CBF冷應(yīng)答途徑基因在熱處理誘導(dǎo)的香蕉果實抗冷性中的作用

王海波，李 璐，蘇新國，張昭其，龐學(xué)群

（1廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣州 510520；2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510642；3華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣州 510642）

CBF冷應(yīng)答途徑基因在熱處理誘導(dǎo)的香蕉果實抗冷性中的作用

王海波1，李 璐2，蘇新國1，張昭其3，龐學(xué)群2

（1廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣州 510520；2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510642；3華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣州 510642）

【目的】探討CBF/DREB（C-repeat binding transcription factor/dehydrate responsive element binding factor）冷應(yīng)答途徑在熱處理誘導(dǎo)香蕉抗冷性中的作用，為研究香蕉果實中CBF冷應(yīng)答途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程提供參考依據(jù)。【方法】從香蕉基因組數(shù)據(jù)庫（http∶//banana-hub.southgreen.fr/）中挑選 CBF冷應(yīng)答途徑的7個基因序列，分別設(shè)計特異引物，利用實時熒光定量 PCR分析這7個基因在熱處理誘導(dǎo)的香蕉抗冷性中的表達模式。【結(jié)果】香蕉果實MaICE在7℃處理1 h時，表達迅速升高并達到最大值，DREB類基因（MaDREB1D、MaDREB1E、MaDREB1G和MaDREB3）在7℃處理1 h時，均存在一個表達高峰，MaCOR413在7℃下4 h時有一個表達高峰。這些結(jié)果表明，香蕉果實中在 7℃低溫脅迫下中存在 CBF冷應(yīng)答途徑，即 ICE（inducer of CBF expression）-CBF-COR（Cold-regulated genes）通路。香蕉果實CBF冷應(yīng)答途徑的7個基因表達均在熱處理（52℃，3 min）后0.5 h迅速達到最大值，進一步研究發(fā)現(xiàn)，香蕉果實經(jīng)熱處理后于7℃低溫貯藏5 d時，MaDREB1D、MaDREB1E、MaDREB2C、MaDREB3和MaCOR413的表達均強于對照。【結(jié)論】7℃低溫脅迫下MaICE、DREB類基因、MaCOR413表達依次增強，說明低溫下香蕉果實中存在CBF冷應(yīng)答途徑。CBF冷應(yīng)答途徑相關(guān)基因表達增強可能參與了熱處理誘導(dǎo)采后香蕉果實的抗冷性。

CBF/DREB；香蕉果實；熱處理；抗冷性

0　引言

【研究意義】冷害是熱帶亞熱帶果蔬貯運保鮮中存在的主要問題之一［1］。熱處理是提高果蔬抗冷性的最有效采后處理之一［2］，但熱處理誘導(dǎo)的抗冷機制特別是有關(guān)的信號傳導(dǎo)途徑目前還不太清楚。模式植物上的研究表明，低溫轉(zhuǎn)錄因子CBF/DREB調(diào)控的信號傳導(dǎo)途徑可能是誘導(dǎo)植物抗冷性提高的最重要途徑［3-5］，但是有關(guān) CBF冷應(yīng)答途徑在熱處理誘導(dǎo)抗冷性中的作用目前很少報道。對CBF冷應(yīng)答途徑在熱處理誘導(dǎo)香蕉抗冷性中的作用展開深入研究，將為了解香蕉果實中CBF冷應(yīng)答途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程提供參考。【前人研究進展】模式植物上的研究表明，低溫轉(zhuǎn)錄因子CBF調(diào)控的信號傳導(dǎo)途徑可能是誘導(dǎo)植物抗冷性提高的最重要途徑，即ICE-CBF-COR通路。CBF是該途徑中基因表達的“主開關(guān)”，受ICE調(diào)控的CBF轉(zhuǎn)錄因子能夠特異結(jié)合啟動子中含有CRT/DRE（C-repeat/ dehydration responsive element）的順式元件，可以激活下游一系列冷調(diào)節(jié)基因 COR的表達，從而提高擬南芥等植物的抗寒性［6-8］。高溫和低溫均能誘導(dǎo) CBF冷應(yīng)答途徑相關(guān)基因的表達。4℃低溫誘導(dǎo)了蝴蝶蘭PaCBF1在4 h開始表達，24 h達到最高峰。在擬南芥中過表達PaCBF1，誘導(dǎo)了AtCOR6.6和RD29a表達的增強［9］。桃果實經(jīng)過0℃低溫處理6 h時，PpCBF5表達水平增加約4倍，然后迅速增加至72 h的4 000多倍。PpCBF1和PpCBF6的表達，在0℃下72 h可分別被誘導(dǎo)575倍和6倍［10］。38℃熱處理1 h誘導(dǎo)了黃瓜幼苗CBF1的表達，同時增加了其抗熱性［11］；高溫脅迫誘導(dǎo)了擬南芥中DREB2A蛋白的產(chǎn)生，此蛋白作為一個調(diào)控因子參與擬南芥的熱激脅迫反應(yīng)［12］。高溫和低溫都能誘導(dǎo)新疆野蘋果 MsDREB2C［13］、玉米ZmDREB2A［14］的表達增強。【本研究切入點】筆者前期研究結(jié)果表明，采用52℃熱水處理香蕉果實3 min，能有效減輕香蕉果實的冷害癥狀［15-17］。然而熱水處理是否通過CBF冷應(yīng)答途徑提高香蕉果實的抗冷性，目前尚不清楚。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究香蕉果實在低溫下是否存在CBF冷應(yīng)答途徑，以及CBF冷應(yīng)答途徑中的相關(guān)基因是否參與了熱水處理誘導(dǎo)的香蕉抗冷性。

