脈沖磁療對腦出血大鼠腦內谷氨酸和胰島素樣生長因子-1表達的影響

宋成憲　李　舜　馮楓華　謝澤良　簡穎敏.廣州醫科大學附屬第三醫院康復科，廣東廣州　5050；2.南方醫科大學南方醫院康復科，廣東廣州　5055

脈沖磁療對腦出血大鼠腦內谷氨酸和胰島素樣生長因子-1表達的影響

宋成憲1李舜1馮楓華1謝澤良1簡穎敏2▲
1.廣州醫科大學附屬第三醫院康復科，廣東廣州510150；2.南方醫科大學南方醫院康復科，廣東廣州510515

目的 觀察脈沖磁療對腦出血大鼠腦組織中谷氨酸和胰島素樣生長因子-1（IGF-1）表達的影響。方法 清潔級雄性SD大鼠36只，隨機分成假手術組、模型組和磁療組，每組又分為3 d組和7 d組，每個亞組各6只大鼠。采用立體定向技術制作腦出血模型。磁療組于術后2 h開始脈沖磁療干預，異名磁極對置于頭部，磁距10 cm，平均磁場強度0.01 T，頻率50 Hz，20 min/次，1次/d。并于腦出血3、7 d時分別對各組大鼠進行神經行為學評定、谷氨酸和IGF-1濃度的測定。結果 磁療3、7 d組改良神經功能缺失評分（mNSS）均比對應的模型組下降，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。腦出血后，腦組織中谷氨酸表達增加，經過脈沖磁療3、7 d后，谷氨酸濃度均明顯下降，低于模型組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。正常腦組織內IGF-1有少量表達，腦出血后，其表達增加；經過磁療3、7 d后，與模型組相比，IGF-1水平均明顯升高，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。結論 脈沖磁療可以一定程度上促進腦出血大鼠神經功能的恢復，其機制可能與谷氨酸水平的下降和IGF-1的表達增加有關。

脈沖磁療；腦出血；谷氨酸；胰島素樣生長因子-1

［Abstract］Objective To observe the effects of pulsed magnetic therapy on the expression of glutamate and insulinlike growth factor-l（IGF-1）after cerebral hemorrhage in rats.Methods 36 male adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into the sham group（n=12），model group（n=12）and magnetic therapy group（n=12）.Each group was randomly divided into 3 d and 7 d subgroups，with 6 rats in each subgroup.The cerebral hemorhage model of rats was made using the technology of stereotaxis.The magnetic therapy group was treated with pulsed magnetic therapy（0.01 T，50 Hz，20 min/times，1 times/d）after hemorrhage 2 h.The modified neurological severity score（mNSS），the concentration of glutamate and IGF-1 were evaluated at 3 d and 7 d after cerebral hemorrhage.Results Compared to the model group，the mNSS scores in 3 d and 7 d magnetic therapy group decreased significantly（P＜0.01）.After cerebral hemorrhage，the concentration of glutamate increased；in the magnetic therapy group，the concentration of glutamate was significantly decreased than in the model group after hemorrhage 3 d and 7 d（P＜0.01）.IGF-1 had little expression in the normal brain tissue，after cerebral hemorrhage，its expression increased；the concentration of IGF-1 in the magnetic therapy group was significantly increased than in the model group after hemorrhage 3 d and 7 d（P＜0.01）.Conclusion Pulsed magnetic therapy can promote the recovery of neural function in rats.This effect may be associated with the decline of glutamate and the higher expression of IGF-1.

［Key words］Pulsed magnetic therapy；Cerebral hemorrhage；Glutamate；Insulin like growth factor-l

腦出血后局部組織的水腫和繼發性的神經細胞損傷是影響預后的重要因素。一方面，腦組織損傷的同時可以引起興奮性氨基酸（excitatory amino acid，EAA）水平的升高，適量的EAA對維持神經細胞的興奮性是必需的，但高濃度的EAA則具有神經毒性。谷氨酸作為EAA的一種，在中樞神經系統中含量最高。另一方面，腦組織損傷后，可引起內源性神經保護機制的啟動，其中包括胰島素樣生長因子-1（insulin-likegrowth factor-1，IGF-1）表達的增加。脈沖磁療是臨床常用的物理治療方法，許多研究都已經證實它可以促進腦損傷后神經功能的恢復，但對于其具體的作用機制，尚不十分清楚。本研究通過脈沖磁療干預腦出血大鼠，探討其對谷氨酸和IGF-1表達的影響，期望進一步明確磁療在腦出血治療方面的作用機制，為其臨床應用提供進一步的理論依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組

