一例綿羊肺腺瘤病毒感染的診斷

才格加（青海省貴南縣過馬營鎮(zhèn)獸醫(yī)站青海海南州813101）

一例綿羊肺腺瘤病毒感染的診斷

才格加
（青海省貴南縣過馬營鎮(zhèn)獸醫(yī)站青海海南州813101）

綿羊肺腺瘤病（Ovine pulmonary adenomatosis，OPA）是由綿羊肺腺瘤病毒（Jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV）引起羊的一種慢性、接觸傳染性、肺臟腫瘤性疾病［1］。本病的潛伏期較長，以肺部發(fā)生腫瘤為特征，病羊表現(xiàn)消瘦，咳嗽，呼吸困難，肺部發(fā)生腫瘤，最終衰竭而死亡［2］。綿羊感染JSRV多散發(fā)，不同品種，年齡和性別的綿羊均發(fā)病，飼養(yǎng)密度大，通風(fēng)不良等有利于疾病傳播。寒冷季節(jié)，疾病加重。本病呈世界范圍內(nèi)流行，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織確定為B類疫病，在我國被農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局列為三類動(dòng)物傳染病，國內(nèi)多呈散發(fā)性、地方性流行，近年來我國養(yǎng)羊密度集中地區(qū)均有該病發(fā)生和流行的報(bào)道［3-5］，嚴(yán)重威脅著我國養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展。本文對(duì)某規(guī)模羊場發(fā)生的一起綿羊肺腺瘤病毒感染病例進(jìn)行診斷，通過對(duì)病羊臨床表現(xiàn)，剖檢和實(shí)驗(yàn)室PCR診斷，確定該羊場發(fā)生綿羊肺腺瘤病毒感染。養(yǎng)殖單位通過采取對(duì)臨床發(fā)病羊全部隔離、淘汰，飼養(yǎng)用具及環(huán)境全面消毒，疫情得到有效控制。現(xiàn)將疾病的診斷過程介紹如下：

1　發(fā)病情況

2015年5月開始，該羊場1周歲左右小羊開始陸續(xù)發(fā)病，發(fā)病率達(dá)10%左右，病程較長，經(jīng)咳嗽、氣喘、瘦弱、衰竭至死。羊場曾用青霉素、四環(huán)素類等多種藥物進(jìn)行治療，均無顯著效果。同時(shí)調(diào)查發(fā)現(xiàn)該羊場所貯備飼草有霉變現(xiàn)象。

2　臨床特征

發(fā)病綿羊呼吸困難、鼻液粘稠、鼻孔流產(chǎn)卡他性分泌物、間斷啰咳嗽、支氣管“”音、病程長，低頭時(shí)由鼻孔流出大量液體、體型消瘦、貧血、食欲降低，最后極度消瘦死亡。

3　病理變化

剖檢可見病變主要表現(xiàn)于肺臟，整個(gè)肺臟的外觀顯著腫大、水腫，其體積可達(dá)正常肺臟的3倍以上，肺表面具有大量灰白色小結(jié)節(jié)、外觀圓形、質(zhì)地堅(jiān)實(shí)、小結(jié)節(jié)發(fā)生融合，形成大結(jié)節(jié)。通過臨床癥狀及病理剖檢觀察，高度懷疑為腫瘤病，送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行綿羊肺腺瘤病PCR檢測。

4　PCR檢測

取病死羊肺臟病變組織加入滅菌生理鹽水后勻漿，-20℃反復(fù)凍融3次，10 000 r/min離心5min，吸取上清液按病毒基因組DNA試劑盒（購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司）說明書提取病死羊組織病料的基因組DNA。根據(jù)參考文獻(xiàn)［6］中的方法合成綿羊肺腺瘤病1對(duì)檢測引物（上游引物序列：5'-CTGGGAGCTCTTTGGCAAAAGCCAAAGCC-3'，下游引物序列：5'-CCTGCCGCGACCAGCACAAACAAGAG-3'）。以提取的DNA為模板，參照參考文獻(xiàn)［6］中的PCR反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察可見在位于約367 bp處具有特異性擴(kuò)增條帶（見圖1），其片段大小與羅軍榮等［6］的報(bào)道完全一致。

