2-甲氧基雌二醇聯(lián)合冬凌草甲素對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

李銀英，陳成群，張振中

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部 鄭州 450014　2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部 鄭州 450052　3)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州450001

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2-甲氧基雌二醇聯(lián)合冬凌草甲素對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

李銀英1)，陳成群2)，張振中3)#

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部 鄭州 4500142)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部 鄭州 4500523)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州450001

2-甲氧基雌二醇；增殖；凋亡；胃癌；聯(lián)合用藥；SGC-7901細(xì)胞

目的：研究2-甲氧基雌二醇(2-ME)單獨(dú)和聯(lián)合冬凌草甲素對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法：用0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000 μmol/L 2-ME處理SGC-7901細(xì)胞24、48和72 h后，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，SRB法檢測(cè)2-ME對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用；用0.625、2.500、10.000、20.000 μmol/L 2-ME以及相同濃度的冬凌草甲素單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用處理SGC-7901細(xì)胞48 h后，計(jì)算結(jié)合指數(shù)，用流式細(xì)胞術(shù)和熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果：2-ME作用于SGC-7901細(xì)胞48 h的IC50值為5.31 μmol/L，對(duì)細(xì)胞SGC-7901的抑制作用呈時(shí)間依賴性,與冬凌草甲素聯(lián)合應(yīng)用的IC50值為8.46 μmol/L。不同濃度2-ME作用48 h，隨著劑量增加，SGC-7901細(xì)胞凋亡率增加，聯(lián)合應(yīng)用冬凌草甲素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響未表現(xiàn)出協(xié)同作用。結(jié)論：2-ME可以抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，與冬凌草甲素聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制表現(xiàn)為相加作用，對(duì)凋亡未表現(xiàn)出協(xié)同作用。

惡性腫瘤是當(dāng)今社會(huì)嚴(yán)重威脅人類生命的主要因素之一，傳統(tǒng)的化學(xué)藥物治療毒性大，療效差，研究發(fā)掘高效低毒的治療藥物和方法成了近期人們關(guān)注的焦點(diǎn)。2-甲氧基雌二醇(2-methoxy estradiol,2-ME) 是雌二醇在體內(nèi)的生理代謝產(chǎn)物[1-2]，廣泛存在于人類血液和尿液中，能選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常細(xì)胞基本沒有毒性以及對(duì)雌激素受體無依賴性。2-ME得到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛研究，目前正在進(jìn)行多種腫瘤治療的臨床試驗(yàn)，是一種很有前景的抗腫瘤藥物。冬凌草甲素是從冬凌草等植物葉子中提取出的一種貝殼杉烯二萜類化合物，具有較好的抗腫瘤活性。研究[3-4]證實(shí)2-ME可以將腫瘤細(xì)胞阻滯在G2/M期。而冬凌草甲素也能通過將腫瘤細(xì)胞阻滯于G2/M期而達(dá)到抗增殖的作用[5]，作者考慮二者聯(lián)合用藥可能有相加作用。該研究以胃癌SGC-7901細(xì)胞為研究對(duì)象，初步考察了2-ME與冬凌草甲素單獨(dú)和聯(lián)合用藥對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1　材料與方法

1.1主要試劑2-ME(由鄭州大學(xué)藥學(xué)院新藥合成課題組自制，純度>99%)，以二甲基亞砜(DMSO)配制成64 mmol/L的原藥儲(chǔ)備液，0.22 μm濾器除菌，4 ℃保存，臨用時(shí)用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋成所需濃度；冬凌草甲素(購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司，純度﹥99%)，以DMSO配制成64 mmol/L的原藥儲(chǔ)備液，4 ℃保存?zhèn)溆茫籖PMI 1640購自鄭州科諾生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶購自基諾生物醫(yī)藥術(shù)有限公技司；胎牛血清購自上海依科賽生物制品有限公司；硫基羅丹明蛋白染料(SRB)購自美國Sigma公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒和Hoechst33342-PI雙染檢測(cè)試劑盒均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)于含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 kU/L青霉素和0.1 kg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3SRB法檢測(cè)2-ME對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響取處于對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化收集，調(diào)整細(xì)胞濃度，5×103個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，加入含不同濃度(0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000 μmol/L)2-ME的培養(yǎng)液，每孔反應(yīng)體系0.2 mL，空白對(duì)照組以RPMI 1640培養(yǎng)液補(bǔ)足，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)分別培養(yǎng)24、48、72 h后，倒置顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。用預(yù)冷的三氯乙酸(TCA)固定細(xì)胞10 min，移入4 ℃環(huán)境下靜置1 h后，除去固定液，每孔用去離子水洗5遍，自然晾干。每小孔中加100 μL SRB染色，室溫避光放置15 min,棄去染液，用體積分?jǐn)?shù)1%冰醋酸將未結(jié)合的SRB染液洗去，每孔5遍，自然晾干。結(jié)合的SRB用Tris堿液150 μL溶解，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在515 nm處測(cè)定每孔光密度(OD)值，細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。

