛血清、0.004 g/L嘌呤霉素的DMEM為培養基，放入37 ℃含5% CO2恒溫箱中進行孵育。

1.2.2實時熒光定量PCR檢測α7 nAChR mRNA表達水平采用Trizol一步法提煉細胞總RNA，通過逆轉錄試劑盒把mRNA逆轉錄為cDNA，并以此作為模板進行real-timePCR。α7 nAChR和內參β-actin引物序列(見表1)，用ABI Step One Plus型實時熒光定量PCR儀采集α7 nAChR及內參β-actin擴增各循環熒光信號，用SDS2.1軟件收集熒光信息并分析相關資料，主要分析α7 nAChRΔΔCt值及RQ值，RQ=2-ΔΔCt。分析結果時，用β-actin做內參，計算沉默組分別與空載體對照組、正常對照組之間的相對水平。

1.2.3Western blot檢測α7 nAChR、tau、S404、S214、p38及P-p38蛋白水平按RIPA∶PMSF∶蛋白磷酸酶抑制劑混合物=100∶1∶1配制裂解液，收集細胞，冷凍離心12000 r、4 ℃、15 min，汲取上清蛋白。采用BCA定量法測定蛋白濃度；運用Western blotting法檢測α7 nAChR、tau、S404、S214、p38、p-p38蛋白表達水平及其各自內參β-actin的蛋白表達情況。運用Image J 軟件進行圖片像素灰度值處理，以β-actin條帶作為內對照，分別計算α7 nAChR、tau、S404、S214、p38、P-p38蛋白條帶相對其內參的灰度比值并作為目的蛋白的相對表達水平。每組蛋白復孔3個，重復3次獨立試驗。

2　結　果

2.1穩定轉染α7 nAChR shRNA Plasmid(h)后細胞α7 nAChR mRNA及其蛋白質表達水平穩定轉染α7 nAChR shRNA Plasmid(h)后細胞α7nAChRmRNA及其蛋白質表達水平：受體沉默組與空質粒組相比，α7 nAChR mRNA(見圖1A)和蛋白質水平(見圖1B)分別降低了91%(P<0.01)和80%(P<0.01)。說明穩定轉染α7 nAChR shRNA沉默載體的SH-SY5Y細胞，α7 nAChR 在mRNA和蛋白程度被高度抑制。

2.2α7 nAChR沉默調節tau蛋白磷酸化水平受體沉默組與空質粒組相比，tau蛋白(見圖2A)、p-tau (S404)(見圖2B)、p-tau (S214)(見圖2C)蛋白質水平分別升高了79%(P<0.01)、74%(P<0.01)、72%(P<0.01)。說明穩定轉染α7 nAChR沉默質粒后，與空載對照組細胞相比，細胞總tau蛋白、S404及S214位點磷酸化水平明顯升高，差異具有高度統計學意義。

2.3α7 nAChR沉默對p38 MAPK信號通路蛋白水平的影響受體沉默組與空質粒組相比，p38(見圖3A)、p-p38(見圖3B)蛋白質水平分別升高了64%(P<0.01)、67%(P<0.01)。說明α7 nAChR基因抑制，與空載組相比，p38及p-p38程度明顯上升，差異具有統計學價值。

