小麥蛋白磷酸酶2A基因TaPP2AbB″-α啟動(dòng)子的克隆及表達(dá)分析

扆 珩李 昂劉惠民景蕊蓮，*

1山西大學(xué)生物工程學(xué)院， 山西太原 030006；2農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程 / 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081

小麥蛋白磷酸酶2A基因TaPP2AbB″-α啟動(dòng)子的克隆及表達(dá)分析

扆 珩1， 2李 昂2劉惠民1景蕊蓮2，*

1山西大學(xué)生物工程學(xué)院， 山西太原 030006；2農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程 / 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081

植物蛋白磷酸酶2A （protein phosphatase 2A， PP2A）由結(jié)構(gòu)亞基A、調(diào)節(jié)亞基B和催化亞基C組成， 在應(yīng)答逆境脅迫途徑中發(fā)揮著重要作用。小麥基因TaPP2AbB″-α是調(diào)節(jié)亞基亞家族B″的成員， 過(guò)量表達(dá)該基因可以促進(jìn)擬南芥的根系生長(zhǎng)及側(cè)根發(fā)育， 在鹽脅迫和滲透脅迫條件下的作用更顯著。本研究從小麥（Triticum aestivum L.）抗旱品種“旱選10號(hào)”基因組中克隆了TaPP2AbB″-α基因的啟動(dòng)子PB″α， 序列長(zhǎng)度為1899 bp， 含有TATA-box和CAAT-box，以及響應(yīng)干旱和滲透脅迫的順式作用元件EECCRCAH1 （-1058 bp至-1052 bp）、GCCCORE （-1073 bp至-1068 bp）和MYCCONSE （-1179 bp至-1174 bp）。將啟動(dòng)子PB″α和5種5′端缺失啟動(dòng)子片段與報(bào)告基因GUS （β-glucuronidase）連接后轉(zhuǎn)化擬南芥， 組織化學(xué)染色結(jié)果顯示 PB″α在植株的葉片和根中均有表達(dá)。5′端缺失分析表明缺失片段PB″α-1545和PB″α-1389具有啟動(dòng)子活性， 活性區(qū)域位于-1389 bp和-946 bp之間。GUS定量分析結(jié)果顯示， 在鹽和滲透脅迫條件下， PB″α、PB″α-1545和PB″α-1389的活性顯著上升。本研究表明PB″α具有較強(qiáng)的啟動(dòng)子基本活性， 并且在鹽脅迫及滲透脅迫條件下活性顯著上升， 該結(jié)果為合理選用啟動(dòng)子改良作物提供了依據(jù)。

小麥； 蛋白磷酸酶2A； 啟動(dòng)子； 順式作用元件； GUS組織化學(xué)染色； GUS定量分析

非生物脅迫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素，為減少脅迫損傷， 植物體能調(diào)動(dòng)多種基因應(yīng)答逆境脅迫。這些基因分為兩大類， 一類是功能基因， 例如水通道蛋白、蛋白酶、解毒酶基因等； 另一類是調(diào)節(jié)基因， 包括蛋白激酶、蛋白磷酸酶、轉(zhuǎn)錄因子基因等［1］。蛋白磷酸酶 2A （protein phosphatase 2A，PP2A）是一類重要的絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）蛋白磷酸酶， 可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活動(dòng)， 例如轉(zhuǎn)錄、翻譯、新陳代謝和細(xì)胞凋亡等［2-3］， 參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)，如ABA信號(hào)、油菜素內(nèi)酯信號(hào)、生長(zhǎng)素信號(hào)等［4-6］，同時(shí)PP2A參與對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)并發(fā)揮重要作用。例如， 在滲透脅迫條件下， 擬南芥PP2A通過(guò)作用于生長(zhǎng)素的重新分配正向調(diào)節(jié)植株根系建成［7］。擬南芥PP2Aa1、PP2A-C3和PP2A-C4參與生長(zhǎng)素信號(hào)途徑， pp2aa1突變體、pp2a-c3/pp2a-c4雙突變體的生長(zhǎng)發(fā)育嚴(yán)重受阻； PP2Ac1、PP2Ac2和PP2Ac5參與逆境、ABA和油菜素內(nèi)脂信號(hào)途徑［4，6］。小麥TaPP2Ac-1對(duì)于干旱脅迫有明顯響應(yīng)［8］。

