Fetuin-A基因多態性(rs4917，rs4918)與動脈粥樣硬化性腦梗死的關系

李文君，　朱　可，　趙冬雪，　馮　娟

?

Fetuin-A基因多態性(rs4917，rs4918)與動脈粥樣硬化性腦梗死的關系

李文君，朱可，趙冬雪，馮娟

目的探討遼寧地區漢族人群胎球蛋白A(fetuin-A)基因的rs4917和rs4918多態性與動脈粥樣硬化性腦梗死(atherosclerotic cerebral infarction，ACI)的相關性。 方法納入ACI患者167例作為病例組，135例同期體檢的健康人作為正常對照組。通過改良多重連接酶反應技術(improved multiplex ligation detection reaction，IMLDR)檢測fetuin-A基因rs4917和rs4918多態性。應用多因素Logistic回歸分析研究基因多態性與ACI的相關性。結果病例組與對照組rs4917和rs4918基因型分布差異有統計學意義(P<0.05)；病例組患者rs4917的T等位基因頻率和rs4918的G等位基因頻率與對照組相比差異有統計學意義(P<0.01)；進一步構建顯性模型和隱性模型，在隱性模型下兩組差異有統計學意義(P<0.01)；在平衡了ACI各危險因素后，Logistic回歸分析顯示在隱性模型下rs4917及rs4918仍與ACI易感性相關(OR3.039，P=0.017，95%CI1.217～7.589)。結論fetuin-A基因rs4917及rs4918多態性與遼寧地區漢族人群ACI易感性相關；rs4917的T/T基因型及rs4918的G/G基因型可能是遼寧地區漢族人群ACI的危險因素。

動脈粥樣硬化性腦梗死；胎球蛋白A；基因多態性

胎球蛋白A(fetuin-A)是一種在血液中含量豐富的糖蛋白，在人體中主要由肝臟和脂肪組織合成和分泌[1]。fetuin-A可抑制炎癥因子的產生和聚集[2]；可與血液中多余的鈣、磷等離子形成復合體，阻止鈣、磷在血管內皮的沉積，因此可能在動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的形成中起到保護作用[3]。然而，有研究顯示fetuin-A可促進胰島素抵抗[4],影響脂肪代謝[5]，因此也有學者認為fetuin-A可增加AS的風險[6]。動脈粥樣硬化性腦梗死(atherosclerotic cerebral infarction，ACI)是以AS為疾病基礎的多基因相關性疾病。其病因復雜，遺傳和環境的共同作用促使了ACI的發生。近年來，隨著遺傳學和分子生物學的發展，對基因多態性的探討已成為疾病易感性研究的熱點。目前國內外對于fetuin-A基因多態性與心腦血管疾病的研究相對較少且結論并不統一，因此本研究旨在探討fetuin-A基因rs4917及rs4918多態性與ACI的關系。

1　材料與方法

1.1研究對象

1.1.1病例組選取2015年6月-2016年2月在中國醫科大學附屬盛京醫院神經內科確診為大動脈粥樣硬化性腦梗死患者，共167例，其中男117例,女50例。均為遼寧地區漢族人群，彼此無親緣關系。入選病例均符合第四屆全國腦血管病學術會議所制定的診斷標準及改良TOAST分型標準[7,8]，經頭部CT和(或)MRI證實，并且進行顱多普勒、顱腦血管超聲、頭部MRA、心臟超聲等檢查。 排除標準：(1)合并出血的腦梗死；(2)合并腫瘤、自身免疫性疾病，嚴重心、肝、腎功能不全；(3)患急慢性感染者；(4)心源性或凝血機制異常所致的腦梗死；(5)先天血管畸形或動脈炎導致腦梗死的患者；(6)既往或目前進行血液透析患者；(7)既往冠心病患者或既往腦梗死患者等。

1.1.2對照組隨機選取同期在我院體檢中心的健康體檢者135 例，男90例，女45例。經影像學證實無冠心病或既往腦梗死。均為遼寧地區人群，彼此無親緣關系，其年齡和性別與病例組均匹配。排除標準同病例組。