表1　熒光定量PCR引物序列及產物片段

**：表示與空質粒組比較，具有高度統計學價值(P<0.01)

**：表示與空質粒組比較，具有高度統計學價值(P<0.01)

圖2α7 nAChR基因沉默細胞tau蛋白(見圖2A)、S404(見圖2B)、S214(見圖2C)蛋白表達水平

**：表示與空質粒組比較，具有高度統計學價值(P<0.01)

3　討　論

在AD的病變研究中，nAChR常被提及，能參與大腦多種功能調節，對神經系統毒性損傷具有一定的神經保護作用，通過對AD患者進行尸檢發現其大腦皮質萎縮、nAChRs數量減少、密度降低[13]，本課題組前期研究結果也表明，下調SH-SY5Y細胞α7 nAChR，可增加Aβ的產生及其毒性作用[14]。此外，有研究者認為AD患者α7 nAChR明顯減少，是由于受體與Aβ相互作用所致并誘導神經元凋亡，因此猜測α7 nAChR激動劑可能會對AD患者有較好療效[15]。tau蛋白作為一類細胞骨架蛋白，常表達于神經元，生物學功能重點表現為輔助微管裝置及穩定構造。tau蛋白磷酸化位點，大部分表現為絲氨酸(Ser)及蘇氨酸(Thr)殘基磷酸化，在AD中磷酸化tau蛋白以Thrl81、Thr205、Ser-198/199/202、Ser-396/404及Ser422等位點研究較多，異常磷酸化tau使微管失去穩定性，游離tau蛋白劇增，促使其沉積于大腦和腦脊液形成細胞內NFT[16]。NFT可損傷神經元、神經膠質細胞和tau蛋白功能等多種途徑導致強大的神經毒性。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)傳導通路作為主要的基本信息傳遞鏈之一，參與調節細胞生長、分化、凋亡等整個生命過程[17]，其中p38 MAPK是該家族中重要成員之一，能介導神經損傷及細胞壞死。在Seino等[18]建造的2×Tgtau (+/-)APP(+/-)雙轉基因鼠模型中發現MAPK能誘導tau蛋白磷酸化水平顯著升高，AD中Aβ及tau蛋白導致的神經毒性都與p38 MAPK激活存在一定聯系[19]。尸檢AD患者也發現其腦組織中磷酸化p38顯著增加[20]，因此抑制p38通路，對造成的毒性損害可明顯減輕，具有一定神經保護功能[21]。此外，近期研究顯示激活p38 MAPK可引起神經系統tau蛋白過度磷酸化[22]，微管穩定性下降及微管重排，提出p38 MAPK阻斷劑可能會對神經類疾病有一定療效[23]。

因此本實驗主要研究SH-SY5Y細胞轉染α7 nAChR沉默質粒后，細胞tau蛋白磷酸化程度和相關信號通路p38 MAPK蛋白表達情況，從而探索尼古丁受體基因沉默對神經原纖維纏結形成過程的影響以及受體調節tau蛋白的可能機制。實驗結果顯示，α7 nAChR沉默時，tau蛋白AD相關位點S404、S214磷酸化程度明顯升高，表明尼古丁受體基因抑制可導致tau蛋白過度磷酸化，這可能與AD發病中NFTs的形成有關，同時研究還發現α7 nAChR基因抑制后可激動p38通路，推測α7 nAChR促使tau蛋白過度磷酸化可能與p38 MAPK通路活化有一定關系，這可能與α7 nAChR在AD發病機制中的神經保護作用機制有關。

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Influence of inhibited α7 nicotinic acetylcholine receptor gene expression on tau phosphorylation and p38 MAPK signal transduction pathway in SH-SY5Y cells

ZHOUFei,WUChangxue,LIYi,etal.

(TheKeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

ObjectiveTo investigate the influence of inhibited gene expression of α7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) on tau phosphorylation and p38 MAPK signal transduction pathway in SH-SY5Y cells,to study the effect of α7 nAChR on tau phosphorylation,and the realationship with p38 MAPK transduction pathway.MethodsThe level of α7nAChR mRNA and protein were detected by real-time PCR and Western blotting,respectively.The protein levels of tau,p-tau (S404), p-tau (S214),p38 MAPK and P-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) were determined by Western blotting.ResultsAs compared with negative controls,the expression of α7 nAChR at mRNA and protein levels in the SH-SY5Y cells with α7 nAChR silencing were decreased by 91% and 80%,respectively.And the expression of tau,p-tau (S404),p-tau (S214),p38 MAPK and P-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) proteins were increased by 79%、74%、72%、64%、67%,respectively.ConclusionsThe inhibited gene expression of α7 nAChR by RNA interference can lead to tau hyperphosphorylation, which may associate to p38 MAPK transduction pathway.

Alzheimer disease;tau;Receptors;Cholinergic;p38 MAPK

1003-2754(2016)08-0676-04

2016-06-11；

2016-07-29

國家自然科學基金資助項目(No.81360178)；教育部“長江學者和創新團隊發展計劃資助”(No.IRT13058)；貴州省科技廳重大專項[黔科合重大專項字2014(6008)]；貴州省科技廳項目[201344，黔科合SY字(2013)3020]

(貴州醫科大學分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

齊曉嵐，E-mail：xiaolan76@163.com

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