3.加強供應(yīng)商關(guān)系管理，轉(zhuǎn)變物資儲備方式，改進資源占有方式。供應(yīng)商關(guān)系管理是指運用供應(yīng)鏈管理思想，通過搜尋、考核、評價等方式，對作為企業(yè)重要外部資源的供應(yīng)商分層次建立合作關(guān)系，并對其關(guān)系進行管理和維護的活動。實行供應(yīng)商資格預(yù)審制及供應(yīng)商許可供應(yīng)產(chǎn)品目錄制，將其優(yōu)勢產(chǎn)品列入可供應(yīng)產(chǎn)品目錄。對每個有交易的供應(yīng)商進行動態(tài)量化考核，建立供應(yīng)商動態(tài)量化評價體系。考核得分由整體實力、供應(yīng)量、合同執(zhí)行情況、網(wǎng)上報價率、獎懲等5個部分組成。對考核優(yōu)秀的供應(yīng)商在招投標、付款、供應(yīng)份額上給予傾斜，不斷培養(yǎng)優(yōu)秀的主力供應(yīng)商群體，并逐步與之建立穩(wěn)定的合作關(guān)系。

1　材料與方法

試驗于2015年在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院進行。

1.1材料及處理

香蕉品種為‘巴西’（Musa spp. AAA group cv. Brazil），采自廣州市番禺香蕉園。挑選飽滿度約 7成的綠熟香蕉，運回廣東省果蔬保鮮重點實驗室。挑選大小均勻、無病蟲害及機械損傷的單個香蕉，先后用0.1%漂白粉和0.05%施保功各浸泡5 min，晾干備用。

熱水及低溫貯藏處理：將香蕉果實一次性浸入熱水處理機（體積為400 L）中，溫度為52℃，時間為3 min，熱水處理前后溫度差異在0.5℃以內(nèi)。熱水處理（hot water dipping，HWD）后將香蕉果實放入20℃恒溫箱中貯藏3 h（前期研究表明熱水處理后于20℃恢復(fù)3 h抗冷效果最好［16］），然后置于7℃下貯藏5 d，對照為未經(jīng)過熱水處理，其他貯藏條件一樣。熱處理香蕉100個，對照處理100個，每處理3個重復(fù)。取樣時間點為：20℃下0、0.5、1.5、3 h；7℃下1、4、8、24、48、120 h。每個取樣點10個香蕉，取香蕉中部果皮用液氮冷凍置于-80℃冰箱保存。

［16］ WANG H B，ZHANG Z Q，XU L Y，HUANG X M，PANG X Q. The effect of delay between heat treatment and cold storage on alleviation of chilling injury in banana fruit. Journal of the Science of Food and Agriculture，2012，92: 2624-2629.

1.2.1實時定量引物設(shè)計 從香蕉基因組數(shù)據(jù)庫（http://banana-genome.cirad. fr/）中搜索并挑選 CBF冷信號途徑中的7個相關(guān)基因序列，設(shè)計實時定量引物，驗證后備用。引物序列為：MaICE：5-TTGAGGTCA GGGTAAGAG和3-CTTCCTTGGATTGCTCAG；MaDREB1D：5-CATGGATTTG GGCTTCGGTTAC和3-GTCCACGTCGTCCCAGTTACA；MaDREB1E：5-CGATGAATGAGGAGGACGAGAT和3-CACC AAACTGATGCTGGAGGA；MaDREB1G：5-AACT TCGGAATGCAAGGGTA和3-CCGGTCTCAGATGG AATAGC；MaDREB2：5-GACGAGCACCAGCGA GTCAAG和3-AGAGCGGAATGTCACTGAAAGC；MaDREB3：5-CGAGTTCCTGTACGAAGACCCG和3-AGATGGTGGTGGGAACAACAGTG；MaCOR413：5-CTGACTGGTTGGAGATGC和3-TACCAAGCGCC AGATAGG。

1.2.2實時熒光定量 PCR（qRT-PCR） 實時熒光定量 PCR使用儀器為 BIO-RAD CFX9600，采用TOYOBO THUNDERBIRD SYBR?qPCR Mix 進行Real-time PCR擴增。qRT-PCR反應(yīng)體系（20 μL）包括10 μL SYBR-Green PCR Master Mix，0.25 μL上游（10 μmol·L-1）和0.25 μL下游引物（10 μmol·L-1），2 μL稀釋的cDNA以及7.5 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：95℃ 3 min，95℃ 10 s，59℃ 10 s，72℃ 20 s，循環(huán)數(shù)為40。為了確認產(chǎn)物的質(zhì)量和引物的特異性，在溶解曲線中分析了產(chǎn)物的 Tm（分析溶解溫度為 65—95℃）。利用Actin1［18］作為內(nèi)參基因。所有的qRT-PCR反應(yīng)根據(jù)內(nèi)參基因Actin1進行Ct值校準，目的基因的相對表達水平利用公式2-ΔΔCt進行計算，重復(fù)3次。