PP2A是由結(jié)構(gòu)亞基A （PP2Aa）、調(diào)節(jié)亞基B （PP2Ab）和催化亞基C （PP2Ac）構(gòu)成的異三聚體蛋白磷酸酶。調(diào)節(jié)亞基PP2Ab控制底物與催化亞基活性位點(diǎn)的結(jié)合， 有4個(gè)家族， 分別是B （B55、PR55、PPP2R2）、B′ （B56、PR61、PPP2R5）、B″ （PR72、PPP2R3）和B′′ （PR93/PR110）［9］。對(duì)PP2Ab的研究，首先是在動(dòng)物上開(kāi)展的［10-11］， 而在植物上的研究相對(duì)滯后。目前， 已報(bào)道擬南芥有17個(gè)PP2Ab基因， 包括2個(gè)PP2AbB基因， 9個(gè)PP2AbB′基因， 5個(gè)PP2AbB″基因和1個(gè)PP2AbB′′基因［12-13］。擬南芥TAP46的表達(dá)受低溫誘導(dǎo)并在冷脅迫信號(hào)途徑中發(fā)揮作用［14］； 在水稻、谷子和二穗短柄草中， 關(guān)于調(diào)節(jié)亞基B″-α的基因序列信息已有描述， 但這些基因的功能還不明確。小麥B″亞家族基因TaPP2AbB″-α受多種逆境脅迫上調(diào)表達(dá)， 過(guò)表達(dá)TaPP2AbB″-α轉(zhuǎn)基因擬南芥在滲透脅迫下側(cè)根數(shù)目增多， 生長(zhǎng)情況明顯優(yōu)于野生型［15］。

轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是植物基因表達(dá)調(diào)控的重要方式之一， 由多種順式作用元件和反式作用因子共同協(xié)調(diào)， 基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件對(duì)基因轉(zhuǎn)錄具有關(guān)鍵的調(diào)控作用。作為一種重要的分子工具，啟動(dòng)子已廣泛地應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域， 例如， 利用CaMV35S等組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中過(guò)表達(dá)［16］， 利用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)抗性基因在逆境條件下表達(dá)， 使作物表現(xiàn)出抗旱、抗寒及耐鹽堿等優(yōu)良性狀。在高等植物中已報(bào)道了很多重要啟動(dòng)子， 如逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子RD29A可以有效地提高矮牽牛對(duì)干旱脅迫的抗性［17］； 用啟動(dòng)子Oshox24調(diào)控OsNAC6過(guò)表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因水稻抗旱耐鹽性， 并且沒(méi)有明顯的生長(zhǎng)缺陷［18］。擬南芥冷調(diào)節(jié)基因cor15a和cor15b的啟動(dòng)子都響應(yīng)低溫， 5′端缺失分析表明順式作用元件的側(cè)翼序列影響啟動(dòng)子活性［19］。研究植物抗逆基因啟動(dòng)子活性有助于了解基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制， 并有效調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)水平［20］。然而， 迄今為止尚未見(jiàn)到調(diào)控PP2A基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)啟動(dòng)子的相關(guān)報(bào)道。

為揭示小麥TaPP2AbB″-α基因啟動(dòng)子的功能區(qū)與活性， 本研究以小麥品種“旱選10號(hào)”為材料， 克隆TaPP2AbB″-α基因的啟動(dòng)子PB″α， 分析其順式作用元件， 構(gòu)建一系列5′端缺失的啟動(dòng)子片段， 通過(guò)轉(zhuǎn)化擬南芥分析其活性區(qū)域。研究表明， 轉(zhuǎn)化啟動(dòng)子PB″α和5′端缺失片段PB″α-1545、PB″α-1389的轉(zhuǎn)基因幼苗可以被X-Gluc染色， 具有啟動(dòng)子活性， 鹽脅迫及滲透脅迫處理后轉(zhuǎn)基因幼苗GUS活性顯著升高。研究結(jié)果為合理應(yīng)用TaPP2AbB″-α基因提供了依據(jù)。

1　材料與方法

1.1植物材料

利用本實(shí)驗(yàn)室保存的小麥品種“旱選10號(hào)”克隆TaPP2AbB″-α啟動(dòng)子， 擬南芥（Arabidopsis thaliana，哥倫比亞3型）用于啟動(dòng)子重組載體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與功能驗(yàn)證。將萌發(fā)的小麥種子置光照培養(yǎng)箱中， 23℃培養(yǎng) 6 d， 利用 CTAB法［21］從幼苗葉片中提取基因組DNA。

