鴨瘟病毒單抗的制備及膠體金試紙條檢測方法的建立

趙丹丹，楊國平，刁有祥，陳 浩，提金鳳，張 璐，張 英，李川川

（山東農業大學動物科技學院，山東泰安 271000）

鴨瘟病毒單抗的制備及膠體金試紙條檢測方法的建立

趙丹丹，楊國平，刁有祥，陳 浩，提金鳳，張 璐，張 英，李川川

（山東農業大學動物科技學院，山東泰安 271000）

【目的】鴨瘟（DP）是由鴨瘟病毒（DPV）引起的一種急性、敗血性傳染病，以頭頸腫脹、食道黏膜和泄殖腔黏膜出血、黃白色潰瘍，頭頸部皮下有黃白色膠凍樣滲出為特征。該病一旦發生，發病急、死亡快、死亡率高，對養鴨業危害嚴重。快速診斷是控制鴨瘟的重要措施之一，可以及時確定病原，以便采取有效的防制手段。試驗旨在建立鴨瘟病毒（DPV）膠體金快速檢測方法。【方法】利用生物學軟件Protean分析，選擇鴨瘟病毒抗原表位較多的一段序列設計引物，PCR擴增目的基因。連接到載體pMD-18T上，測序正確后再連接到原核表達載體pET-28a上。將獲得的重組質粒轉化至Rosetta感受態細胞中進行誘導表達。表達的蛋白經純化后測其濃度并經Western blotting鑒定分析。以表達的DPV-gB蛋白作為抗原，免疫7周齡BALB/c小鼠，取其脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，經間接ELISA篩選及亞克隆，獲得DPV-gB特異性單克隆抗體。采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，以制備的 H6F6單抗作為標記抗體（標記的最適pH為8.0—8.5，最佳標記濃度為15倍原液稀釋），將純化的A8D7單抗（濃度為2倍原液稀釋）和羊抗鼠IgG（濃度為10倍稀釋）包被在硝酸纖維素膜（NC）上，分別作為檢測線和質控線，經條件優化建立了鴨瘟病毒膠體金試紙條檢測方法。【結果】共獲得4株能穩定分泌抗DPV-gB蛋白抗體的雜交瘤細胞株，命名為A8D7、E6C3、H11F8、H6F6。間接ELISA檢測腹水效價分別為1∶103、1∶103、1∶105、1∶103。亞類鑒定結果分別為IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG1，輕鏈均為kappa鏈。Western blotting結果顯示4株單抗均能與DPV-gB蛋白特異性結合。IFA結果顯示制備的4株單抗是針對DPV產生的。建立的膠體金試紙條方法能夠特異性地檢測鴨瘟病毒，與鴨坦布蘇病毒、H9N2亞型禽流感病毒、呼腸孤病毒、減蛋綜合征病毒無反應。陽性尿囊液稀釋50倍后用該試紙條檢測依然為陽性；用不同批次的試紙條重復檢測，結果無差異。利用制備的膠體金試紙條和PCR方法對38份臨床樣品進行檢測比較，結果顯示兩者符合率為91.6 % 。【結論】本研究建立的試紙條檢測方法具有良好的特異性、敏感性、重復性和穩定性，可用于DPV的快速檢測。