1.4SRB法檢測(cè)2-ME和冬凌草甲素對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響取處于對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化收集，調(diào)整細(xì)胞濃度，5×103個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，分別加入含以下濃度藥物的培養(yǎng)基：0.625、1.250、2.500、5.000 μmol/L 2-ME和相同濃度的冬凌草甲素，以及2-ME與冬凌草甲素以上濃度的混合液，于培養(yǎng)箱中作用48、72 h后，按上述SRB法處理96孔板中細(xì)胞，再測(cè)定每孔OD值，按1.3中方法計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，最后計(jì)算每組IC50值，采用Chou-Talalay 法[6]，計(jì)算結(jié)合指數(shù)(combination index,CI)，CI<1.0時(shí)表示協(xié)同作用,CI=1.0時(shí)表示相加作用,而CI>1.0時(shí)則表示拮抗作用。

2　結(jié)果

2.1不同濃度2-ME作用不同時(shí)間后SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定結(jié)果見圖1。不同濃度2-ME作用SGC-7901細(xì)胞48和72 h，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率逐漸增加。不同濃度2-ME作用SGC-7901細(xì)胞24 h時(shí)，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率有先增加后降低的趨勢(shì)。相同濃度2-ME作用于SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率表現(xiàn)出時(shí)間依賴性。

圖1　不同濃度2-ME作用不同時(shí)間后對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用

2.2不同濃度2-ME作用48 h SGC-7901細(xì)胞形態(tài)變化結(jié)果見圖2。存活細(xì)胞數(shù)目隨2-ME濃度增大而減少,且藥物作用后細(xì)胞形態(tài)與空白對(duì)照組相比發(fā)生明顯變化，細(xì)胞變圓、皺縮，有凋亡小體生成。

A：0.500 μmol/L 2-ME；B：2.000 μmol/L 2-ME；C：4.000 μmol/L 2-ME；D：16.000 μmol/L 2-ME；E：對(duì)照。圖2　不同濃度2-ME作用48 h SGC-7901細(xì)胞形態(tài)變化

2.32-ME和冬凌草甲素對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響見圖3。不同濃度的2-ME和冬凌草甲素作用SGC-7901細(xì)胞48 h后，均表現(xiàn)不同程度增殖抑制作用，兩者聯(lián)合用藥也對(duì)細(xì)胞有明顯增殖抑制作用，2-ME對(duì)SGC-7901的IC50值為5.31 μmol/L，冬凌草甲素對(duì)SGC-7901的IC50值為18.14 μmol/L，兩者聯(lián)合用藥IC50值為8.46 μmol/L，CI為0.989，兩者聯(lián)合作用48 h后，對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制有相加作用。

A：2-ME；B：冬凌草甲素；C：2-ME和冬凌草甲素。圖3　2-ME和冬凌草甲素單獨(dú)與聯(lián)合作用SGC-7901細(xì)胞48 h后的細(xì)胞增殖抑制率

2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)2-ME和冬凌草甲素對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響0.625、2.500、10.000、20.000 μmol/L的2-ME誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)分別為(15.46±0.88)%、(23.42±1.44)%、(35.97±1.69)%、(38.74±2.69)%，呈明顯濃度依賴性；2.500 μmol/L冬凌草甲素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率為(12.68±1.34)%；2.500 μmol/L冬凌草甲素和2-ME混合液誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率為(13.15±1.25)%，介于單獨(dú)應(yīng)用2-ME和冬凌草甲素之間，未呈現(xiàn)協(xié)同作用。

2.52-ME和冬凌草甲素對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡影響的Hoechst33342/PI雙染檢測(cè)結(jié)果熒光倒置顯微鏡結(jié)果(圖4)顯示細(xì)胞凋亡呈明顯濃度依賴性，與流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果一致，而2.500 μmol/L冬凌草甲素和2-ME混合液誘導(dǎo)的凋亡明顯少于2.500 μmol/L 2-ME且多于2.500 μmol/L冬凌草甲素引起的凋亡，與流式細(xì)胞儀結(jié)果一致。兩藥聯(lián)合應(yīng)用并未呈現(xiàn)協(xié)同作用。

A：2.500 μmol/L 2-ME；B： 2.500 μmol/L冬凌草甲素；C：2-ME和冬凌草甲素混合液；D：細(xì)胞對(duì)照。圖4　Hoechst33342/PI 雙染檢測(cè)2-ME和冬凌草甲素對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果(×200)

