蔗渣纖維素分解菌的篩選、鑒定及酶活的測定

黃惠娟，方界群，陳華文，陳迪文，黃 瑩，黃振瑞，江 永*

（1廣州甘蔗糖業研究所 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣東廣州510316；2廣東省遂溪縣農業局，廣東遂溪524300）

蔗渣纖維素分解菌的篩選、鑒定及酶活的測定

黃惠娟1，方界群1，陳華文2，陳迪文1，黃 瑩1，黃振瑞1，江 永1*

（1廣州甘蔗糖業研究所 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣東廣州510316；2廣東省遂溪縣農業局，廣東遂溪524300）

為充分利用蔗渣，篩選高效降解蔗渣的菌株，本文從堆肥中分離得到有顯著透明圈、可產纖維素酶的真菌8株，選其中3株測定了羧甲基纖維素酶（CMCase）和濾紙酶（FPA）活性。結果表明，菌株SC8的透明圈直徑、CMCase和 FPA活性均最大。經菌落形態特征分析，初步鑒定菌株 SC8屬于曲霉屬（Aspergillus）。相關性分析表明，所篩選菌株在纖維素透明圈直徑的大小與CMCase、FPA酶活性成極顯著正相關（p＜0.01）。

蔗渣；纖維素分解菌；纖維素酶；濾紙酶活

0　前言

蔗渣是制糖工業的主要副產品，是一種重要的可再生生物質資源。中國是僅次于巴西和印度的第3大甘蔗種植大國，南方蔗區甘蔗總產量7000多萬t，蔗渣的產量達到700萬t［1］。蔗渣的成分以纖維素，半纖維素以及木質素為主，蛋白質、淀粉和可溶性糖含量較少。由于蔗渣的木質化程度高、蔗莖表皮存在硅化細胞，養分不協調以及轉化利用技術手段落后等原因，目前蔗渣多數被糖廠作為燃料提供鍋爐熱能，部分用于造紙和纖維板等，但其利用率和附加值低，不僅造成了資源的浪費，而且還帶來了環境的污染。另外，甘蔗人工收獲后蔗葉大部分被廢棄于蔗田，干燥后大部分被農民焚燒（如不燒掉將影響下一季的生產管理），不僅浪費資源而且嚴重污染環境，如能通過技術手段使得在下一季甘蔗生產管理時蔗葉已經腐化，那么可以避免蔗葉被焚燒，而且蔗葉腐爛后能提高蔗田土壤有機質，改善土壤理化性質，提高土地生產力。雖然正在推廣的甘蔗機械化收獲能將蔗葉切斷粉碎后回田，但蔗葉的纖維含量高，自然腐爛時間周期長，急需技術手段加速其腐化速度，從而為加快蔗葉回田推廣速度奠定基礎。

纖維素分解菌含有纖維素酶，可將蔗渣等纖維素分解為糖類，具有廣闊的應用前景。但目前得到的纖維素酶，無論是來自動物、植物還是微生物，還不能滿足大規模工業生產的需要［2］。纖維素酶活力較低，生產周期長，纖維素酶復合物的分子量十分龐大，單個酶組分沒有水解纖維素的能力，菌株的纖維素酶活力仍然較低，這些原因一直是阻礙纖維素酶大規模生產應用的瓶頸問題［3］。因此，篩選分離得到理想的蔗渣纖維素分解菌，對于提高蔗渣養分資源循環高值化利用和解決環境污染問題具有重要意義。本研究綜合利用羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）透明圈測定法和胞外酶活測定法，針對蔗渣纖維素降解問題，進行了纖維素分解菌的篩選和鑒定，并測定了其部分酶活力。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1纖維素分解菌分離樣品

以蔗渣與雞糞等自然堆肥材料為分離樣品，當堆體溫度上升到45℃時，采集中層樣品于無菌器皿中，4℃保存備用。

1.1.2羧甲基纖維素鈉培養基

羧甲基纖維素鈉（CMC-Na） 2 g、（NH4）2SO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO41 g、NaCl 0.5 g，蒸餾水1000 mL。制成固體平板培養基時加入瓊脂20 g。

1.1.3試劑

0.05mol/L pH 4.8醋酸鈉緩沖液；0.025 mol/L CMC-HAc緩沖液；DNS試劑（酒石酸甲鈉22.75 g，3，5-二硝基水楊酸0.7875 g，氫氧化鈉5 g，結晶酚0.625 g，無水硫酸鈉0.625 g，攪拌溶解，冷卻后定容至250 mL）；0.1％葡萄糖標準液。