鴨瘟病毒；gB蛋白；原核表達；單克隆抗體；膠體金試紙條

0　引言

【研究意義】鴨瘟（duck plague，DP）是由鴨瘟病毒（duck plague virus，DPV）引起的一種急性、敗血性傳染病［1］，以頭頸腫脹、食道黏膜和泄殖腔黏膜出血、頭頸部皮下有淡黃色膠凍樣滲出為特征。該病一旦發生，發病急、死亡快、死亡率高，對養鴨業危害嚴重。快速診斷是控制鴨瘟的重要措施之一，可以及時確定病原，以便采取有效防制手段。【前人研究進展】目前已建立了PCR、ELISA、間接免疫熒光技術、微量中和試驗等檢測鴨瘟的方法［2］，但上述檢測方法均需特殊的儀器設備，且耗時長，不適于在基層推廣應用。膠體金免疫層析技術是近年來發展起來的集膠體金標記技術、蛋白層析技術于一體的新型快速免疫檢測技術［3-4］。該技術操作簡便、耗時短，不需要特殊的儀器設備［5-6］，特別適合在基層推廣應用［7-8］。【本研究切入點】鴨瘟對養鴨業危害嚴重，目前已建立了PCR、ELISA、間接免疫熒光技術、微量中和試驗等檢測鴨瘟的方法，但上述檢測方法均需特殊的儀器設備，且耗時長，不適于在基層推廣應用。膠體金免疫層析技術是近年來發展起來的集膠體金標記技術、蛋白層析技術于一體的新型快速免疫檢測技術。該技術操作簡便、耗時短，不需要特殊的儀器設備，特別適合在基層推廣應用。且目前關于鴨瘟病毒膠體金試紙條檢測方法的研究尚未見報道，本研究意義較大。【擬解決的關鍵問題】原核表達DPV-gB蛋白，制備抗DPV-gB蛋白單克隆抗體，從中選取2株單抗分別用于膠體金的標記及檢測線的包被，采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，建立鴨瘟病毒膠體金試紙條檢測方法。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1毒株、細胞株和試驗動物 鴨瘟病毒（SD-Y）、鴨呼腸孤病毒（DRV）、減蛋綜合征病毒（EDS-76V）、H9亞型禽流感病毒（AIV-H9N2）、坦布蘇病毒（TMUV）由山東農業大學禽病學研究室分離并保存。SP2/0骨髓瘤細胞由山東農業大學禽病學研究室保存；6～8周齡SPF級BALB/c雌性小鼠購自山東省實驗動物中心。

1.1.2主要試劑 原核表達載體 pET-28a、大腸桿菌DH5α和Rosetta由山東農業大學禽病學研究室保存；DNA 凝膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶、IPTG、pMD18-T 載體等購自寶生物工程（大連）有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT、HT、PEG4000購自Sigma公司；HRP標記的羊抗鼠IgG、HRP標記的羊抗鴨IgG、FITC標記的羊抗鼠IgG、DMEM培養基、胎牛血清購自全式金生物技術（北京）有限公司；Rapid Mouse Isotyping Kit-Gold Series購 自RayBiotech；氯金酸（HAuCl4·3H2O）、二氯二甲基硅烷、正辛酸購自Aladdin公司；牛血清白蛋白（BSA）購自北京索萊寶科技有限公司；膠體金卡式套裝系列購自上海杰一生物技術有限公司；超敏性辣根過氧化物酶 DAB顯色試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司。其他試劑均為分析純。

1.1.3試驗時間與地點 2012年10月至2015年3月在山東農業大學禽病學研究室完成。

1.2DPV-gB蛋白的制備及純化

根據GenBank發表的DPV gB基因序列，設計一對引物，上游為gB-f ：5′-CCGGAATTCTGGGATTG GATGCCTAA-3′，含有EcoR1酶切位點；下游為gB-r：5′-CCGCTCGAGTATTGTACCGCCGTCTTT-3′，含有XhoL1酶切位點，PCR擴增gB，回收目的基因，將其連接到 pMD-18T載體上，鑒定正確后再經雙酶切、與pET-28a載體連接，構建重組質粒pET-28a-gB。

將重組質粒pET-28a-gB轉化入Rosetta感受態細胞，加入IPTG誘導表達gB蛋白。按文獻［9］介紹的方法純化表達的蛋白，并進行SDS-PAGE及Western blotting分析。

1.3DPV-gB蛋白單抗的制備

按照常規方法進行動物免疫［10］。三免后14 d，尾靜脈采血，間接ELISA測定血清效價。選擇效價最高的小鼠進行加強免疫，采用gB蛋白腹腔注射，80 μg/只。注射后第3天，進行細胞融合。

按照常規方法進行細胞融合［11］。采用間接ELISA對雜交瘤細胞上清進行篩選。陽性孔再經過3次有限稀釋法進行亞克隆［12］，待陽性率達到 100%時擴大培養，用于制備腹水，并保存于液氮。參照文獻［13］進行腹水的制備，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，離心取上清。

1.4單抗的鑒定

1.4.1單抗的純化及亞類的鑒定 將制備的腹水從1∶100開始做倍比稀釋，采用間接ELISA方法檢測腹水效價。利用HiTrapTMProtein G 親和層析柱純化腹水，進行SDS-PAGE電泳分析；同時利用紫外分光光度法測定 260 nm和 280 nm的吸光值 A260和A280，按照蛋白質濃度=1.45×A280-0.74×A260公式計算抗體濃度。