1.2臨床資料的采集該研究符合我院所制訂的倫理學標準，入組者均簽署知情同意書。所有入組者進行詳細的體格檢查和病史詢問。病例組和對照組均晨起空腹抽血，進行血脂、血糖等生化學檢測，并記錄其高血壓、糖尿病病史以及吸煙、飲酒等個人情況。

1.3基因多態性檢測所有受試者于清晨抽取靜脈血4 ml，其中2 ml用于血脂、血糖等生化學檢測。剩余2 ml加入EDTA抗凝，-80 ℃低溫保存待提取DNA。 按照天根公司DNA提取試劑盒上的操作步驟提取DNA后立即低溫保存。DNA的測序及引物設計由上海天昊生物有限公司完成。采用改良多重連接酶反應技術(improved multiplex ligation detection reaction，IMLDR)對rs4917及rs4918進行基因分型(PCR引物及連接引物見表1)。PCR反應條件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，65 ℃ 40 s(每個循環降低0.5 ℃),75 ℃ 1.5 min，以上步驟重復11次；94 ℃ 20 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，以上步驟重復24次；72 ℃延伸2 min。PCR反應結束后在10 μl PCR產物中加入5 U 蝦堿酶(SAP酶)和2 U核酸外切酶I(Exonuclease I)，37 ℃溫浴1 h,然后75 ℃滅活15 min。連接酶反應體系：10×連接緩沖液 1 μl、高溫連接酶 0.25 μl、5’連接引物混合液(1 μmol/L)0.4 μl、3’連接引物混合液(2 μmol/L)0.4 μl、純化后多重PCR產物 2 μl、dd H2O 6 μl 混勻。連接程序：94 ℃ 1 min，56 ℃ 4 min，進行38次循環。連接結束后取0.5 μl 稀釋后的連接產物，與0.5 μl 500相對分子質量內標(Liz500 sizestandard)、9 μl甲酰胺變性劑(Hi-Di)混勻， 95 ℃變性5 min后上ABI3730XL測序儀，測序儀上收集的原始數據用GeneMapper 4.1 (AppliedBiosystems,USA) 來分析。隨機選取10%的樣本進行重復驗證，評價基因型結果的準確性。

2　結　果

2.1病例組和對照組一般情況比較病例組和對照組比較，年齡、性別、甘油三脂、總膽固醇、低密度脂蛋白、載脂蛋白B無統計學差異(P>0.05)；吸煙、飲酒、糖尿病、高血壓、血脂異常、高密度脂蛋白、載脂蛋白A1差異有統計學意義(P<0.05)(見表2)。

2.2等位基因頻率及基因型分布病例組和對照組2個SNP均滿足Hardy-Weinberg平衡：對照組rs4917(χ2=1.075，P=0.364)，rs4918(χ2=1.075，P=0.364)；病例組rs4917(χ2=0.823，P=0.2997)，rs4918(χ2=0.823，P=0.2997)；病例組rs4917，rs4918基因型分布與對照組相比有統計學差異(P<0.05)；病例組rs4917的T等位基因頻率和rs4918的G等位基因頻率與對照組相比差異有統計學意義(P<0.01)(見表3)。

2.3rs4917及rs4918與ACI的相關性進一步構建模型分析rs4917和rs4918與ACI的相關性，發現隱性模型在病例組和對照組間差異有統計學意義(P<0.01)；顯性模型在兩組間差異無統計學意義(P>0.05)(見表4)。

2.4Logistic回歸分析在平衡了高血壓、糖尿病、吸煙、飲酒、血脂異常、高密度脂蛋白、載脂蛋白A1后Logistic回歸分析顯示在隱性模型下rs4917及rs4918仍與ACI易感性相關(OR=3.039，95%CI：1.217～7.589，P=0.017)。此結果提示rs4917T/T基因型和rs4918G/G基因型人群患ACI幾率增加3.039倍(見表5)。

