基于三種體外抗氧化方法對(duì)白木香種子抗氧化能力的研究

周海玲　馬　麟　易智彪.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州　500；.東莞廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院，廣東東莞　53808

基于三種體外抗氧化方法對(duì)白木香種子抗氧化能力的研究

周海玲1馬麟1易智彪2
1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州510120；2.東莞廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院，廣東東莞523808

目的 探究白木香種子的體外抗氧化能力。方法 預(yù)處理白木香種子并提取其黃酮成分；用銅離子還原法測(cè)定了其還原能力，采用2，2'-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）體系對(duì)其進(jìn)行抗氧化活性的研究，并以抗壞血酸（VC）作比較。測(cè)定并計(jì)算其相對(duì)總還原百分率或清除率，以相對(duì)總還原百分率或清除率為縱坐標(biāo)、樣品液的濃度為橫坐標(biāo)作線性回歸，從回歸曲線的置信限制中找到概率為0.50的估算濃度即為半抑制濃度（IC50）。本研究所得數(shù)據(jù)全部采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0建模分析。結(jié)果 白木香種子對(duì)銅離子還原力、對(duì)ABTS+·和DPPH·的清除能力的IC50分別為0.097 75、0.1366、0.4224 mg/mL。在考察范圍內(nèi)，白木香種子的抗氧化能力隨著其濃度的增加而增強(qiáng)，但弱于VC。結(jié)論 白木香種子有較好的抗氧化能力，為中藥制劑的開(kāi)發(fā)及保健品的開(kāi)發(fā)提供一定的參考依據(jù)，其藥理價(jià)值值得進(jìn)一步深入研究。

白木香種子；銅離子還原；ABTS+·；DPPH·

［Abstract］Objective To explore the antioxidant capacity of Aquilariae sinensis seeds.Methods Aquilariae sinensis seeds were under pretreatment and their flavonoids were extracted.Ascorbic acid（VC）was set as a positive control.The reduction ability was determined by copper ion reduction method.The antioxidant activity of was studied by using 2，2'-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）（ABTS）and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）.Relative total reduction percentage or clearance was measured and calculated.Relative total reduction percentage or clearance as ordinated and the concentration of liquid samples as abscissa，they were obtained by regression and the estimated concentration，whose probability was 0.50 in confidence limit of regression curve was half maximal inhibitory concentration （IC50）.All the data was modeled and analyzed by statistical software SPSS 19.0.Results Aquilariae sinensis seeds of copper ion reduction force IC50was 0.097 75 mg/mL.The IC50of the ability to clear the ABTS+·and DPPH·were 0.1366 mg/mL and 0.4224 mg/mL.Within the scope of the investigation，antioxidant capacity of Aquilariae Sinensis Seeds increased with its concentration，but weaker than VC.Conclusion The Aquilaria Sinensis seeds have good antioxidant capacity and provide a reference for the development of traditional Chinese medicine and health care products，and its pharmacological value is worthy of further study.

［Key words］Aquilaria Sinensis Seeds；Copper ion reduction；ABTS；DPPH·

沉香為瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis （Lour.）Gilg含樹(shù)脂的木材，其味辛、苦，性微溫，具行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘的功效，用于治療胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急［1］。目前白木香種栽培規(guī)模不斷擴(kuò)大，在海南、廣東等地均有大量種植，僅在廣東的種植面積已近20萬(wàn)畝，其中廣東電白縣已建成萬(wàn)畝產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)基地［2-4］。白木香種子是白木香的副產(chǎn)物，目前白木香種子只有少部分用于育苗，其資源未得到有效開(kāi)發(fā)利用［2］。人體的許多疾病和組織損傷等都與體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，因此，應(yīng)用抗氧化物質(zhì)來(lái)保持人體健康預(yù)防疾病的研究得到越來(lái)越多科學(xué)家的關(guān)注［5-8］。隨著科技和工業(yè)的發(fā)展，抗氧化劑已廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，為了減輕自由基的危害，目前尋找高效、低毒或無(wú)毒、天然的抗氧化劑，篩選具有抗自由基損傷的物質(zhì)，具有重要的意義［9］。隨著沉香的資源的綜合開(kāi)發(fā)利用不斷深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)沉香葉、沉香茶、沉香種子等非藥用部位均有一定的抗氧化的作用［10-12］，而目前對(duì)于白木香種子的體外抗氧化研究?jī)H限于DPPH法［13-14］，這種局限性導(dǎo)致不能科學(xué)正確、全面充分反映白木香種子的抗氧化能力。本研究將采用銅離子還原能力的測(cè)定、ABTS+·清除能力的測(cè)定和自由基DPPH·清除能力的測(cè)定等三種方法評(píng)價(jià)白木香種子的體外抗氧化能力，不僅具有一定的國(guó)內(nèi)科研創(chuàng)新性，而且還能為白木香種子的體內(nèi)抗氧化能力和其他藥理作用的研究提供一定的客觀依據(jù)，有助于白木香的綜合開(kāi)發(fā)利用。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下:

1　材料與方法

1.1一般材料

白木香種子由廣東鵬華科技有限公司提供，經(jīng)廣東省中醫(yī)院藥學(xué)部中藥師龔又明鑒定為瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg的種子；ABTS，化學(xué)名稱(chēng)2，2'-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽:廠家Aladdin Lindustrial Corporation，批號(hào)（CAS:30931-67-0），純度98%；DPPH，化學(xué)名稱(chēng)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼:天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)（CAS:1898-66-4），純度96%；新亞銅:天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)（CAS:34302-69-7），純度98%；抗壞血酸（Vitamin C，VC）:天津市百世化工有限公司；過(guò)硫酸鉀（K2S2O8）:天津市大茂化學(xué)試劑廠；硫酸銅（Cu-SO4）:成都市科龍化工試劑廠；醋酸銨（CH3COONH4）:天津市大茂化學(xué)試劑廠；無(wú)水乙醇:天津市富宇精細(xì)化工有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。CP225D十萬(wàn)分之一分析天平:廣州市正一科技有限公司；KQ3200DE超聲儀（頻率:250 Hz）:昆山市超聲儀器有限公司；可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì)（型號(hào):TU-1810PC）:北京普析通用儀器有限公司；SD-250型渦輪式粉碎機(jī):浙江省特種粉碎設(shè)備廠，250 mL索氏提取器:鄭州興華玻璃儀器廠。

1.2方法

1.2.1白木香種子的預(yù)處理及其黃酮的提取選取適量飽滿成熟的白木香種子，置恒溫干燥箱中（60.0± 0.2）℃烘12 h，然后研磨過(guò)60目。準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量的白木香種子干粉用索氏抽提法（石油醚為抽提液，75℃）脫脂及除脂溶性色素，當(dāng)石油醚抽提液為無(wú)色時(shí)揮盡石油醚，然后繼續(xù)用乙酸乙酯，甲醇重復(fù)上述過(guò)程，最后用60%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇浸提，回流提取白木香種子的黃酮［17］。浸提料液比為1∶5（g∶mL），每次浸提2 h，浸提溫度為100℃，直到乙醇提取液基本無(wú)色，共浸提5次，合并所有的浸提液并進(jìn)行減壓濃縮至恒重，得到浸膏。

1.2.2樣品溶液的配制精密稱(chēng)取浸膏10 mg，用無(wú)水乙醇定容至10 mL得到濃度1 mg/mL的白木香種子樣品液。

1.2.3銅離子還原能力的測(cè)定分別取0.5 mL不同濃度的樣品液，加入0.01 mol/L CuSO4和7.5 mmol/L新亞銅試劑各0.125 mL混合，再加入0.2 mol/L pH值7.0的NH4Ac緩沖液至總體積為1.0 mL，搖勻，靜置30 min，于450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。以溶劑為空白對(duì)照，逐一測(cè)得吸光度。以VC為陽(yáng)性對(duì)照，平行3次試驗(yàn)。其計(jì)算公式如下:相對(duì)總還原百分率=（A-A0）/ （Amax-A0）。式中:A0為樣品濃度為0時(shí)的Amax值；Amax為在一次測(cè)量?jī)?nèi)最大的吸光度值；A為樣品的A450 nm值。

1.2.4ABTS+·清除能力的測(cè)定 將7 mmol/L ABTS+·溶液與2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀水溶液混合，在避光、室溫條件下靜置12～16 h，形成ABTS自由基儲(chǔ)備液。將此儲(chǔ)備液與無(wú)水乙醇按照約1∶45（V/V）的比例混合，在734 nm下調(diào)吸光度為（0.70±0.02），得到ABTS+·工作液，于30℃下預(yù)熱備用。分別取不同濃度的樣品液與ABTS+·工作液混合，搖勻，室溫下避光30 min，后在734 nm測(cè)定其吸光度，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，平行3次試驗(yàn)。其計(jì)算公式為:清除率=（A0-A）/A0×100%。式中:A0是未加樣品所得的吸光度，A是添加樣品后所得的吸光度。