按照Rapid Mouse Isotyping Kit-Gold Series說明書對單抗的亞類進行鑒定。

1.4.2Western blotting 鑒定 將純化的 gB蛋白和含 pET28a 空質粒的菌體蛋白進行 SDS-PAGE 電泳后，轉印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂乳封閉過夜，以陽性單克隆細胞上清為一抗，二抗為 HRP 標記的羊抗鼠IgG（1∶5 000稀釋），DAB 試劑盒顯色，進行Western blotting鑒定［14］。

1.4.3間接免疫熒光（IFA）鑒定 按照常規方法［15］制備鴨胚成纖維細胞（DEF），傳代后將其轉到24孔細胞培養板上繼續培養。待細胞長成單層，且面積為底部面積的70 %—80 %時，用DPV感染DEF細胞，同時設空白對照。待出現細胞病變后，用丙酮與甲醇按照1∶1的體積比進行固定，以鑒定為陽性的雜交瘤細胞上清為一抗，二抗為FITC標記的羊抗鼠IgG抗體（1∶200稀釋），熒光顯微鏡下觀察結果。

1.4.4單抗的特異性 分別用 DPV、TMUV、AIVH9N2、EDS-76V、DRV作為抗原包被酶標板，一抗為雜交瘤細胞上清液，二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG （1∶5 000稀釋），利用間接ELISA方法檢測單克隆抗體細胞上清。

1.4.5單抗的穩定性 在雜交瘤細胞凍存3個月、6個月時，取出凍存的細胞進行復蘇，并對細胞培養上清進行間接ELISA檢測，以檢測陽性雜交瘤細胞的穩定性。

1.5膠體金試紙條的研制

1.5.1標記條件的確定 利用棋盤法［16-17］將溶液的pH分別調為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0，以確定膠體金標記抗體的最適pH；用0.01 mol·L-1PB （pH 7.0）將單抗按照1 mL膠體金標記抗體的量分別為30、35、40、45、50、55和60 μg，以確定抗體最適標記量。

1.5.2膠體金探針的制備 采用檸檬酸三鈉還原法［18-19］制備粒徑約為30 nm的膠體金顆粒，以制備的一株單克隆抗體H6F6標記膠體金，采用差速離心法［20］對膠體金探針進行純化。

1.5.3試紙條的組裝 將制備的另一株單克隆抗體A8D7和羊抗鼠IgG包被于硝酸纖維素膜（NC膜）上，分別作為檢測線和質控線，按照膠體金試紙條常規構造，在PVC底板上按照NC膜、金標墊、樣品墊和吸水墊的順序粘貼［21］，組裝試紙條，優化反應條件，于4℃保存備用。

1.6試紙條性能的評價

1.6.1特異性試驗 用制備的膠體金試紙條分別檢測DPV、TMUV、AIV- H9N2、EDS-76V、DRV，觀察是否出現交叉反應。

1.6.2敏感性試驗 將半數致死量為 10-4.33的 DPV陽性尿囊液分別按照1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶500稀釋，觀察試紙條檢測結果。

1.6.3重復性試驗 用前后制備的 3個批次的試紙條對陽性鴨瘟病毒尿囊液進行檢測，驗證試紙條檢測結果的重復性。

1.6.4穩定性試驗 每隔一個月用保存的試紙條對陽性鴨瘟病毒尿囊液進行檢測，觀察其檢測結果是否穩定。

1.6.5試紙條的初步應用 對實驗室保存的24份疑似感染鴨瘟病毒的臨床樣品和 14份陽性尿囊液分別進行試紙條和PCR檢測，驗證二者的符合率。

2　結果

2.1DPV-gB蛋白單抗的制備

2.1.1重組質粒的構建及鑒定 PCR擴增gB基因后進行凝膠電泳，結果顯示，在915 bp處可見到特異性條帶（圖1）。

圖1　重組表達載體的PCR鑒定Fig.1 The PCR identification of recombinant expression vector

2.1.2gB蛋白的純化與鑒定 將表達及純化后的蛋白經 SDS-PAGE 電泳后，轉印到NC膜上，用鴨瘟陽性血清進行 Western blotting 鑒定。結果顯示，表達的蛋白在約34kD處可見特異性條帶，而菌體蛋白無條帶（圖2）。

圖2　誘導表達DPV-gB蛋白SDS-PAGE及Western blotting分析Fig.2 SDS-PAGE（A）and Western blotting（B）analysis of DPV-gB protein

2.1.3陽性雜交瘤細胞的篩選 細胞融合后觀察，細胞融合率達90%以上，經間接ELISA檢測及有限稀釋法克隆至陽性率達100%，共獲得4株穩定分泌抗gB蛋白的雜交瘤細胞株，分別命名為 A8D7，E6C3，H11F8，H6F6。