1.2方法

1.2.1蔗渣纖維素分解菌的篩選、純化及纖維素水解透明圈的測定

稱取新鮮蔗渣堆肥物料20 g，放入盛有200 mL無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振蕩20 min。靜置后吸取上層清液稀釋成 10-1、10-2、10-3和10-4倍的菌液，各取200 μL分別涂布到羧甲基纖維素鈉平板培養基上進行初篩分離，平板置于45℃恒溫培養箱中倒置培養。待形成單菌落，分別挑取單菌落進行劃線分離。將分離出的菌株點種到羧甲基纖維素鈉平板培養基上，45℃培養3天。用1 g/L的剛果紅染色10 min，再用1 mol/L NaCl沖洗，測量透明圈的直徑。

1.2.2菌株復篩和粗酶液的提取

參照包衎等方法［4］，略有修改。取粗篩菌種在羧甲基纖維素培養基試管斜面上45℃活化3天。將5 mL無菌水滴加到試管斜面中。振蕩，制備成菌懸液。吸取菌懸液1 mL接入25 mL CMC液體發酵培養基中，45℃、180 r/min震蕩培養4天，所得發酵液經4℃、5000 r/min離心30 min，收集上清液作為粗酶液用于酶活力的測定。

1.2.3酶活測定

1.2.3.1葡萄糖標準曲線的制作

取 0.1％標準葡萄糖溶液分別制成 0.01％、0.02％、0.04％、0.06％和 0.08％的葡萄糖溶液。與DNS沸水浴5 min后取出冷卻，加蒸餾水定容至6 mL混勻，以蒸餾水作為空白對照，測定各試管內的OD540值，以不同濃度的葡萄糖溶液作為橫坐標，OD540值作為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。

1.2.3.2羧甲基纖維素酶（CMCase）活力的測定

采用DNS法［5］，取0.5 mL上述粗酶液加入試管中，加入2 mL 0.025 mol/L CMC-HAc緩沖液，在45℃下酶反應30 min。試管中加入2.5 mL 3，5-二硝基水楊酸終止酶反應。充分搖勻后沸水浴5 min，取出冷卻后用蒸餾水定容至15 mL。以變性酶為空白對照，測定 OD540值，代入葡萄糖標準曲線函數求得含糖量。

1.2.3.3濾紙酶活力（FPA）的測定

試管中加入0.5 mL粗酶液和2 mL 0.025 mol/L CMC-HAc緩沖液，于45℃水浴中預熱5 min后加入50 mg濾紙條（新華定量濾紙，l cm×6 cm），保溫1 h，加入2.5 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑終止酶反應。充分搖勻后沸水浴5 min，取出冷卻后用蒸餾水定容至15 mL。以變性酶為空白對照，測定OD540值，代入葡萄糖標準曲線函數求得含糖量。

酶活定義為每分鐘催化纖維素水解生成l μmol葡萄糖的酶量為一個酶活力單位IU。按下式算出濾紙酶活力：

酶活=還原糖濃度×15×稀釋倍數/（t×0.5×180）

式中，稀釋倍數指測定酶活時酶液的稀釋倍數；t為酶反應時間（min）；180為葡萄糖分子量，15指15 mL定容體積，單位為g；0.5指0.5 mL粗酶液參加反應。

1.3數據分析

所有試驗數據均用Excel 2010和SPSS 17統計軟件進行分析。

2　結果與分析

2.1蔗渣纖維素分解菌的篩選和鑒定

從蔗渣堆肥中經過剛果紅透明圈法篩選分離到8株具有降解纖維素能力的真菌，依次命名為SC1～SC8（暫定名），其透明圈直徑大小如表1所示。其中SC8菌株生長速度較快且長勢旺盛，在剛果紅培養基上形成的透明圈最大，降解纖維素的能力較強。該菌株在平板培養基上菌落呈圓形，邊緣平整，具輻射狀皺紋，質地絲絨狀到絮狀，表面粗糙，布滿一層孢子粉，孢子呈暗綠色（圖1 A），在剛果紅纖維素培養基平板上能形成明顯的透明圈（圖1 B）。根據菌株的菌落形態特征，按《真菌分類鑒定手冊》和《真菌分類學》進行檢索，初步鑒定SC8為曲霉屬（Aspergillus）。

表1　8株菌株的透明圈直徑大小

圖1　蔗渣纖維素分解菌的菌落形態（A）及在剛果紅纖維素培養基上形成的透明圈（B）

2.2菌株羧甲基纖維素酶（CMCase）和濾紙酶（FPA）活力的測定

從表1中挑選出透明圈較大的菌株 SC2、SC6 和SC8進行羧甲基纖維素酶活力和濾紙酶活力的測定。從表2可見，菌株的CMCase和FPA酶活力由高到低依次為SC8＞SC2＞SC6，該結果與透明圈直徑大小的結果相一致。SC8的CMCase和FPA酶活力分別為SC6的3.88倍和2.07倍。