表1　PCR引物及連接引物

表2　病例組和對照組一般情況分析

注: TG=甘油三酯；TC=總膽固醇；HDL=高密度脂蛋白；LDL=低密度脂蛋白；ApoA1=載脂蛋白A1；ApoB=載脂蛋白B。a=t檢驗，b=χ2檢驗，*為P<0.05

表3　基因型分布與基因頻率

表4　rs4917/rs4918基因多態性與ACI的相關性

注：rs4917隱性模型：TT比TC+CC;顯性模型：TC+TT比CC；rs4918隱性模型：GG比GC+CC;顯性模型：GC+GG比CC

表5　rs4917/rs4918與ACI相關性的Logistic回歸分析

注：HDL=高密度脂蛋白；ApoA1=載脂蛋白A1；rs4917即T/T比(T/C+C/C)；rs4918即G/G比(G/C+C/C)

3　討　論

Fetuin-A在人體血清中含量豐富，隨著年齡的增長fetuin-A濃度逐漸下降，在成人血液中濃度大約為300～1000 μg/ml[9]。近年來，fetuin-A與血管性疾病的關系逐漸引起關注。Scialla[10]對602例透析患者進行研究，發現血清低濃度fetuin-A會增加心血管疾病的死亡率。Jensen MK[11]分析了3810例大于65歲的非肥胖老年人，發現血清中fetuin-A增加可減少心血管疾病發生率。這些實驗都說明fetuin-A在血管性疾病的發生和發展中起保護作用。這可能是因為fetuin-A可與血液中多余的鈣、磷等礦化離子形成直徑約50～300 nm的膠體球，通過清道夫受體被單核巨噬系統識別并清除，從而抑制了血管的鈣化[12]。同時，fetuin-A還可滅活巨噬細胞；抑制與AS相關的炎癥前因子，如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-1(IL-1)等[1,2]。 然而fetuin-A也是一種胰島素受體酪氨酸激酶抑制劑，可以和胰島素受體的β亞基結合，抑制受體的自身磷酸化，從而抑制胰島素信號通路[4]。Mori K[13]發現fetuin-A濃度可能和胰島素抵抗成正相關。Obuchi A[14]還發現fetuin-A可促進代謝綜合征的發生，可能與總膽固醇水平、低密度脂蛋白、非高密度脂蛋白、甘油三脂等成正相關，而與高密度脂蛋白成負相關。因為胰島素抵抗和代謝綜合征都是AS的危險因素，因此，一些學者認為fetuin-A可能是AS的危險因素。Rittig[15]研究315例糖尿病高危因素人群，發現血清fetuin-A與頸動脈內膜厚度正相關。Zhao ZW[16]的實驗也說明在2型糖尿病患者中，fetuin-A和冠狀動脈血管疾病的嚴重程度成正相關。Roos[17]等認為血清fetuin-A和血管性疾病的關系具有雙面性，這種雙面性取決于AS的程度。在無糖尿病和無既往血管性疾病的人群，fetuin-A濃度與血管性疾病成正相關，但在已經患有血管性疾病的患者，fetuin-A的濃度與血管性疾病嚴重程度成負相關。這可能是因為，在血管性疾病的早期，fetuin-A因促進胰島素抵抗和血脂代謝異常導致血管功能紊亂。然而隨著血管疾病的發展，因其可抑制血管鈣化以及抑制炎癥因子，所以抑制血管性疾病的發展[16]。

編碼fetuin-A的基因位于人類3號染色(3q27)上，已有30多個位點被證實具有多態性，其中包括rs4917和rs4918。已有研究表明rs4917、rs4918突變與fetuin-A血清濃度明顯相關，野生純合子人群fetuin-A濃度最高，突變雜合子濃度次之；而突變純合子基因型人群中fetuin-A濃度最少[18]。因此，rs4917和rs4918位點突變可能通過改變fetuin-A濃度而影響心腦血管疾病的易感性。先前的實驗結果并不一致。Fisher[19]的實驗表明rs4917C等位基因是動脈粥樣硬化性心血管疾病的危險因素。Coker-Gurkan A[20]研究證明在歐洲>40歲的人群中rs4917位點T突變是心肌梗死的危險因素,而Shanshan Ma[21]的實驗則證明中國人群rs4918位點G等位基因突變與ACI發病相關，是其危險因素。我們的實驗發現在病例組中rs4917位點T等位基因頻率、T/T基因型分布以及rs4918位點G等位基因頻率、G/G基因型分布均與對照組有明顯差異，在校正了多種混雜因素后仍有統計學意義(P<0.05)。rs4917位點T/T比(C/T+C/C)和rs4918位點G/G比(C/G+C/C),OR=3.039。此結果提示rs4917T/T基因型和rs4918G/G基因型人群ACI易感性增加3.039倍。本實驗還發現rs4917位點T突變與rs4918位點G突變是存在連鎖關系的，這在歐洲人群中也有類似報道[20]。