2.1.4單抗效價的測定 間接ELISA方法測定腹水的效價分別為 A8D7（1∶103）、E6C3（1∶103）、H11F8（1∶105）、H6F6（1∶103）。

2.1.5單抗的純化及濃度測定 利用 HiTrapTMProtein G 親和層析柱對準備試驗的兩株腹水進行純化，SDS-PAGE蛋白質電泳結果顯示，純化的單抗有兩條明顯的重鏈和輕鏈，效果較好（圖3）。

同時，利用紫外分光光度法計算4株單抗的濃度分別為：A8D7（2.0 mg·mL-1）、E6C3（1.8 mg·mL-1）、H11F8（1.65 mg·mL-1）、H6F6（1.93 mg·mL-1）

2.1.6單抗亞類的鑒定 獲得的 4株單抗經亞類鑒定分別為：A8D7（IgG2b）、E6C3（IgG2a）、H11F8（IgG2b）、H6F6（IgG1），輕鏈均為kappa鏈。

圖3　單抗的純化Fig.3 Purification of monoclonal antibodies

2.1.7Western blotting 鑒定 4株單抗均可特異性識別gB蛋白，在約34kD處出現特異性條帶，而不與含空質粒表達的菌體蛋白反應（圖4）。

圖4　4株單抗的Western blotting 分析Fig.4 Western blotting analysis of four monoclonal antibodies

2.1.8IFA鑒定結果 DPV感染DEF細胞，出現病變后，對4株單抗進行IFA檢測，結果顯示，4株單抗均可顯現特異性的綠色熒光，未感染的細胞未顯現綠色熒光（圖5）。

圖5　單抗與感染的DPV的DEF細胞的IFA試驗Fig.5 The indirect immunofluorescence assay of DPV in DEF cells with the four monoclonal antibodies

2.1.9單抗的特異性 利用間接 ELISA方法用DPV、TMUV、AIV- H9N2、EDS-76V、DRV對雜交瘤細胞上清進行檢測。結果表明，本試驗制備的單抗僅與DPV反應，與TMUV、AIV- H9N2、EDS-76V、DRV不發生反應。

2.1.10單抗的穩定性 在雜交瘤細胞凍存后 3個月，6個月時，取出凍存的細胞進行復蘇，并對細胞培養上清進行間接ELISA檢測。結果表明，凍存后的雜交瘤細胞仍能穩定的分泌抗體。

2.2膠體金試紙條的制備

2.2.1膠體金溶液的制備 制備的膠體金溶液肉眼觀察為酒紅色或偏紫紅色，液面上無油狀物質。在日光下觀察，溶液為均勻的介質，顏色清亮，靜置后底部無雜質，無死金現象。

2.2.2膠體金標記條件的確定 當pH為8.0—8.5、1 mL膠體金溶液中單抗標記量為50 μg時，膠體金溶液穩定，保持紅色不變。由此確定膠體金標記單抗的最適pH為8.0—8.5，單抗的最佳標記量為50 μg·mL-1。

2.3試紙條性能的評價

2.3.1特異性試驗 用膠體金試紙條分別檢測DPV、TMUV、AIV- H9N2、EDS-76V、DRV，該試紙條僅與DPV反應，與其他病毒不發生反應（圖6）。

圖6　特異性檢測Fig.6 Detection of specificity

2.3.2敏感性試驗 敏感性試驗結果顯示，半數致死量為10-4.33的DPV陽性尿囊液稀釋50倍后仍能用試紙條檢測出來（圖7）。

圖7　敏感性檢測Fig.7 Detection of sensitivity

2.3.3重復性試驗 用不同批次的試紙條對DPV尿囊液進行檢測，結果無明顯差異，表明該試紙條具有較好的重復性。

2.3.4穩定性試驗 穩定性試驗結果顯示，研制的試紙條4℃保存5個月、室溫下保存3個月后依然有效。

2.3.5試紙條的初步應用 用制備的膠體金免疫層析試紙條對實驗室保存的 24份疑似感染鴨瘟病毒的臨床樣品和14份陽性尿囊液進行檢測，同時做PCR對照檢測，檢測結果表明，其中21份臨床樣品及12份尿囊液可在1—5min內得出檢測結果；PCR可檢測出22份臨床樣品及14份尿囊液（表1）；二者符合率為91.6 %，適用于DPV的快速檢測與篩選。