1.2.3數(shù)據(jù)處理 用MEGA5.1軟件對氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，采用 Sigmaplot12.5計算標準誤并作圖。

2　結(jié)果

2.1香蕉DREB/CBF基因的系統(tǒng)進化樹分析

李鎮(zhèn)西老師說：“讓人們因我的存在而感到幸福。”學(xué)生及家長群里均是一致為此次自評與他評的活動點贊，有些學(xué)生還說，看了統(tǒng)計數(shù)據(jù)，后悔自己當初寫得還不夠用心，字太丑。因為是寒假，不少學(xué)生都表示這個是比紅包還讓人開心的新年禮物，而且很有紀念意義，特別是某些同學(xué)還很用心地畫了素描或漫畫肖像，溫暖而貼心。不少家長說，原來自己的兒女在同學(xué)、朋友中為人處世還蠻多優(yōu)點，自己平時真的難有機會發(fā)現(xiàn)，感謝老師、同學(xué)們的用心。讓學(xué)生及其家長看了那些用心的自評與他評而感動快樂，我也感受到了班級的幸福指數(shù)直線上升，新年里班級Q群中氛圍輕松愉悅。

從香蕉基因組數(shù)據(jù)庫搜索到5個DREB類基因：MaDREB1D、MaDREB1E、MaDREB1G、MaDREB2C 和MaDREB3。參考SAKUMA［19］、MIZOI［20］等的研究結(jié)果，從擬南芥、水稻等物種選取已克隆的DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列，用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。從圖1可知，MaDREB1E和MaDREB1G屬于 DREB/CBF 轉(zhuǎn)錄因子 A-1亞類，MaDREB1D屬于A-6亞類、MaDREB2C屬于A-3亞類、MaDREB3屬于A-4亞類。

圖1　植物中DREB類基因的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of the DREB subfamily transcription factors in plants

2.2熱激處理及熱激后低溫貯藏對香蕉 MaICE表達的影響

［7］ WU L H，ZHOU M Q，SHEN C，LIANG J，LIN J. Transgenic tobacco plants over expressing cold regulated protein CbCOR15b from Capsella bursa-pastoris exhibit enhanced cold tolerance. Journal of Plant Physiology，2012，169: 1408-1416.

圖2　熱處理和低溫貯藏對香蕉果實MaICE表達的影響Fig.2 Effect of hot water dipping （HWD） and cold storage on the expression of MaICE in banana fruits

2.3熱激處理及熱激后低溫貯藏對香蕉DREB類基因表達的影響

從圖3—圖5可知，未經(jīng)熱處理的香蕉MaDREB1D、MaDREB1E和MaDREB1G這 3個基因表達均在7℃1 h有一個高峰。說明7℃低溫能在1 h內(nèi)快速誘導(dǎo)這3個基因表達的升高。MaDREB1D、MaDREB1E 和MaDREB1G這3個基因表達均在熱處理后0.5 h有一個高峰。在 7℃低溫貯藏過程中，HWD處理的MaDREB1D表達一直高于對照，MaDREB1E表達在4 —24 h高于對照，而MaDREB1G表達與對照差異不大。

《北愛》之后我開始認真學(xué)習(xí)，唯一接的工作是《快樂大本營》。現(xiàn)在回頭看看，那時候整個人都土炸了，穿得很隨便，人又胖，還腦子抽筋地表演了一段東北扭秧歌，用現(xiàn)在的話說就是黑歷史。

圖3　熱處理和低溫貯藏對香蕉果實MaDREB1D表達的影響Fig.3 Effect of HWD and cold storage on the expression of MaDREB1D in banana fruits

從圖6可知，對照的MaDREB2C表達在7℃下4 h后逐漸增強，直至24 h有一個高峰，之后逐漸下降至較低的水平。而HWD處理后的0.5 h，其MaDREB2C表達有一個短暫而迅速的升高，低溫下其MaDREB2C表達變化趨勢與對照一致，并且均高于對照。

從圖7可知，對照的MaDREB3表達在7℃下1 h有一個高峰，而HWD處理后MaDREB3表達在HWD 后0.5 h有一個小高峰，表達比對照稍高。在7℃低溫貯藏過程中，MaDREB3表達在前期低于對照，后期則高于對照。

對于有關(guān)企業(yè)人力資源管理工作的高素質(zhì)人才，要適當進行鼓勵。比如說，對于高效率完成相關(guān)工作的工作人員，要適當給予一定程度上的福利待遇，激勵員工更加努力有效地工作。另外，對于長期處于壓力狀態(tài)下的企業(yè)部門，企業(yè)的人力資源管理部門應(yīng)組織相關(guān)人員進行適當?shù)姆潘伞＠纾梢越M織相關(guān)人員進行內(nèi)部聚餐，或者在工作告一段落之后，組織相關(guān)工作人員出去游玩，放松心情等等，都是企業(yè)人力資源部門應(yīng)該組織開展的有效策略。