1.2.5DPPH·清除能力的測(cè)定精密稱(chēng)取20 mg DPPH，用無(wú)水乙醇超聲溶解并定容至250 mL容量瓶中，得濃度為0.2 mmol/L的DPPH·溶液（測(cè)定吸光度在0.8左右）。分別取不同濃度的樣品液與DPPH溶液加入同一具塞試管中，搖勻，避光反應(yīng)30 min后，用無(wú)水乙醇做參比，測(cè)定515 nm處溶液的吸光度，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，平行3次試驗(yàn)。根據(jù)公式計(jì)算清除率:清除率（%）=（1-Ai/A0）×100%。式中:Ai是油樣與DPPH·溶液混合后的吸光度；A0是對(duì)照溶液的吸光度。

1.3觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

本研究以IC50即氧化劑被抑制一半時(shí)抑制劑（還原劑）的濃度為觀察指標(biāo)。按“1.2”項(xiàng)下方法計(jì)算結(jié)果，以相對(duì)總還原百分率或清除率為縱坐標(biāo)、樣品液的濃度為橫坐標(biāo)作線性回歸，從回歸曲線的置信限制中找到概率為0.50的估算濃度即為IC50。一般認(rèn)為某種物質(zhì)的IC50值低于10 mg/mL，該物質(zhì)具有抗氧化能力［15］。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)全部采用Microsoft Office 2010和統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)及線性回歸。從可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì)下讀出不同樣品濃度的吸光度（A值），取連續(xù)測(cè)量三次的平均值，分別通過(guò)“1.2”項(xiàng)下的計(jì)算公式換算成相對(duì)總還原率和清除率，最后以相對(duì)總還原百分率或清除率為縱坐標(biāo)、樣品液的濃度為橫坐標(biāo)作線性回歸，從回歸曲線的置信限制中讀出概率為0.50的估算濃度即為IC50。其中，濃度和A值保留2位有效數(shù)字，IC50保留4位有效數(shù)字。

2　結(jié)果

2.1銅離子還原能力的測(cè)定結(jié)果

在0.02～0.12mg/mL的范圍內(nèi)，白木香種子和VC對(duì)銅離子的還原能力呈現(xiàn)線性關(guān)系，擬合回歸線得到其IC50分別為0.09775、0.01700 mg/mL。見(jiàn)圖1。

圖1　白木香種子和VC的銅離子還原能力

2.2對(duì)ABTS+·的清除作用測(cè)定結(jié)果

在0.2～1.0 mg/mL的范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，白木香精油、白木香種子和VC對(duì)ABTS+·的清除能力逐漸增強(qiáng)，通過(guò)計(jì)算得出，其 IC50分別為 0.1366、0.006 179 μg/mL。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　白木香種子和VC對(duì)2，2'-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基清除能力

2.3對(duì)DPPH·的清除作用測(cè)定結(jié)果

在1.5～25.0 mg/mL的范圍內(nèi)，白木香種子對(duì)DPPH·有一定的清除能力，且隨著濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，并且白木香種子在質(zhì)量濃度達(dá)到一定值時(shí)，清除率開(kāi)始趨于平衡。白木香種子和VC的IC50分別為0.4224、0.005516 mg/mL。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　白木香種子和VC對(duì)DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基的清除能力

3　討論

根據(jù)結(jié)果可以得出，在考查范圍內(nèi)，白木香種子抗氧化能力可以隨著其濃度的增加而增強(qiáng)。白木香種子對(duì)銅離子還原力、對(duì)ABTS+·和DPPH·的清除能力的IC50分別為0.097 75、0.1366、0.4224 mg/mL；而VC對(duì)銅離子還原力、對(duì)ABTS+·和DPPH·的清除能力的IC50分別為0.017、0.006 179、0.005 516 mg/mL。與VC相比，白木香種子的抗氧化能力明顯較弱，但是國(guó)內(nèi)專(zhuān)家一致認(rèn)為某種物質(zhì)的IC50值低于10 mg/mL，該物質(zhì)則具備抗氧化能力［15］。其中，在ABTS+·的清除作用的研究中，白木香種子在濃度為0.3 mg/mL時(shí)，清除率可達(dá)96%，自由基基本上被完全清除。可以初步得出，白木香種子有較好的抗氧化能力。

目前，段宙位等［16］提取白木香葉中的黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行體外抗氧化研究，證實(shí)白木香葉黃酮提取物具有較強(qiáng)的清除DPPH·和ABTS+·能力。而有研究發(fā)現(xiàn)白木香種子含有的5-羥基-7，3'，4'-三甲氧基黃酮、5，3'-二羥基-7，4'-二甲氧基黃酮、5，4'-二羥基-7，3'-二甲氧基黃酮與白木香葉子的黃銅類(lèi)成分相同，但是，具體是哪種化學(xué)成分致使白木香種子有較好的抗氧化能力，以及具體抗氧化機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