表1　比較試驗結果Table 1 Comparative experiment of the result

3　討論

3.1gB蛋白是鴨瘟病毒最為保守的囊膜蛋白之一，在促進病毒吸附細胞及在細胞間的擴散，誘導機體產生中和抗體，介導體液免疫和細胞免疫應答等方面發揮重要作用，具有良好的免疫原性及免疫保護性［22］。本研究采用原核表達系統Rosetta E. coli，表達了鴨瘟病毒 gB蛋白，原核表達系統相對于真核表達系統具有成本低、操作簡便、表達量高等優點，省去了傳統方法中的繁瑣步驟，可大大節省時間。單克隆抗體具有高度均一、生物活性單一和與抗原結合特異性強等優點［23］，可以為建立更加快速、特異性強的檢測方法提供有利的工具。本研究利用表達的 gB蛋白免疫小鼠制備的單抗，檢測結果顯示，僅與鴨瘟病毒反應，而與其他病毒不發生反應，表明制備的單抗具有較高的特異性。

3.2多種因素會影響膠體金標記的效果，如膠體金顆粒的大小、標記蛋白的濃度、溶液的 pH值以及所用容器的純凈程度等［24-25］。膠體金顆粒的大小與制備膠體金反應的時間及所用容器的潔凈度有較大關系。反應時間小于5 min時，氯金酸還原不徹底，膠體金顆粒大小不一；反應時間超過 10 min時，膠體金溶液容易形成大的顆粒甚至沉淀。同時，進入膠體金溶液內的污物都會干擾膠體金顆粒的生成或使生成的膠體金出現聚積現象。所以，反應時間一般控制在5—10min，容器最好經酸洗和硅化處理。溶液的pH可影響膠體金與單抗的結合效率，pH接近和稍高于蛋白質的等電點時，膠體金蛋白質的吸附力最強。pH偏低破壞膠體金表面靜電荷，易導致膠體金發生自身聚合，出現變色，靜置后有肉眼可見的顆粒性沉淀；pH偏高時，金粒子與單抗間作用力不足，結合蛋白量少，試紙條檢測顯色明顯減弱，靈敏度降低。膠體金溶液與被標蛋白的用量是否合適也是影響標記成功的一個重要因素。蛋白濃度過高，造成浪費的同時引起試紙的拖帶現象；蛋白濃度過低，導致膠體金標記不完全，從而降低試紙條的靈敏度及假陽性現象的出現。本研究采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，通過條件優化，以反應時間為 5 min、單抗標記量為 50 μg·mL-1、溶液的pH為8.0—8.5時獲得了較好的標記效果。

3.3對鴨瘟病料及陽性尿囊液檢測結果顯示，膠體金試紙條檢測方法與PCR方法的陽性符合率為91.6 %，膠體金試紙條的檢出率稍低于PCR法，但膠體金試紙條檢測方法具有檢測速度快，在10 min左右即可得到檢測結果；無需特殊儀器設備；操作簡單，便于基層臨床檢測等優點。

4　結論

本研究制備的DPV-gB蛋白單克隆抗體，特異、穩定。以此為基礎建立的DPV膠體金檢測方法，特異性強、敏感性高、重復性好，可用于鴨瘟的臨床快速診斷。

References

［1］ GUO Y F，SHEN C J，CHENG A C，WANG M S，ZHANG N，CHEN S，ZHOU Y. Anatid herpesvirus 1 CH virulent strain induces syncytium and apoptosisin duck embryo fibroblast cultures. Veterinary Microbiology，2009，138: 258-265.

［2］ 徐曉娟，郭霄峰，魏平華. 鴨瘟病毒研究進展. 養禽與禽病防治，2012（10）: 8-12. XU X J，GUO X F，WEI P H. Research progress of duck plague virus. Poultry Husbandry and Disease Control，2012（10）: 8-12. （in Chinese）

［3］ WANG Y H，X R LI，WANG G X，YIN H，CAI X P，FU B Q，ZHANG. D L. Development of an immunochromatographic strip for the rapid detection of Toxoplasmagondii circulating antigens. Parasitology International，2011，60: 105-107.

［4］ WANG H L，FENG N，YANG S T，WANG C Y，WANG T C，GAO Y W，SU J Q，ZHENG X X，HOU X Q，HUANG H N，YANG R M，ZOU X H，HUANG G，XIA X Z. A rapid immunochromatographic test strip for detecting rabies virus antibody. Journal of Virological Methods，2010，170: 80-85.