清潔級SD雄性大鼠36只，體重230～290 g，南方醫科大學實驗動物中心提供，許可證號:SCXK（粵）2011-0015，室溫、常濕飼養，普通飼料，自由飲水。采用隨機數字表法分為假手術組、模型組和磁療組，每組又分為3 d組和7 d組兩個亞組，每個亞組各6只大鼠。

1.2試劑與儀器

磁療儀為解放軍總醫院研制的GMC-B型脈沖磁療儀，脈沖磁場強度0～1.5 T，磁脈沖電流寬度＜10 MS，脈沖頻率20～80次/min，電源220 V、50 Hz。谷氨酸分析儀為日立835-50型氨基酸自動分析儀。放射免疫設備為SN-682型放射免疫γ計數器，上海核福光電儀器有限公司生產。IGF-1放射免疫試劑盒由天津九鼎醫學生物工程有限公司提供。

1.3方法

1.3.1腦出血模型制作參考既往文獻的造模方法進行腦出血模型的制作［1-2］。大鼠稱重后用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉后將大鼠固定在大鼠腦立體定位儀上，使前囟和后囟處在同一平面。常規備皮消毒，沿頭正中切開一長約10 mm的切口，切開骨膜，暴露前囟。定位于前囟前0.5 mm，右側旁開3 mm，用牙科鉆在此處鉆一直徑約1 mm的小孔。取血前將大鼠尾置于40℃溫水中加熱5 min，消毒后距末端1 cm處剪斷，取未抗凝血50 μL沿所鉆小孔進針深約6 mm（此處為大鼠尾狀核頭部），以20 μL/min的速度緩慢勻速注入血液，注血結束后留針5 min后緩慢退針，縫合切口，以上操作均嚴格遵循無菌原則。假手術組除不注血外，余步驟同上。術后大鼠回籠飼養，自由飲食飲水。如死亡或未出現偏癱癥狀，則被剔除，隨機補充剔除標本，保證最終每組納入的大鼠數量一致。

1.3.2脈沖磁療干預方法參考既往研究的磁療處方［3］。磁療組動物于術后2 h開始用脈沖磁療儀進行干預。異名磁極對置于大鼠頭部，磁距為10 cm。平均磁場強度為0.01 T，頻率為50 Hz，20 min/次，1次/d。

1.3.3標本制備各組大鼠分別在腦出血3、7 d時予10%水合氯醛（0.45 mL/100 g）深度麻醉，迅速打開胸腔，眼科剪剪開右心耳，自左心室灌注0.9%生理鹽水，快速沖洗體內血液，致流出液清亮為止，再續用4%多聚甲醛250 mL進行灌注固定，然后斷頭取腦。沿針孔處作冠狀切開，有明顯血腫且無蛛網膜下腔出血，未破入腦室者為模型制作成功。模型組和治療組在冰盤上切取以血腫為中心周圍腦組織100 mg，假手術組則取相應部位腦組織100 mg，進行勻漿、離心后取上清液置于-20℃冰箱保存待測。

1.4觀察指標

1.4.1神經行為學評定于造模成功后3、7 d時進行改良神經功能缺失評分（modified neurological severity score，mNSS）評定。評定項目包括平衡木實驗、行走測試、反常運動、感覺測試、反射缺失和提尾反射等，最低為0分，最高分為18分；0分為神經功能正常，得分越高說明神經功能損傷越嚴重［4］。

1.4.2谷氨酸含量的測定將標本從冰箱取出后，常溫解凍后，4℃4800 r/min離心15 min，然后嚴格按照日立835-50型氨基酸自動分析儀的要求進行谷氨酸濃度的測定。

1.4.3IGF-1含量測定將標本從冰箱取出后，常溫解凍。取每個濃度的標準品、質控血清和樣本100 μL于相應編號的試管中，每管均加入100 μL的標志物工作液。除T管（總放射性管）、NSB管（非特異性結合管）以外的各管均加入100 μL抗體工作液，充分混勻后置于4℃溫育24 h，然后加500 μL分離劑，充分混勻，靜置30 min，4℃3600 r/min離心20 min，棄上清液，用γ計數器測定沉淀物每分鐘的放射性活性值，并從標準曲線上得出樣本的濃度。