圖4　熱處理和低溫貯藏對香蕉果實MaDREB1E表達的影響Fig.4 Effect of HWD and cold storage on the expression of MaDREB1E in banana fruits

圖5　熱處理和低溫貯藏對香蕉果實MaDREB1G表達的影響Fig.5 Effect of HWD and cold storage on the expression of MaDREB1G in banana fruits

2.4熱激處理及熱激處理后低溫貯藏對香蕉MaCOR413表達的影響

［2］ 陸旺金，張昭其，季作梁. 熱帶亞熱帶果蔬低溫貯藏冷害及御冷技術(shù). 植物生理學(xué)通訊，1999，35（2）: 158-163. LU W J，ZHANG Z Q，JI Z L. Chilling injury and approaches to reduce chilling injury of tropical and subtropical fruits and vegetables during low temperature storage. Plant Physiology Communications，1999，35（2）: 158-163. （in Chinese）

圖6　熱處理和低溫貯藏對香蕉果實MaDREB2C表達的影響Fig.6 Effect of HWD and cold storage on the expression of MaDREB2C in banana fruit

圖7　熱處理和低溫貯藏對香蕉果實MaDREB3表達的影響Fig.7 Effect of HWD and cold storage on the expression of MaDREB3 in banana fruit

3　討論

［9］ PENG P H ，LIN C H ，TSAI H W ，LIN T Y. Cold response in Phalaenopsis aphrodite and characterization of PaCBF1 and PaICE1. Plant and Cell Physiology，2014，55（9）: 1623-1635.

圖8　熱處理和低溫貯藏對香蕉果實MaCOR413表達的影響Fig.8 Effect of HWD and cold storage on the expression of MaCOR413 in banana fruit

香蕉果實 MaDREB2C在低溫下的表達模式與其他DREB類基因有所不同。香蕉果實（對照）在7℃低溫脅迫下24 h才出現(xiàn)表達高峰，這與其他DREB類基因均在 7℃低溫 1 h出現(xiàn)表達高峰不同。說明MaDREB2C在香蕉果實低溫貯藏后期產(chǎn)生響應(yīng)。以上結(jié)果表明，7℃低溫脅迫下，MaICE、DREB類基因、MaCOR413表達依次增強，說明低溫下香蕉果實中存在CBF冷應(yīng)答途徑，即ICE-CBF-COR通路。

熱處理是提高采后果實抗冷性的有效手段，筆者前期研究結(jié)果表明，采用 52℃熱水處理香蕉果實 3 min，能有效減輕香蕉果實的冷害癥狀［15-17］。同時，熱處理也能夠誘導(dǎo)CBF冷應(yīng)答途徑相關(guān)基因的表達。例如，40℃高溫處理能誘導(dǎo)馬鈴薯植株中的AtCBF3表達增強，并且發(fā)現(xiàn)在40℃脅迫l h時，葉中AtCBF3表達量最大［27］。將軍菊苣幼苗高溫37℃處理1 h后，葉片和根中CiDREB2A表達量即上升，并一直維持高表達，24 h表達量達到峰值［28］。CAO等［29］利用低溫、高溫和干旱對巨桉處理，對17個EgrDREB1/CBF和6個EgrDREB2研究，發(fā)現(xiàn)高溫能誘導(dǎo)所有基因的表達增強，低溫能誘導(dǎo)16個EgrDREB1/CBF的表達，認為 EgrDREB1/CBF亞家族主要是受低溫誘導(dǎo)，而EgrDREB2主要是對干旱敏感。從本研究中的圖2至圖8可知，香蕉果實經(jīng)過熱處理后，CBF冷應(yīng)答途徑相關(guān)的7個基因表達均在熱處理后的0.5 h有一個短暫而迅速的升高，在3 h恢復(fù)到處理前較低的水平。香蕉果實CBF冷應(yīng)答途徑的7個基因均在熱處理后0.5 h的迅速表達增強，說明香蕉果實CBF冷應(yīng)答途徑的相關(guān)基因能受到熱處理誘導(dǎo)快速表達增強。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，熱激處理后在低溫貯藏時，CBF冷應(yīng)答途徑相關(guān)基因也會受到誘導(dǎo)增強。獼猴桃果實AcCBF在冷藏期間的相對表達量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，表達高峰在貯藏20 d時出現(xiàn)。而利用35℃和45℃熱處理與對照相比顯著提高了 AcCBF的表達峰值［30］。香蕉果實經(jīng)熱處理后于7℃低溫貯藏5 d，發(fā)現(xiàn)MaDREB1D、MaDREB1E、MaDREB2C、MaDREB3 和MaCOR413等基因的表達均強于對照，MaICE表達出現(xiàn)峰值的時間從 1 h（對照）推遲到 8 h，而MaDREB1G表達與對照差異不大。以上研究表明，香蕉果實經(jīng)過熱處理后，7個CBF冷應(yīng)答途徑基因在熱處理后0.5 h的迅速表達增強，可能是作為一個早期信號，誘導(dǎo)了后期CBF冷應(yīng)答途徑相關(guān)基因的進一步表達增強，導(dǎo)致香蕉果實抗冷性增強。這說明熱處理誘導(dǎo)采后香蕉果實的耐冷性可能與 CBF冷應(yīng)答途徑密切相關(guān)。目前有關(guān)熱處理誘導(dǎo)CBF冷應(yīng)答途徑相關(guān)基因表達方面的研究報道很少，熱處理誘導(dǎo)的CBF冷應(yīng)答途徑相關(guān)基因表達提高與植物抗冷性之間的關(guān)系需要進一步研究。