1.2TaPP2AbB″-α啟動(dòng)子克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

以TaPP2AbB″-α編碼區(qū)序列為探針， BLAST搜索小麥A基因組供體種烏拉爾圖小麥（T. urartu）基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），將該基因上游2 kb左右序列作為目標(biāo)區(qū)域， 命名為PB″α。以旱選10號(hào)的基因組DNA為模板擴(kuò)增PB″α，利用高保真酶TransStart Fast Pfu DNA polymerase （TRANSGEN， 北京）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為5×buffer 4 μL， dNTP （2.5 μmol L-1） 2 μL， 模板DNA （50 ng μL-1） 1 μL， 引物 PB″α-F （10 μmol L-1） 1 μL，PB″α-R （10 μmol L-1） 1 μL （引物序列見(jiàn)表1），TransStart Fast Pfu 0.5 μL， 用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?55℃min； 9545 s， 5645 s， 7230℃℃℃s， 36個(gè)循環(huán)； 72℃10 min 。

將擴(kuò)增得到的序列 PB″α與植物過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1391 （由本實(shí)驗(yàn)室保存）分別用BamH I、Hind III酶切后進(jìn)行連接， 獲得重組質(zhì)粒 p1391-PB″α（圖1）。

圖1　p1391-PB″α表達(dá)載體構(gòu)建示意圖Fig. 1 Flow chart for construction of the p1391-PB″α expression vector

1.3啟動(dòng)子順式作用元件分析及預(yù)測(cè)

利用在線順式作用元件分析工具 PLACE （http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.htm）和PlantCARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）分析啟動(dòng)子序列， 預(yù)測(cè)順式作用元件。

1.45′端缺失片段的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)對(duì) PB″α啟動(dòng)子順式元件的預(yù)測(cè)結(jié)果設(shè)計(jì)引物， 通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得一系列5′端缺失啟動(dòng)子片段。正向引物分別為 PB″α-1545-F、PB″α-1389-F、PB″α-945-F、PB″α-483-F和 PB″α-150-F， 反向引物為PB″α-R； 正向引物加入Hind III酶切位點(diǎn)， 反向引物加入 BamH I酶切位點(diǎn)， 引物序列見(jiàn)表 1。以p1391-PB″α質(zhì)粒為模板， 按上述 PB″α序列擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR。擴(kuò)增體系為5× buffer 4 μL， dNTP （2.5 μmol L-1） 2 μL， 模板DNA （50 ng μL-1） 1 μL， PB″α-F （10 μmol L-1） 1 μL， PB″α-R （10 μmol L-1） 1 μL，TransStart Fast Pfu 0.5 μL， 用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。將擴(kuò)增產(chǎn)物與植物過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1391分別用BamH I、Hind III酶切后進(jìn)行連接， 獲得重組載體質(zhì)粒， 經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101菌株。

1.5擬南芥轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性植株檢測(cè)

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥。經(jīng)潮霉素抗性篩選后獲得 T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥。取 T1代轉(zhuǎn)基因植株幼苗葉片， 利用 CTAB法提取基因組DNA， 并以此為模板通過(guò) PCR擴(kuò)增檢測(cè)陽(yáng)性植株，擴(kuò)增引物為hyg-F和hyg-R （表1）， 產(chǎn)物大小為841 bp。選取 PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的單株收獲種子并加代，再經(jīng)抗性篩選得到T3代純合轉(zhuǎn)基因株系。

表1　本實(shí)驗(yàn)中所用引物序列Table 1 Primers used in this study

1.6GUS組織化學(xué)染色

取野生型和 T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株種子， 用10% NaClO溶液表面消毒后， 分別點(diǎn)播于MS培養(yǎng)基上， 4℃春化處理2 d， 然后將培養(yǎng)皿垂直放于人工氣候室（16 h光照/8 h黑暗， 21℃/19℃）中， 培養(yǎng)至第8天， 選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色［22-23］。用未加入X-Gluc的GUS染液（含10 mmol L-1EDTA，100 mmol L-1NaH2PO4·H2O， 0.5% Triton X-100， 1 mmol L-1K3Fe（CN）6， 1 mmol L-1K4Fe（CN）6·3H2O，20%甲醇， 0.5 mg mL-1X-Gluc）洗滌幼苗1～2次， 然后將幼苗轉(zhuǎn)移到 1.5 mL離心管中， 加入適量 GUS染液浸沒(méi)全部植株， 37℃保溫24 h， 除去染液； 再用75%乙醇37℃脫色3～5 h， 其間更換75%乙醇2～3次，于75%乙醇中4℃保存。