圖1　PCR擴(kuò)增結(jié)果M:DL 2000Marker；1:病料PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2:水對(duì)照

5　基因序列鑒定結(jié)果

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用膠回收試劑盒回收純化后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序結(jié)果與GenBank中登錄的序列比對(duì)分析顯示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基因序列與登錄號(hào)為AF105220的綿羊肺腺瘤病毒基因組序列同源性最高，為99.46 %。表明所擴(kuò)增序列為綿羊肺腺瘤病毒特異性序列。

6　綜合診斷結(jié)果

結(jié)合臨床發(fā)病情況、臨床特征、病理變化等臨床診斷結(jié)果以及PCR檢測、序列鑒定等實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果綜合判定此次病例由綿羊肺腺瘤感染所致。

7　小結(jié)與討論

綿羊肺腺瘤病的分布廣泛，在世界范圍內(nèi)都有發(fā)病報(bào)道，本病有傳染性，死亡率很高，給養(yǎng)羊業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，引起獸醫(yī)界越來越廣泛的關(guān)注。本病主要感染綿羊，山羊有一定抵抗力，感染疾病后最主要特征是在肺部形成腫瘤。綿羊肺腺瘤病毒感染后潛伏期很長，如果發(fā)生細(xì)菌病混合感染可加快疾病發(fā)生和死亡。對(duì)于綿羊肺腺瘤病的診斷方法，由于綿羊肺腺瘤病毒在體外培養(yǎng)沒有適宜的細(xì)胞系，因此本病不能通過病毒分離的方法診斷。綿羊肺腺瘤病毒感染后在綿羊體內(nèi)不產(chǎn)生抗體，因此本病不能通過血清學(xué)方法檢測。故本病的診斷主要通過分子生物學(xué)方法進(jìn)行確診，分子生物學(xué)檢測方法中PCR方法是目前實(shí)驗(yàn)室疾病檢測最簡單、最有效的主要方法，發(fā)生自然感染的病例，潛伏期較長，PCR方法可以用于疾病的早期診斷。目前，綿羊肺腺瘤病毒感染的診斷主要通過臨床癥狀、病理剖檢和實(shí)驗(yàn)室PCR檢測。故本病例綜合采用臨床發(fā)病情況、臨床特征、病理變化觀察以及PCR檢測、序列鑒定方法對(duì)此次病例進(jìn)行綜合診斷，診斷結(jié)果應(yīng)具有十分高的準(zhǔn)確性和可靠性。（編輯：段勇）

［1］朱福余，于立新，么宏強(qiáng)，等.綿羊肺腺瘤病毒檢測方法的研究進(jìn)展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（4）:236-241.

［2］楊素芳，梁田，趙慶亮，等.新疆綿羊肺腺瘤病理學(xué)診斷與全基因組序列分析［J］.病毒學(xué)報(bào)，2015，31（3）:217-225.

［3］王林，韋海濤，李志軍，等.北京地區(qū)綿羊肺腺瘤病的病理學(xué)及PCR診斷［J］.中國獸醫(yī)雜志，2014，50（5）:22-24.

［4］楊素芳，司俊強(qiáng)，鄭啟偉，等.新疆部分地區(qū)綿羊肺腺瘤病流行病學(xué)調(diào)查［J］.石河子大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，33（5）:46-51.

［5］劉暢，李磊，于立新，等.綿羊肺腺瘤病毒內(nèi)蒙古分離株前病毒全基因組克隆及序列分析［J］.病毒學(xué)報(bào)，2014，30（5）:508-513.

［6］羅軍榮，劉霄卉，余群英，等.綿羊肺腺瘤病特異性PCR及套式PCR診斷方法的建立［J］.病毒學(xué)報(bào)，2009，25（2）: 125-130.

10.3969/j.issn.1008-4754.2016.8.027

才格加（1971-），男，藏族，青海人，專科，畜牧師，研究方向：動(dòng)物疫病防治與檢疫。