4　結(jié)論

7℃低溫脅迫下，MaICE、DREB類基因、MaCOR413表達依次增強，說明低溫下香蕉果實中可能存在CBF冷應(yīng)答途徑，即ICE-CBF-COR通路。熱激處理能快速誘導(dǎo)CBF冷應(yīng)答途徑相關(guān)基因的表達，并且DREB類基因和MaCOR413在7℃低溫脅迫下表達強于對照。推測CBF冷應(yīng)答途徑相關(guān)基因表達增強可能參與了熱處理誘導(dǎo)采后香蕉果實的抗冷性。

References

［1］ 張昭其，龐學(xué)群. 南方水果貯藏保鮮技術(shù). 南寧: 廣西科學(xué)技術(shù)出版社，2008. ZHANG Z Q，PANG X Q. Technique of Postharvest Handling and Storage of South China Fruits. Nanning: Guangxi Technology Press，2008. （in Chinese）

從圖8可知，對照的MaCOR413表達在7℃下4 h有一個高峰，其他時間的表達量均較低。而HWD的MaCOR413表達在熱處理后0.5 h有一個高峰，在7℃下4 h有一個高峰，整個過程，HWD的MaCOR413表達量均高于對照。

在用Photoshop修圖時，先復(fù)制背景圖層，然后點擊“濾鏡—模糊—動感模糊”，用滑塊調(diào)整模糊程度。我們最高調(diào)到了500像素。接下來添加蒙版，用不透明度15%的黑色筆刷涂抹你想保留的部分，比如這張照片里的碼頭。

［3］ GILMOUR S J，ZARKA D G，STOCKINGER E J，SALAZAR M P，HOUGHTON J M，THOMASHOW M F. Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activators as an early step in cold-induced COR gene expression，Plant Journal，1998，16: 433-442.

我國天然氣生產(chǎn)和供給能力也持續(xù)增強。2017年，我國生產(chǎn)天然氣1480.3億立方米，同比增長8.2%，在全世界天然氣生產(chǎn)國中增速最快。不過，天然氣需求增長更快，爆發(fā)式的增長造成了短期的天然氣供應(yīng)出現(xiàn)了問題。從我國天然氣產(chǎn)量可以看出，國內(nèi)天然氣正處于很輝煌的發(fā)展時期，但現(xiàn)階段供應(yīng)主要體現(xiàn)在進口方面。2017年，我國天然氣進口量快速增長至946億立方米，占天然氣消費的40%。

［4］ NAKAMURA J，YUASA T，HUONG T T，HARANO K，TANAKA S，IWATA T，PHAN T，IWAYA-INOUE M. Rice homologs of inducer of CBF expression （OsICE） are involved in cold acclimation. Plant Biotechnology，2011，28（3）: 303-309.

［11］ TALANOVA V V，TITOV A F，TOPCHIEVA L V，MALYSHEVA I E. Effect of stress factors on expression of the gene encoding a CBF transcription factor in cucumber plants. Doklady Biological Sciences，2008，423: 419-421.

［6］ CHEN Y，CHEN Z L，KANG J Q，KANG D M，GU H Y，QIN G J. AtMYB14 regulates cold tolerance in Arabidopsis. Plant Molecular Bbiology Reporter，2013，31: 87-97.

前期研究表明，7℃（冷害溫度）下，香蕉果實在第5天已經(jīng)出現(xiàn)明顯的冷害癥狀，利用52℃熱水處理（HWD）3 min能有效提高香蕉果實在7℃低溫貯藏中的抗冷性［16-17］。香蕉用 52℃熱水處理（HWD）3 min ，然后在20℃下放置3 h后置于7℃下貯藏5 d。從圖2可知，未經(jīng)熱處理的香蕉（對照）MaICE表達在7℃處理1 h時迅速升高達到最大值，之后又迅速降低為低溫前的水平。香蕉經(jīng)熱處理后的0.5 h，其MaICE表達迅速升高，之后又下降到對照水平，7℃低溫貯藏下8 h有一個高峰。說明香蕉MaICE在20℃下表達量很低，7℃低溫能在1 h內(nèi)快速誘導(dǎo)MaICE表達的升高。熱處理能在0.5 h內(nèi)快速誘導(dǎo)MaICE表達的升高，而7℃低溫下出現(xiàn)高峰的時間從1 h推遲到8 h。

［8］ HADI F，GILPIN M，F(xiàn)ULLER M P. Identification and expression analysis of CBF/DREB1 and COR15 genes in mutants of Brassica oleracea var. botrytis with enhanced praline production and frost resistance. Plant Physiology and Biochemistry，2011，49: 1323-1332.