3　討論

胃癌是我國常見的惡性腫瘤，其病死率居各類惡性腫瘤之首，且多數(shù)患者為進(jìn)展期胃癌[7]。聯(lián)合化療為其治療的重要手段，但療效差，同時(shí)化療對(duì)機(jī)體有毒副作用，比如骨髓抑制、免疫抑制、胃腸道反應(yīng)等。許多患者因?yàn)槟褪懿涣硕艞壷委煟幸恍┥眢w狀況不佳的患者因化療而加速死亡，因此必須尋求新的藥物配伍方案。

2-ME主要是抗血管新生，可將腫瘤細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。作者用SRB法檢測(cè)了不同濃度的2-ME對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果表明，2-ME在低濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞的抑制作用隨時(shí)間的延長而降低，而在濃度較大范圍內(nèi)則隨時(shí)間的延長而增強(qiáng)；作用48、72 h具有濃度依賴性，而作用24 h在小于2 μmol/L范圍內(nèi)抑制率隨濃度升高而增大，在大于2 μmol/L范圍內(nèi)抑制率隨濃度升高而減小。這說明2-ME只是在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞的增殖抑制所用呈時(shí)間-濃度依賴性，具體原因可能和細(xì)胞的自噬有關(guān)[8]。自噬又稱程序性死亡，是一個(gè)受嚴(yán)格調(diào)節(jié)的細(xì)胞內(nèi)容物的降解和再循環(huán)的過程，參與了細(xì)胞器的代謝和再利用以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)的生物能量的補(bǔ)充。作為一種細(xì)胞生存的機(jī)制，自噬在很多生理過程如抵抗?fàn)I養(yǎng)缺乏、 清除過剩或損壞的細(xì)胞器上發(fā)揮著重要的作用。自噬可能拮抗或延遲細(xì)胞凋亡 ,因?yàn)樵谝恍┣闆r下，自噬能通過清除損傷的線粒體而減弱凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)，另外，細(xì)胞凋亡和自噬可能作為彼此的后備機(jī)制從而執(zhí)行不可逆的細(xì)胞死亡信號(hào)的傳遞[9]。

2-ME和冬凌草甲素都能夠?qū)⒛[瘤細(xì)胞阻滯在G2/M期，兩者聯(lián)用可能對(duì)細(xì)胞增殖抑制具有相加作用。作者的研究結(jié)果顯示，2-ME和冬凌草甲素CI為0.989，接近于1，證實(shí)兩者確實(shí)具有相加作用。流式細(xì)胞儀和熒光染色凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡率隨2-ME藥物濃度的升高而增加，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。而在2.500 μmol/L兩者聯(lián)合用藥的細(xì)胞凋亡率高于2.500 μmol/L的冬凌草甲素而低于2.500 μmol/L的2-ME單獨(dú)應(yīng)用，此結(jié)果也與抑制增殖試驗(yàn)中聯(lián)合用藥組抑制率數(shù)值介于2-ME組和冬凌草甲素組之間一致。

總之，2-ME可以抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，與冬凌草甲素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制表現(xiàn)為相加作用，對(duì)凋亡未表現(xiàn)出協(xié)同作用。

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(2015-12-26收稿責(zé)任編輯李沛寰)

Effect of 2-methoxy estradiol and oridonin on proliferation and apoptosis of gastric cancer SGC-7901 cells in vitro

LIYinying1)，CHENChengqun2)，ZHANGZhenzhong3)

1)DepartmentofPharmacology,theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou4500142)DepartmentofPharmacology,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou4500523)CollegeofPharmacology,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001

2-methoxy estradiol；proliferation；apoptosis;gastric cancer;SGC-7901 cell

Aim: To study the effect of 2-methoxy estradiol(2-ME) separate and combined with oridonin treatment on proliferation and apoptosis of gastric cancer strain SGC-7901 in vitro. Methods: SGC-7901 cells were treated with 0.125,0.250,0.500,1.000,2.000,4.000,8.000,16.000 μmol/L 2-ME for 24, 48 and 72 h, cells morphological changes were observed,and SRB assay was applied to detect the SGC-7901 cell growth; with different concentration (0.625,2.500,10.000,20.000 μmol/L)2-ME and the same concentration oridonin separately treatment on SGC-7901 cells for 48 h, the combination index was calculated,and the apoptosis of the cells by flow cytometry and fluorescent staining was observed. Results: TheIC50of 2-ME acted on SGC-7901 cells was 5.31 μmol/L, and the inhibitory effect of 2-ME on SGC-7901 cells was concentration- and time- dependent. After being treated by different concentrations of 2-ME for 48 h, the apoptosis rate of SGC-7901 cells was increased with the increase of the dose, and the effect of 2-ME on apoptosis had no synergistic. Conclusion: 2-ME can inhibit the proliferation of SGC-7901 cells, induce apoptosis, and enhance the effect of oridonin.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.012

，男，1964年11月生，博士，教授，研究方向：腫瘤靶向治療，E-mail：zhangzz08@126.com

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目81573364

R735