雖然本實驗沒有測量fetuin-A濃度，不能直接證明fetuin-A基因突變是通過改變fetuin-A濃度來影響ACI易感性的，但是因為fetuin-A的濃度在體內變化較大，且與腎功能、炎癥、糖尿病等疾病狀態相關[18]，而fetuin-A基因序列相對恒定，因此從一定意義上來講，研究fetuin-A基因多態性更能說明其與ACI易感性的關系。本實驗樣本量相對較小，且只是單中心病例對照研究，可能導致結果的偏移，影響實驗的準確性，故仍需進一步擴大樣本量。

[1]Li W,Zhu S,Li J,et al.A hepatic protein,fetuin-A,occupies a protective role in lethal systemic inflammation[J].PLoS One,2011,6(2):16945.

[2]Celebi G,Genc H,Gurel H,et al.The relationship of circulating fetuin-a with liver histology and biomarkers of systemic inflammation in nondiabetic subjects with nonalcoholic fatty liver disease[J].Saudi J Gastroenterol,2015,21(3):139-145.

[3]Herrmann M,Sch A Fer C,Heiss A,et al.Clearance of fetuin-A-containing calciprotein particles is mediated by scavenger receptor-A[J].Circulation Res,2012,111(5):575-584.

[4]Goustin AS,Derar N,Abou-Samra AB.Ahsg-fetuin blocks the metabolic arm of insulin action through its interaction with the 95-kD β-subunit of the insulin receptor[J].Cellular Signalling,2013,25(4):981-988.

[5]Noureldein MH,El-Razek RSA,El-Hefnawy MH,et al.Fenofibrate reduces inflammation in obese patients with or without type 2 diabetes mellitus via sirtuin 1/fetuin A axis[J].Diabetes Res Clinic Practice,2015,109(3):513-520.

[6]Dogru T,Genc H,Tapan S,et al.Plasma fetuin-A is associated with endothelial dysfunction and subclinical atherosclerosis in subjects with nonalcoholic fatty liver disease[J].Clinic Endocrinol,2013,78(5):712-717.

[7]中華醫學會神經科學會.各類腦血管病診斷要點[J].中華神經科雜志,1996,29:379.

[8]Han SW,Kim SH,Lee JY,et al.A new subtype classification of ischemic stroke based on treatment and etiologic mechanism [J].Eur Neurol,2007,57:96-102.

[9]Trepanowski JF,Mey J,Varady KA.Fetuin-A:a novel link between obesity and related complications[J].Int J Obesity,2015,39(5):734-741.

[10]Scialla JJ,Kao WL,Crainiceanu C,et al.Biomarkers of vascular calcification and mortality in patients with ESRD[J].ClinicJ Am Societ Nephrol,2014,9(4):745-755.

[11]Jensen MK,Bartz TM,Mukamal KJ,et al.Fetuin-A,Type 2 diabetes,and risk of cardiovascular disease in older adults,The Cardiovascular Health Study[J].Diabetes Care,2013,36(5):1222-1228.

[12]Heiss A,DuChesne A,Denecke B,et al.Structural basis of calcification inhibition by α2-HS glycoprotein/fetuin-A formation of colloidal calciprotein particles[J].J Biologic Chemist,2003,278(15):13333-13341.