1.5統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1神經行為學評定

假手術組術后神經行為學評定基本正常，各時間點mNSS評分均為0分。模型組、磁療組與假手術組比較均有神經功能損傷；3、7 d時，模型組和磁療組mNSS評分比較，差異均有高度統計學意義（P＜0.01）；并且，兩組7 d時的神經行為學評分均低于各自3 d時的評分，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1　各組mNSS評定結果比較（分，）

表1　各組mNSS評定結果比較（分，）

組別　3 d　7 d　t值　P值模型組磁療組2.847 2.932 0.017 0.015 t值　P值8.67±0.81 6.83±0.75 4.082 0.002 7.33±0.82 5.50±0.82 3.865 0.003

2.2谷氨酸檢測結果

正常腦組織內谷氨酸有一定的基礎表達，腦出血后，其表達明顯增加，模型組與假手術組相比，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；7 d較3 d時谷氨酸水平有所下降，且差異有統計學意義（P＜0.05）。經過脈沖磁場治療3、7 d后，與模型組相比，谷氨酸濃度均有明顯下降，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；磁療7 d時谷氨酸濃度低于3 d時，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2　各組谷氨酸水平比較（μmol/g，）

表2　各組谷氨酸水平比較（μmol/g，）

注:與假手術組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01

組別　3 d　7 d　t值　P值假手術組模型組磁療組F值P值4.62±0.21 8.84±0.83*7.41±0.65*#71.555 0.000 4.60±0.27 7.64±0.55*5.51±0.56*#59.919 0.000 0.143 2.952 5.424 0.889 0.014 0.000

2.3IGF-1檢測結果

正常腦組織內IGF-1有少量表達。腦出血后，其表達明顯增加，模型組與假手術組相比，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；7 d較3 d時有所下降，但差異無統計學意義（P＞0.05）。經過脈沖磁場治療3、7 d后，與假手術組和模型組相比，IGF-1水平均有明顯升高，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；雖然磁療7 d時IGF-1水平有所下降，但與3 d組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3　各組IGF-1放射免疫測定結果比較（ng/mL，）

表3　各組IGF-1放射免疫測定結果比較（ng/mL，）

注:與假手術組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01

組別　3 d　7 d　t值　P值假手術組模型組磁療組F值P值0.85±0.14 2.36±0.18*2.75±0.22*#176.716 0.000 0.87±0.11 2.07±0.27*2.69±0.26*#101.766 0.000 0.275 2.189 0.431 0.789 0.053 0.675

3　討論

腦出血后血腫周邊及遠隔部位可出現不同程度的腦血流下降，下降程度與血腫的大小和部位有關，即存在類似于腦梗死后缺血半暗帶的病理變化［5］。腦組織的缺血缺氧，可以引起細胞外EAA水平的升高，適量的EAA是神經細胞維持活性所必需的，而高濃度的EAA則具有很強的神經毒性作用。谷氨酸是中樞神經系統中含量最豐富的EAA，平時儲存在神經元突觸前囊泡中，在突觸前膜去極化時釋放到突觸間隙。腦出血后腦組織中谷氨酸的表達明顯增加，且表達的高低同血腫殘腔的體積呈正相關［6］。有學者認為，腦組織缺血缺氧后谷氨酸大量釋放所造成的一系列級聯反應是導致神經細胞死亡的主要原因［7］。腦細胞外不存在谷氨酸代謝酶，谷氨酸的代謝清除主要由位于星形膠質細胞膜上的谷氨酸轉運體來完成。但腦出血后，谷氨酸轉運體的水平持續下調，谷氨酸的清除能力下降［8］。故如果能探索出某種治療方法，減少腦出血后谷氨酸的表達，則理論上可以起到減輕神經細胞損傷的作用。