［5］ KUSANO N，IWANAMI T，NARAHARA K，TANAKA M. Production of monoclonal antibodies specific for the recombinantviral coat protein of Apple stem grooving virus-citrus isolate and theirapplication for a simple，rapid diagnosis by animmunochromatographicassay. Journal of Virological Methods，2014，195: 86-91.

［6］ 王建科，易立，羅彬，楊莘，程世鵬. 膠體金免疫層析技術在動物病毒性傳染病診斷中的應用. 動物醫學進展，2011，32（1）: 93-98. WANG J K，YI L，LUO B，YANG S，CHENG S P. Application of gold immunochromatographic Technique in the diagnosis of animal viral infectious disease. Progress in Veterinary Medicine，2011，32（1）: 93-98. （in Chinese）

［7］ LI Y M，HOU L D，YE J，LIU X Q，DAN H B，JING M L，CHEN H C，CAO S B. Development of a convenient immunochromatographic strip for diagnosis of infection with Japanese encephalitis virus in swine. Journal of Virological Methods，2010，168: 51-56.

［8］ LI J F，ZOU M Q，CHEN Y，XUE Q，ZHANG F，LI B B，WANG Y F，QI X H，YANG Y. Gold immunochromatographic strips for enhanced detection of Avian influenza and Newcastle disease viruses. Analytica Chimica Acta，2013，782: 54-58.

［9］ 吳曉平，吳異健，韓典霖，吳寶成，黃一帆. 原核表達番鴨呼腸孤病毒 σC與 σB蛋白對雛番鴨的免疫保護. 中國農業科學，2013，46（14）: 3040-3045. WU X P，WU Y J，HAN D L，WU B C，HUANG Y F. Protection ofmusovy duck reovirus by immunization with the recombinant σC and σB protein expressed in E. coli. Scientia Agricultura Sinica，2013，46（14）: 3040-3045. （in Chinese）

［10］ 王洪海，蘇敬良，曹振，田克恭. 鴨腸炎病毒單克隆抗體的制備.中國獸醫科技，2004，34（11）: 13-17. WANG H H，SU J L，CAO Z，TIAN K G. Preparation of monoclonal antibodies against duck enteritis virus. Chinese Journal of Veterinary Science and Technology，2004，34（11）: 13-17. （in Chinese）

［11］ 周艷君，華榮虹，王云峰，安同慶，劉金霞，楊金雨，華玉卓，童光志. SARS-CoV單克隆抗體的制備及抗原表位的初步鑒定. 生物工程學報，2005，21（2）: 211-215. ZHOU Y J，HUA R H，WANG Y F，AN T Q，LIU J X，YANG J Y，HUA Y Z，TONG G Z. Development of monoclonal antibodies against SARS-CoV and identification of antigenic epitopes. Chinese Journal of Biotechnology，2005，21（2）: 211-215. （in Chinese）

［12］ 孫建慧，黃立平，危艷武，吳洪麗，王一平，張輝，劉丹，陳冬杰，張智慧，劉長明.豬細小病毒1型VP2蛋白的表達與單克隆抗體的制備及應用. 中國獸醫科學，2014，44（12）: 1279-1285. SUN J X，HUANG L P，WEI Y W，WU H L，WANG Y P，ZHANG H，LIU D，CHEN D J，ZHANG Z H，LIU C M. Expression of porcine parvovirus type 1 VP2 protein and preparation and application of monoclonal antibody against VP2 protein. Chinese Veterinary Science，2014，44（12）: 1279-1285. （in Chinese）

［13］ 王瑩，鄭浩，何成華，張愛華，馮璐璐，皇超英，張海彬. 伏馬菌素B1單克隆抗體的制備及鑒定. 中國農業科學. 2011，44（20）: 4302-4308. WANG Y，ZHENG H，HE C H，ZHANG A H，FENG L L，HUANG C Y，ZHANG H B. Generation and identification of the monoclonal antibody against fumonisin B1. Scientia Agricultura Sinica，2011，44（20）: 4302-4308. （in Chinese）