多個植物物種中的研究表明，低溫轉(zhuǎn)錄因子CBF調(diào)控的信號傳導(dǎo)途徑可能是誘導(dǎo)植物抗冷性提高的最重要途徑。DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子是AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族中的1個亞家族，含有1個保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域。擬南芥基因組DREB/CBF亞族又分為6個亞類（A1—A6）［19］。DREB1/CBF類主要受到低溫誘導(dǎo)，DREB2類主要受到干旱和高鹽誘導(dǎo)，而對于A3—A6目前研究較少。從圖1的系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)香蕉的5個DREB基因?qū)儆诓煌膩嗩悺１姸嘌芯孔C實，CBF/DREB類基因在多種高等植物低溫下的表達模式均是在低溫下短時間內(nèi)快速誘導(dǎo)增強，最終通過誘導(dǎo)COR表達增強從而提高植物的抗冷性。例如，擬南芥2.5℃低溫15 min即可誘導(dǎo)AtCBF1、AtCBF2和AtCBF3的表達，2 h后達到表達高峰，隨后下降，同時在低溫2 h后COR開始被誘導(dǎo)表達［21-22］。過量表達CBF1或CBF3可促進 COR高水平表達，使轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗冷性提高［23］。寬葉獨行菜LICBF在4℃低溫脅迫下1 h的表達迅速增強，之后4—48 h逐漸降低至低溫處理前的水平［24］。本研究結(jié)果表明，香蕉果實（對照）的MaICE表達在7℃處理1 h時迅速升高達到最大值，DREB類基因（MaDREB1D、MaDREB1E、MaDREB1G、和MaDREB3）表達在7℃處理1 h均存在一個高峰，隨后MaCOR413表達在7℃下4 h出現(xiàn)一個高峰。其中MaDREB1D的表達模式與其他DREB有所不同，除了在1 h有一個高峰，MaDREB1D在120 h（冷害癥狀明顯）時還出現(xiàn)一個表達最高峰。采后香蕉果實在低溫脅迫下的 CBF冷應(yīng)答基因表達模式與擬南芥類等植物類似，進一步驗證了CBF冷應(yīng)答途徑在高等植物中保守性很高。將CBF冷應(yīng)答途徑基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，均提高了擬南芥的抗冷性。例如，ZHUANG等［25］將具有抗冷性草地早熟禾中的PpCBF3轉(zhuǎn)化至擬南芥幼苗中，通過瞬時表達，發(fā)現(xiàn)4℃下0.5 h，PpCBF3表達開始增強，在1 h迅速最高峰，之后3—24 h迅速下降至較低的水平。進一步研究發(fā)現(xiàn)，4℃低溫能誘導(dǎo)野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥COR15a、COR6.6、COR47和COR78的表達，且轉(zhuǎn)基因擬南芥中這些COR的表達高于野生型擬南芥。類似地，將中國野生葡萄中的VaICE1/2在擬南芥中過表達，增強了下游基因CBF1、COR15A和COR47的表達，提高了擬南芥的抗冷性［26］。

［10］ LIANG L，ZHANG B，YIN X R，XU C J，SUN C D，CHEN K S. Differential expression of the CBF gene family during postharvest cold storage and subsequent shelf-life of peach fruit. Plant Molecular Biology Reporter，2013，31（6）: 1358-1367.

月季(Rosa chinensis Jacq.)是薔薇科薔薇屬植物，原產(chǎn)于我國，在我國有 2000 多年的栽培歷史[1]。由于其極強的觀賞性和適應(yīng)性，廣泛應(yīng)用于園林綠化中，成為我國北方城市北京、天津等多個城市市花，建立了多處月季品種齊全、集中的專類公園。

不同施工方法沿地鐵區(qū)間隧道方向地表沉降曲線見圖8，臺階法施工引起地表變形量為最大，達到18.5 mm，施工引起的地表沉降越靠近高鐵盾構(gòu)隧道會越小，超過高鐵盾構(gòu)隧道中心截面距離30 m以外時變形基本趨于一致。

［5］ ZHANG X，F(xiàn)OWLER S G，CHENG H，LOU Y，RHEE S Y，STOCKINGER E J，THOMASHOW M F. Freezing-sensitive tomato has a functional CBF cold response pathway，but a CBF regulon that differs from that of freezing-tolerant Arabidopsis. Plant Journal，2004，39（6）: 905-919.

［12］ SCHRAMM F，LARKINDALE J， KIEHLMANN E，GANGULI A，ENGLICH G，VIERLING E，KOSKULL-D?RING P V. A cascade of transcription factor DREB2A and heat stress transcription factor HsfA3 regulates the heat stress response of Arabidopsis. Plant Journal，2008，53（2）: 264-274.

中國傳統(tǒng)文化與醫(yī)學(xué)生的思想政治教育相融合，能有效提高醫(yī)學(xué)生的意識自主性，能讓醫(yī)學(xué)生在接收醫(yī)學(xué)知識的基礎(chǔ)上，加深對生命意義的理解，從而使其不斷提高自我品行修養(yǎng)。

［13］ ZHAO K，SHEN X J，YUAN H Z，LIU Y，LIAO X，WANG Q，LIU L L，LI F，LI T H. Isolation and characterization of dehydrationresponsive element-binding factor 2C （MsDREB2C） from Malus sieversii Rome. Plant and Cell Physiology，2013，54（9）: 1415-1430.