IGF-1是由70個氨基酸組成的單鏈堿性多肽分子，對哺乳動物神經系統的生長發育具有至關重要的作用，它通過激活IGF-1受體，促進神經細胞的增殖、分化、突觸生長及髓鞘形成［9］。IGF-1在成年腦組織中低水平表達，腦損傷后，IGF-1的水平顯著升高，對損傷的神經細胞起到保護作用［10］。吳紅瑛等［3］研究發現，大鼠腦缺血2 h時，半暗帶區域IGF-1陽性細胞數開始升高，并且IGF-1升高的水平與神經功能缺失呈負相關。有研究表明，給予外源性的IGF-1也可以起到類似的神經保護作用［11］。但目前尚沒有見到外源性IGF-1用于治療人顱腦損傷的報道，且外源性IGF-1價格昂貴，能否通過血腦屏障仍不明確。故如能探索出某種干預方法使內源性IGF-1的表達增加，對于腦損傷的治療，將會有更大的應用價值。

脈沖磁療作為一種安全、簡便的物理因子治療方法，對于骨質疏松癥、骨關節炎、高血壓等多種疾病的治療具有確切的效果［12-14］。近年也有研究表明，低頻脈沖磁療可以促進神經細胞的再生、增殖與分化，對損傷的神經細胞具有保護作用。有人將其用于外周神經及中樞神經損傷的治療，取得了一定的臨床效果，但其確切的機制仍不十分明確［15-16］。

本研究結果顯示，腦出血3 d和7 d時，模型組和磁療組大鼠均存在神經功能損傷，模型組雖然沒有磁療干預，但7 d時的mNSS評分仍低于3 d時，差異有統計學意義（P＜0.05）。說明腦損傷后具有一定的自我修復功能。磁療3 d組和7 d組mNSS評分均低于相應的模型組，說明脈沖磁療可以促進腦出血后神經功能的恢復。兩組mNSS評分隨時間的變化與谷氨酸下降的趨勢一致，而與IGF-1的濃度變化趨勢相反。推測神經功能的恢復可能與谷氨酸濃度的下降及IGF-1水平的升高有關。當然，該結果是在特定的實驗條件下得出的，可能不同的磁場劑量、治療時間、檢測方法等會得出不同的實驗數據和結果，對此需要更深入的論證。

本研究結果顯示，脈沖磁療可以引起腦缺血組織中IGF-1水平的升高，與既往的研究結果一致［3］。此外，有研究表明，損傷局部給予外源性的IGF-1后，可以抑制腦出血后谷氨酸的表達，從而減輕了其對神經細胞的損傷［17］。對于谷氨酸水平的下降，除了IGF-1的作用外，脈沖磁療是否也可以通過其他途徑影響谷氨酸的分泌或者清除？有研究顯示，脈沖磁療可以引起缺血腦組織周圍星形膠質細胞的表達增加［18］。而星形膠質細胞是轉運谷氨酸的主要細胞，它可以將細胞外液中90%的谷氨酸轉運到細胞內，進而將其分解生成谷氨酰胺，從而減輕其對神經細胞的興奮毒性［19-20］。雖然本次實驗沒有直接對星形膠質細胞或其特征性標志物進行觀察，但本研究結果也間接驗證了上述理論的合理性。

綜上所述，本研究結果顯示，脈沖磁療可引起腦出血后血腫局部的谷氨酸水平下降，IGF-1的表達增加，一定程度上促進了腦出血大鼠神經功能的恢復。當然本實驗也有許多不足之處，沒有進行連續的多個時間點的觀察，無法具體明確谷氨酸和IGF-1的動態變化趨勢；此外，對于脈沖磁療引起谷氨酸和IGF-1變化的具體作用機制，有待更深入的研究。

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Effects of pulse magnetic therapy on expression of glutamate and insulinlike growth factor-1 after cerebral hemorrhage in rats

SONG Chengxian1LI Shun1FENG Fenghua1XIE Zeliang1JIAN Yingmin2▲
1.Department of Rehabilitation Medicine，the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangdong Province，Guangzhou510150，China；2.Department of Rehabilitation Medicine，Nanfang Hospital of Southern Medical University，Guangdong Province，Guangzhou510515，China

R743

A

1673-7210（2016）08（a）-0020-04

2016-05-03本文編輯:程銘）

廣州醫科大學附屬第三醫院青年基金項目（2012Y10）。

宋成憲（1982.10-），男，南方醫科大學2013級創傷骨科專業在讀博士研究生；研究方向:神經系統、運動系統疾病康復。