［14］ 贠炳嶺，李德龍，胡曉亮，劉在斯，秦立廷，吳關，劉文，祁小樂，王永強，高宏雷，高玉龍，王笑梅. 禽白血病病毒群特異性抗原單克隆抗體的制備與鑒定. 中國預防獸醫學報，2012，34（10）: 782-785. YUAN B L，LI D L，HU X L，LIU Z S，QIN L T，WU G，LIU W，QI X L，WANG Y Q，GAO H L，GAO Y L，WANG X M. Preparation and identification of monoclonal antibodies against the group specific antigen of avian leukosisvirus. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，2012，34（10）: 782-785. （in Chinese）

［15］ 許靜，李世軍，熊勝，陳黎，楊倩，盧立志. 鴨胚成纖維細胞培養、傳代及保存方法的研究. 中國家禽，2012，34（13）: 9-13. XU J，LI S J，XIONG S，CHEN L，YANG Q，LU L Z. Culture subculture and cryopreservation of embryo fibroblast of duck. China Poultry，2012，34（13）: 9-13. （in Chinese）

［16］ 李向梅，王戰輝，肖希龍，王照鵬，溫凱，吳小平，夏.曦，武晉孝，江海洋. 同時檢測牛奶中喹諾酮類和慶大霉素殘留的膠體金免疫層析方法研究. 中國農業科學，2014，47（19）: 3883-3889. LI X M，WANG Z H，XIAO X L，WANG Z P，WEN K，WU X P，XIA X，WU J X，JIANG H Y. Development of a colloidal gold immunochromatographic technique for simultaneous detection of quinolones and gentamicin in milk. Scientia Agricultura Sinica，2014，47（19）: 3883-3889. （in Chinese）

［17］ 蔣韜，梁仲，陳涓，何繼軍，呂律，馬維民，劉在新，劉湘濤. 口蹄疫病毒 O、A、AsiaI型定型診斷膠體金免疫層析方法的建立. 中國農業科學 2008，41（11）: 3801-3808. JIANG T，LIANG Z，CHEN J，HE J J，Lü L，MA W M，LIU Z X，LIU X T. Development of a rapid gold immunochromatographic strip test for the diagnosis of Foot-and-Mouth disease virus O，A and Asiatype. IScientia Agricultura Sinica，2008，41（11）: 3801-3808. （in Chinese）

［18］ 宋萬杰，胡伯里，金玉蘭，阮系真，邵敬霞，周繼勇.豬圓環病毒 2型抗體膠體金免疫層析方法的建立. 中國獸醫科學，2014，44（7）: 710-714. SONG W J，HU B L，JIN Y L，RUAN X Z，SHAO J X，ZHOU J Y. Establishment of a method for detection of the antibody against porcine circovirus type 2 based on colloidal gold immunochromatographic assay. Chinese Veterinary Science，2014，44（7）: 710-714. （in Chinese）

［19］ 張鑫宇，左偉勇，朱善元，夏曉莉，孫懷昌. 非洲豬瘟病毒 p54 抗體膠體金試紙檢測方法的建立. 中國預防獸醫學報，2014，36（4）: 281-285. ZHANG X Y，ZUO W Y，ZHU S Y，XIA X L，SUN H C. Establishment of colloidal gold strip for detecting antibody against African swine fever virus. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，2014，36（4）: 281-285. （in Chinese）

［20］ ZHOU P，LU Y T，ZHU J，HONG J B，LI B，ZHOU J，GONG D，MONTOYA A. Nanocolloidal gold-based immunoassay for the detection of the N-Methylcarbamate pesticide carbofuran. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52: 4355-4359.

［21］ JIANG T，LIANG Z，REN W W，CHEN J，ZHI X Y，QI G Y，LIU X T，CAI X P. A simple and rapid colloidal gold-based immunochromatogarphic strip test for detection of FMDV serotype A. Virologica Sinica，2011，26 （1）: 30-39.

［22］ GRIFFIN A. M. The nucleotide sequence of the glycoprotein gB gene of infectious laryngotracheitisvirus: analysis and evolutionary relationship to the homologous gene from other herpesviruses.Journal of General Virology，1991，72（2）: 393-398.