［14］ QIN F，KAKIMOTO M，SAKUMA Y，MARUYAMA K，OSAKABE Y，TRAN L S，SHINOZAKI K，YAMAGUCHISHINOZAKI K. Regulation and functional analysis of ZmDREB2A in response to drought and heat stresses in Zea mays L. Plant Journal，2007，50（ 1）: 54-69.

［15］ WANG H B，ZHANG Z Q，HUANG X M，JIANG Y M，PANG X Q. Hot water dipping induced chilling resistance of harvested banana fruit. Acta Horticulturae，2008，804: 513-522.

1.2測定方法

至臻天文臺認證由瑞士聯(lián)邦計量研究院 (METAS)核準，其精準程度毋庸置疑。只有具備卓越精準度和防磁性能的腕表，才能獲得至臻天文臺認證。

［17］ 王海波，龐學(xué)群，黃雪梅，張昭其. 活性氧在熱處理誘導(dǎo)香蕉耐冷性中的作用. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（5）: 936-942. WANG H B，PANG X Q，HUANG X M，ZHANG Z Q. The role of reactive oxygen species in heat treatment-induced chilling tolerance in banana fruit. Scientia Agricultura Sinica，2012，45（5）: 936-942. （in Chinese）

［18］ CHEN L，ZHONG H Y，KUANG J F，LI J G，LU W J，CHEN J Y. Validation of reference genes for RT-qPCR studies of gene expression in banana fruit under different experimental conditions. Planta，2011，234（2）: 377-390.

［19］ SAKUMA Y，LIU Q，DUBOUZET J G，ABE H，SHINOZAKI K，YAMAGUCHI-SHINOZAKI K. DNA-binding specificity of the ERF /AP2 domain of Arabidopsis DREBs transcription factors involved in dehydration and co1d-induciblegene expression. Biochemical and Biophysical Research Communications，2002，290（3）: 998-1009.

［20］ MIZOI J，SHINOZAKI K，YAMAGUCHI-SHINOZAKI K. AP2/ERF family transcription factors in plant abiotic stress responses. Biochimica et Biophysica Acta，2012，1819（2）: 86-96.

［21］ STOCKINGER E J，GILMOUR S J，THOMASHOW M F. Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator that binds to the C-repeat/DRE，a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1997，94: 1035-1040.

［22］ ZARKA D G，VOGET J T，COOK D AND THOMASHOW，M F. Cold induction of Arabidopsis CBF genes involves multiple ICE （inducer of CBF expression） promoter elements and a cold-regulatory circuit that is desensitized by low temperature. Plant Physiology，2003，133: 910-918.

［23］ LIU Q，KASUGA M，SAKUMA Y，ABE H，MIURA S，YAMAGUCHI-SHINOZAKI K，SHINOZAKI K. Two transcription factors，DREB1 and DREB2，with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought and low temperature responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis. Plant Cell，1998，10: 1391-1406.

［24］ AKHTAR M，JAISWAL A，JAISWAL J P，QURESHI M I，TUFCHIM，SINGH N K. Cloning and characterization of cold，salt and drought inducible C-repeat binding factor gene from a highly cold adapted ecotype of Lepidium latifolium L. Physiology and Molecular Biology of Plants，2013，19（2）: 221-230.

［25］ ZHUANG L L， YUAN X Y，CHEN Y，XU B，YANG Z M，HUANG B R. PpCBF3 from Cold-Tolerant kentucky bluegrass involved in freezing tolerance associated with up-regulation of cold-related genes in transgenic Arabidopsis thaliana. PLoS One，2015，10（7）: e0132928.

［26］ XU W R，JIAO Y T，LI R M，ZHANG N B，XIAO D M，DING X L，WANG Z P. Chinese wild-growing Vitis amurensis ICE1 and ICE2 encode MYC-type bHLH transcription activators that regulate cold tolerance in Arabidopsis. PLoS One，2014，9（7）: e102303.

［27］ DOU H O，XV K P，MENG Q W，LI G，YANG X H. Potato plants ectopically expressing Arabidopsis thaliana CBF3 exhibit enhanced tolerance to high-temperature stress. Plant Cell Environ，2015，38（1）: 61-72.

［28］ 趙龍. 將軍菊苣 DREB家族基因的克隆、功能研究及其遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立［D］. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013. ZHAO L. Isolation and characterization of the dreb transcription factor from commander chicory and establishment of genetic transformation system of commander chicory ［D］. Nanjing: Nanjing Agricultural University，2013. （in Chinese）

巷道周邊破裂圍巖在支護過程中，錨桿、錨索預(yù)緊力或支架提供的初撐力提高了圍壓。為了研究圍壓增量對巖石峰后蠕變的影響，對HS7-1與HS7-2進行了施加1MPa圍壓增量后的峰后蠕變試驗，并與施加圍壓增量前的HS6-1與HS6-2作對比分析。HS7-1與HS7-2試驗特征參數(shù)見表2，施加圍壓增量前后分別加載峰后蠕變曲線如圖7所示。從圖7可以看出，施加圍壓增量后，各級應(yīng)力水平下蠕變變形速率明顯減小，等速蠕變階段延長，最后一級應(yīng)力水平下進入加速蠕變階段時間延后。在各級應(yīng)力水平下的蠕變量上，依據(jù)試驗數(shù)據(jù)擬合了應(yīng)力水平-蠕變量的關(guān)系曲線見圖8。