[13]Mori K,Emoto M,Yokoyama H,et al.Association of serum fetuin-A with insulin resistance in type 2 diabetic and nondiabetic subjects[J].Diabetes Care,2006,29(2):468-468.

[14]Obuchi A,Adachi H,Enomoto M,et al.High plasma fetuin-A levels are associated with metabolic syndrome among males but not females in a Japanese general population[J].Diabetes Res Clinic Practice,2014,106(1):128-135.

[15]Rittig K,Thamer C,Haupt A,et al.High plasma fetuin-A is associated with increased carotid intima-media thickness in a middle-aged population[J].Atherosclerosis,2009,207(2):341-342.

[16]Zhao Z,Lin C,Wu L,et al.Serum fetuin-A levels are associated with the presence and severity of coronary artery disease in patients with type 2 diabetes[J].Biomarkers,2013,18(2):160-164.

[17]Roos M,Oikonomou D,von Eynatten M,et al.Associations of fetuin-A levels with vascular disease in type 2 diabetes patients with early diabetic nephropathy[J].Cardiovasc Diabetol,2010,9(1):48-54.

[18]Laugsand LE,Ix JH,Bartz TM,et al.Fetuin-A and risk of coronary heart disease:A Mendelian randomization analysis and a pooled analysis of AHSG genetic variants in 7 prospective studies[J].Atherosclerosis,2015,243(1):44-52.

[19]Fisher E,Stefan N,Saar K,et al.Association of AHSG gene polymorphisms with fetuin-A plasma levels and cardiovascular diseases in the EPIC-Potsdam study[J].Circulation:Cardiovascular Genetics,2009,2(6):607-613.

[20]Coker-Gurkan A,Coskun D,Arisan E D,et al.Fetuin-A 742 (C/T) and 766 (C/G) polymorphic sites are associated with increased risk of myocardial infarction in older patients (≥ 40 years of age)[J].Molecular Med Reports,2015,12(1):1356-1362.

[21]Ma S,He Z,Zhao J,et al.Association of AHSG gene polymorphisms with ischemic stroke in a Han Chinese population[J].Biochemical Genetics,2013,51(11/12):916-926.

Correlation between fetuin-A gene polymorphism(rs4917，rs4918) and atherosclerosis cerebral infarction

LIWenjuan,ZHUKe,ZHAODongxue,etal.

(DepartmentofNeurology,ShengjingHospitalAffiliatedtoChinaMedicalUniversity,ShenyangofLiaoningProvince,Shenyang110004,China)

ObjectiveTo investigate the correlation between fetuin-A rs4917 and rs4918 gene polymorphism and atherosclerosis cerebral infarction (ACI) in Han population of Liaoning area.MethodsA total of 167 patients with ACI were enrolled as the case group and 135 healthy subjects over the same period were enrolled as the control group.The improved multiplex ligase chain reaction (IMLDR) was used to perform genotyping for fetuin-A gene rs4917 and rs4918.And the correlation between the gene polymorphism and ACI was analyzed with multivariate logistic regression analysis.ResultsGenotype distribution of rs4917 and rs4918 in the case group was different(P<0.05) from the control group;T allele frequency in rs4917 and G allele frequency in rs4918 in the case group were different (P<0.01) from the control group;when build the dominant and recessive model,there was difference(P<0.01) between the two groups in recessive model;After adjusting for risk factors of ACI,multiple logistic regression analysis showed rs4917 and rs4918 still have correlation with susceptibility of ACI(OR=3.039，P=0.017，95%CI：1.217～7.589).ConclusionFetuin-A gene rs4917 and rs4918 polymorphisms have correlation with susceptibility of ACI in Han population of Liaoning area.The T/T genotype of rs4917 and G/G genotype of rs4918 may be risk factors for ACI susceptibility.

Fetuin-A;Atherosclerosis cerebral infarction;Gene polymorphis

1003-2754(2016)08-0719-05

2016-04-22；

2016-05-29

(中國醫科大學附屬盛京醫院神經內科，遼寧 沈陽 110000)

馮娟，E-mail：cmufengjuan@sina.com

R743.1

A