2.3菌株透明圈和酶活力的關系

相關性分析表明（表3），菌株在剛果紅纖維素培養基上形成的透明圈大小與CMCase和FPA酶活力成極顯著正相關（p＜0.01），且CMCase和FPA酶活力之間也成極顯著正相關。可見，通過菌株在剛果紅纖維素培養基上形成的透明圈大小可初步判斷其降解纖維素能力的強弱。

表2　菌株的CMCase和FPA酶活力

3　討論

剛果紅羧甲基纖維素（CMC）平板透明圈篩選法是目前分離纖維素分解菌公認的比較快速、簡捷的方法。該法可用于識別產纖維素酶的菌株，還可用于初步判定酶活性高低。產酶越多，透明圈越大，產酶越快，透明圈出現越早。透明圈的大小與CMCase酶活、FPA酶活具有一定的相關性。岳思君等研究結果表明，水解圈的大小直接反映 CMC酶活的大小，但FPA酶活與剛果紅纖維素平板水解圈大小、CMC酶活不成線性關系［6］。本文結果顯示，所篩選分離得到的菌株透明圈的大小與CMCase酶活、FPA酶活存在極顯著正相關。

表3　菌株透明圈與酶活力的相關性分析

近年來已發現的能降解纖維素的微生物超過了200種，但對纖維素分解能力較強的真菌主要歸屬于木霉屬（Trichoderma）、曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）和枝頂孢霉屬（Acremonium）［7］。本文從蔗渣中篩選分離得到的真菌SC8經初步鑒定為曲霉屬。鐘國祥等［8］從霉變蔗葉中分離到1株纖維素降解菌，并對其培養條件和酶學性質進行了研究，結果表明該菌產酶的最適溫度為為 40℃，最適 pH 為5.5。楊培新等［9］從長期堆放廢棄竹筍殼的土壤中分離到1株產纖維素酶的曲霉屬真菌，并且通過單因素試驗從不同碳源、氮源濃度和培養基初始 pH 值3個因素優化了該菌在液體發酵中產纖維素酶的條件，結果表明，比未優化對照酶活力提高了15.02％。

纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，是起協同作用的多組分酶系。目前，認為纖維素酶由3種不同功能的水解酶組成：外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶［10］。研究表明，不同的微生物所產纖維素酶不同，多種微生物混合培養可以產生協同效應，明顯提高纖維素的降解效率［11-13］。另外，影響酶活力的因素較多，如酶的濃度、底物的結構和性質、pH值、反應溫度等［14-15］。本文從蔗渣堆肥中篩選得到8株纖維素分解菌，初步分析了其部分酶學性質，但菌株間的復合方式、相互作用以及發酵影響因素還有待進一步研究。

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（本篇責任編校：李金玉）

Screening， Identification and Enzyme Activity Assay of Bagasse Celluloytic Microbes

HUANG Hui-juan1， FANG Jie-qun1， CHEN Hua-wen2， CHEN Di-wen1， HUANG Ying1， HUANG Zhen-rui1，JIANG Yong1
（1Guangzhou Sugarcane Industrial Research Institute/Guangdong Key Lab of Sugarcane Improvement & Biorefinery，Guangzhou 510316；2Guangdong Suixi County Bureau of Agriculture， Suixi 524300）

In order to make full use of bagasse， this study was conducted to screen high efficient bagasse degradation microorganisms from compost.8 strains of fungi with significant transparent circles and cellulase activity were screened and 3 of them were selected to determine the activity of carboxymethyl cellulase （CMCase） and filter paper activity （FPA）.The results showed that the size of transparent circle and the activity of CMCase and FPA of SC8 were the highest among the 8 screened strains.Based on morphology analysis， the fungus SC8 was initially classified into the genus of Aspergillus.Correlation analysis showed that the size of transparent circle was in significant positive correlation with the activity of CMCase and FPA （p＜0.01）.

Bagasse； Celluloytic microbes； Cellulase； Filter paper activity

S566.1

A

1005-9695（2016）03-0042-04

2016-04-14；

2016-06-13

南方高蓄能作物養分資源綜合管理創新能力建設（2015B070701001）；南方高稈作物農用化學品減量化關鍵技術創新能力建設（2014B070706005）；現代甘蔗育種創新能力建設（2014B070705002）；國家現代農業產業技術體系甘蔗專項（CARS-20-3-1）作者簡介：黃惠娟（1985-），女，助理農藝師，主要從事功能微生物篩選利用及科研管理等工作；Email：iue123@163.com

江永（1961-），男，碩士，研究員，主要從事甘蔗耕作與栽培、廢棄物資源化利用等工作；Email：gz510316@sina.com

黃惠娟，方界群，陳華文，等.蔗渣纖維素分解菌的篩選、鑒定及酶活的測定［J］.甘蔗糖業，2016（3）：42-45.