自由基是人體進(jìn)行生命活動(dòng)時(shí)所產(chǎn)生的一種活性分子，自由基過(guò)多就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和組織器官損傷，誘發(fā)各種疾病，加速機(jī)體衰老。抗氧化劑的抗氧化作用可以通過(guò)抑制自由基的產(chǎn)生，或直接清除自由基，甚至可以通過(guò)提高內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)的水平來(lái)實(shí)現(xiàn)［17］。白木香是我國(guó)沉香藥材的主要來(lái)源，目前沉香市場(chǎng)需求持續(xù)擴(kuò)大，尋求沉香代替產(chǎn)品刻不容緩，其中，白木香種子便宜易得，產(chǎn)量高，卻未能得到有效應(yīng)用。本研究通過(guò)銅離子還原法、ABTS法和DPPH法對(duì)白木香種子進(jìn)行體外抗氧化能力測(cè)定，結(jié)果顯示白木香種子對(duì)銅離子的還原能力、對(duì)ABTS+·和DPPH·的清除能力比VC弱，但是在考察范圍內(nèi)，白木香種子的抗氧化能力隨著濃度的增加而增強(qiáng)，并且其IC50均小于10 mg/mL［18］，因此白木香種子有較好的抗氧化能力，這對(duì)白木香精油和種子進(jìn)行體內(nèi)抗氧化研究提供了一定的參考。

ABTS法是快速簡(jiǎn)便普遍用于常規(guī)抗氧化劑清除自由基能力的評(píng)價(jià)方法，可測(cè)量水溶性化合物也可測(cè)量脂溶性化合物，需要自由基的發(fā)生體系。DPPH法則不需有自由基的發(fā)生體系，有選擇性，但局限性是只溶于有機(jī)溶劑。以上兩種方法測(cè)定的都只是非生理?xiàng)l件下的自由基，因此還與銅離子還原法聯(lián)用，此法測(cè)定環(huán)境接近生理環(huán)境。生物體系中多個(gè)抗氧化體系中決定了不能以單一的方法去判斷某種物質(zhì)的抗氧化能力，另外，現(xiàn)采用的抗氧化方法大都是體外抗氧化測(cè)定，對(duì)于真實(shí)的生理環(huán)境只能盡可能接近，卻無(wú)法真正模擬，所以一般抗氧化研究都會(huì)選取兩種以上的方法來(lái)共同說(shuō)明某物質(zhì)的抗氧化能力。

隨著現(xiàn)代研究逐漸深入，人們?cè)絹?lái)越意識(shí)到沉香藥材產(chǎn)業(yè)具有巨大的藥用開(kāi)發(fā)潛力，在加強(qiáng)藥材種植的同時(shí)，國(guó)內(nèi)學(xué)者擴(kuò)大了對(duì)白木香葉、種子以及花和果實(shí)等非藥用部位的研究。而在木香非藥用部位的資源綜合開(kāi)發(fā)利用研究方面，其發(fā)明專(zhuān)利主要集中在沉香葉的研究開(kāi)發(fā)，而本研究發(fā)現(xiàn)，白木香種子具有較強(qiáng)的抗氧化作用，可為中藥制劑的開(kāi)發(fā)及保健品的開(kāi)發(fā)提供一定的參考依據(jù)，同時(shí)文獻(xiàn)研究表明，白木香種子含有多種揮發(fā)油成分和營(yíng)養(yǎng)成分［19-21］。因此有必要對(duì)其藥理作用進(jìn)一步進(jìn)行研究，并篩選藥理活性，為其資源的利用開(kāi)發(fā)提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Study on antioxidant capacity of aquilaria sinensis seeds by three antioxidant methods in vitro

ZHOU Hailing1MA Lin1YI Zhibiao2
1.Department of Pharmacy，Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangdong Province，Guangzhou510120，China；2.Mathematical Engineering Academy of Chinese Medicine，Guangdong Province，Dongguan523808，China

R917

A

1673-7210（2016）08（a）-0012-04

2016-04-28本文編輯:趙魯楓）

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012B01100050，2013B 090800052）；廣東省中醫(yī)藥局課題（20142074）。

易智彪（1979-），男，博士；研究方向:系統(tǒng)生物學(xué)及中藥質(zhì)控與研發(fā)。