［23］ 夏興霞，王永山，孟祥升，朱國強，張雪寒，何孔旺. 大腸桿菌0157: H7單克隆抗體膠體金免疫層析檢測試紙條的研制. 中國動物傳染病學報，2010，18（4）: 47-53. XIA X X，WANG Y S，MENG X S，ZHU G Q，ZHANG X H，HE K W. Development of a gold immunochromatogarphic strip for the detection of the E.Coli0157: H7. Chinese Journal of Animal Infectious Diseases，2010，18（4）: 47-53.（in Chinese）

［24］ 孫園園，王云龍，李玉林，王繼創，程蕾，鄧黎黎.pH 值對膠體金標記單克隆抗體性能的影響. 細胞與分子免疫學雜志，2014，30（11）: 1170-1173. SUN Y Y，WANG Y L，LI Y L，WANG J C，CHENG L，DENG L L. Effects of pH on the properties of colloidal gold labeling monoclonal antibody. Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology，2014，30（11）: 1170-1173. （in Chinese）

［25］ 顧菲菲，高海崗，陸建榮.不同粒徑大小膠體金的制備. 中國畜牧獸醫文摘. 2013，29（10）: 45-46. GU F F，GAO H G，LU J R. Different sizes of colloidal gold preparation. Chinese Abstracts of Animal Husbandry and Veterinary Medicine. 2013，29（10）: 45-46.（in Chinese）

（責任編輯 林鑒非）

Preparation of Monoclonal Antibodies Against DPV and Development of Colloidal Gold Strip for DPV Detection

ZHAO Dan-dan，YANG Guo-ping，DIAO You-xiang，CHEN Hao，TI Jin-feng，ZHANG Lu，ZHANG Ying，LI Chuan-chuan
（College of Animal Science and Technology，Shandong Agricultural University，Tai’an 271000，Shandong）

【Objective】 Duck plague （DP） is an acute，septic contagion，caused by duck plague virus （DPV），with the characteristics of head and neck swelling，the mucosa of esophageal and cloacal bleeding and yellowish-white ulcer，head and neck skin has a yellowish-white gelatin sample. Once an outbreak of this disease manifested by with high morbidity and high mortality，it would cause serious harm to the duck industry. The aim of this assay is to establish a method of colloidal gold strip for the detection of duck plague virus （DPV） rapidly. 【Method】 The main antigenic domain of DPV was chosen and analyzed by using of theProtean Biology software to design a pair of primer to amplify the aim gene by PCR. Then the fragment was inserted into prokaryotic expression vector pET-28a to construct recombinant plasmid. Then it was transformed into Rosetta for expression. During the experiment，the authors have groped the concentration of the IPTG and the induction time. After purification，the concentration of the aim protein was tested and was also analyzed and identified by Western blotting. Hybridoma cell lines stably secreting monoclonal antibody against gB protein of DPV were generated by fusing SP2/0 myeloma cells with splenocytes from the immunized mice，which used the gB protein of DPV，expressed and purified with prokaryotic，as the antigen. The monoclonal antibody-based colloidal gold immunochromatography strip was developed for the detection of DPV. The purified DPV-gB monoclonal antibody，named H6F6，was labeled with colloidal gold，with the appropriate pH between 8.0 and 8.5 and the concentration was 15 times dilution. The purified A8D7 monoclonal antibody，with the concentration of twice dilution，and the goat anti-mouse immunoglobulin G （IgG）antibody，with the concentration of ten times dilution，were blotted on nitrocellulose membrane as test line and control line，respectively. 【Result】 Hybridoma cell lines designated as A8D9，E6C3，H11F8，H6A10，stably secreting monoclonal antibody against gB protein of DPV. The titres of ascitic fluid was1:103，1:103，1:105，1:103，respectively by indirect ELISA and the immunoglobulin subtype of the monoclonal antibodies was IgG2b，IgG2a，IgG2b，IgG1，with the light chain of kappa. The result of western blot showed that the four monoclonal antibodies were able to specifically recognize gB protein of DPV. The result of IFA showed that the four monoclonal antibodies were specific to DPV. The detection results indicated that the strip was specific to DPV and had no cross reaction with DRV，EDS-76V，AIV-H9N2，and TMUV. The detection limit of DPV were 50 times dilution. 38 clinical suspected samples were simultaneously detected by immunochromatography strip and PCR while the results showed 91.6 % accuracy between them. The monoclonal antibodies-based colloidal gold strip was highly specific and sensitive and more convenient for the clinical diagnosis of DPV. 【Conclusion】 The colloidal gold strip was highly specific and sensitive and more convenient for the clinical diagnosis of DPV.

duck plague virus； glycoprotein B； Prokaryotic expression； monoclonal antibody； colloidal gold strip

2015-05-13；接受日期：2016-03-10

國家現代農業產業技術體系項目（CARS-43-10）

聯系方式：趙丹丹，Tel：17863963319；E-mail：zhaodandan_0925@163.com。通信作者刁有祥，Tel：13605386443；E-mail：yxdiao@163.com