醫(yī)養(yǎng)結(jié)合下的社區(qū)養(yǎng)老設(shè)施體系涵蓋了社區(qū)居家養(yǎng)老設(shè)施與機構(gòu)養(yǎng)老設(shè)施所包含的各類設(shè)施．本文研究社區(qū)層面的養(yǎng)老設(shè)施體系構(gòu)建,結(jié)合目前居住區(qū)分級、老年人自身的特點以及需要、養(yǎng)老設(shè)施建設(shè)利用的效率綜合考慮層級劃分．

［29］ CAO P B，AZAR S ，SANCLEMENTE H，MOUNET F，DUNAND C，MARQUE G ，MARQUE C，TEULIèRES C. Genome-wide analysis of the AP2/ERF family in Eucalyptus grandis: an intriguing overrepresentation of stress-responsive DREB1/CBF genes. PLoS One，2015，10（4）: e0121041.

完善統(tǒng)一的法律法規(guī)體系，既是公共部門的行為“標尺”，也是私人部門的利益“保護網(wǎng)”。PPP模式下的城市社區(qū)居家養(yǎng)老服務(wù)項目是公共部門和私人部門的共有產(chǎn)權(quán)，兩者利益共享、風(fēng)險共擔(dān)，任何一方的失信或失責(zé)都會給整個項目的運營造成極大的損害。公私部門雙方應(yīng)明確各自的職責(zé)與定位，公共部門做好土地、政策、補貼等工作，私人部門投入資金、技術(shù)和管理等。因此，需要一整套統(tǒng)一完善的法律法規(guī)體系，以法律來明確雙方的權(quán)責(zé)關(guān)系，保證項目運營的協(xié)調(diào)性，以法規(guī)規(guī)章來統(tǒng)一標準、規(guī)范程序，保證項目運營的規(guī)范性。

［30］ MA Q S，SUO J T，HUBER D J，DONG X Q，HAN Y，ZHANG Z K，RAO J P. Effect of hot water treatments on chilling injury and expression of a new C-repeat binding factor （CBF） in ‘Hongyang’kiwifruit during low temperature storage. Postharvest Biology and Technology，2014，97: 102-110.

（責(zé)任編輯 趙伶俐）

The Role of CBF Cold Response Pathway Gene in Heat Treatment-Induced Chilling Tolerance in Banana Fruits

WANG Hai-bo1，LI Lu2，SU Xin-guo1，ZHANG Zhao-qi3，PANG Xue-qun2
（1Guangdong Food and Drug Vocational College，Guangzhou 510520；2College of Biotechnology，South China Agricultural University，Guangzhou 510642；3College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642）

【Objective】The objective of this study is to investigate the role of C-repeat binding transcription factor （CBF）cold-resistance pathway in heat treatment -induced chilling tolerance in banana fruits and to provide reference for the study of the signal transduction of CBF cold response pathway in banana fruits.【Method】The sequences of 7 genes related to CBF cold response pathway were selected from the banana genome database （http://banana-genome-hub.southgreen.fr/），and then specific primers were designed respectively. Analysis of these 7 genes’ expression patterns of the heat-induced chilling tolerance in banana fruits was conducted using quantitative real-time PCR.【Result】The expression of MaICE gene of banana fruit increased rapidly and reached the maximum level at 7℃ for 1 hour. The expression of DREB （MaDREB1D，MaDREB1E，MaDREB1G and MaDREB3） genes displayed a peak at 7℃ for 1 hour. The expression of MaCOR413 gene had a peak at 7℃ for 4 hours. These results indicated that the CBF cold response pathway （ICE-CBF-COR pathway） exist in banana fruit during cold storage at 7℃. The expression of 7 gene related to CBF cold response pathway reached the maximum levels at 0.5 hour after heat treatment（52℃ 3 min）. Furthermore，when the heat treated banana fruits storage at 7℃ for 5 days，the expressions of MaDREB1D，MaDREB1E，MaDREB2C，MaDREB3 and MaCOR413 genes were higher than the non-heated control.【Conclusion】 MaICE，DREB，and MaCOR413 increased in turn when banana fruits stored at 7℃. The CBF cold response pathway exist in banana fruits during cold storage at 7℃. Enhancement of gene expression related to CBF cold response pathway may be involved in chilling tolerance induced by heat treatment in banana fruits.

CBF/DREB； banana fruit； heat treatment； chilling tolerance

2016-03-14；接受日期：2016-05-25

國家自然科學(xué)基金（31301584）、廣東省自然科學(xué)基金（S2013010013987）、廣東省高校優(yōu)秀青年教師項目（2014）、廣東省科技計劃項目（2012A020100007）、國家科技支撐計劃（2015BAD16B07）

聯(lián)系方式：王海波，Tel：020-29164658；E-mail：haibovip@126.com。通信作者龐學(xué)群，Tel：020-85283413；E-mail：xqpang@scau.edu.cn