1.7GUS熒光定量分析

將轉(zhuǎn)入不同啟動(dòng)子缺失片段的 10日齡幼苗進(jìn)行4種脅迫處理， 即50 mmol L-1NaCl、300 mmol L-1甘露醇、4℃低溫和100 μmol L-1ABA處理。處理72 h后， 分別取葉片和根組織100 mg， 加入液氮研磨成粉， 加入1 mL粗蛋白提取緩沖液（pH 7.0的磷酸緩沖液50 mmol L-1、β-巰基乙醇10 mmol L-1、EDTA l0 mmol L-1、0.1% Triton X-100和0.1% Sodium Lauryl Sarcosine）， 以渦旋振蕩儀振蕩混勻， 于4℃下16 200 × g離心15 min。取上清液即GUS粗蛋白50 μL， 加入37℃預(yù)熱的GUS反應(yīng)底物MUG （2 mmol L-1） 250 μL， 37℃保溫 1 h， 以 0.2 mol L-1Na2CO31500 μL 終止反應(yīng)。使用熒光儀（Hoefer DyNA Quant 200）， 激發(fā)光365 nm， 發(fā)射光455 nm，參照Bradford［24］的方法測(cè)定蛋白含量。

2　結(jié)果與分析

2.1TaPP2AbB″-α啟動(dòng)子PB″α克隆及轉(zhuǎn)化擬南芥

以旱選10號(hào)基因組DNA為模板， PCR擴(kuò)增得到1899 bp的TaPP2AbB″-α啟動(dòng)子片段（圖2）， 命名為PB″α。將該擴(kuò)增產(chǎn)物及植物表達(dá)載體pCAMBIA 1391分別用BamH I和Hind III雙酶切后連接， 經(jīng)酶切檢測(cè)和測(cè)序驗(yàn)證獲得正確的重組載體。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥， 獲得轉(zhuǎn)基因植株。

圖2　小麥TaPP2AbB″-α基因啟動(dòng)子PB″α的克隆Fig. 2 Amplified fragment of TaPP2AbB″-α gene promoter PB″α in wheat M： DMarker III.

2.2PB″α啟動(dòng)子順式作用元件分析及功能預(yù)測(cè)

采用啟動(dòng)子順式作用元件分析工具 PLACE （http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.htm）和PlantCARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）分析啟動(dòng)子PB″α的順式作用元件。結(jié)果顯示全長(zhǎng) PB″α啟動(dòng)子包含多種順式作用元件（圖3）， 基本的調(diào)控元件為TATA-box、CAAT-box， 此外還包含多種逆境響應(yīng)元件， 如低溫及干旱響應(yīng)元件LTR， 脫水響應(yīng)元件MYCCONSE， 逆境及乙烯響應(yīng)元件 GCCCORE， 干旱誘導(dǎo)的 MYB結(jié)合元件EECCRCAH1以及ABA響應(yīng)元件ABRE， 赤霉素響應(yīng)元件GARE， 茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif，水楊酸響應(yīng)元件TCA-element等（表2）。

圖3　啟動(dòng)子PB″α序列及預(yù)測(cè)的順式作用元件Fig. 3 Sequence and predicted cis-acting elements of promoter PB″α

表2　啟動(dòng)子PB″α序列中的順式作用元件及預(yù)測(cè)的功能Table 2 The cis-acting elements and predicted functions in the promoter PB″α sequence

根據(jù)對(duì)啟動(dòng)子PB″α的生物信息學(xué)分析結(jié)果， 結(jié)合不同順式作用元件在啟動(dòng)子區(qū)的分布情況和功能預(yù)測(cè)， 對(duì)PB″α啟動(dòng)子進(jìn)行5′端缺失截段， 5個(gè)缺失啟動(dòng)子片段所含元件見(jiàn)圖4。以p1391-PB″α重組質(zhì)粒為模板， 通過(guò)設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng) PCR引物， 擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為1545、1389、945、483和150 bp的5個(gè)缺失片段（圖5），依次命名為PB″α-1545、PB″α-1389、PB″α-945、PB″α-483和PB″α-150。

將這5個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物分別用BamH I和Hind III雙酶切后， 連接表達(dá)載體pCAMBIA1391， 構(gòu)建PB″α啟動(dòng)子5′端缺失表達(dá)載體， 并通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥。

2.3擬南芥GUS組織化學(xué)染色

經(jīng)潮霉素篩選和PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的單株收獲種子并加代（圖6）， 獲得T3代純合轉(zhuǎn)基因株系。分別取野生型和T3代純合轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色， 過(guò)量表達(dá)p1391-PB″α和 p1391-PB″α-1545、p1391-PB″α-1389的擬南芥幼苗葉片和根均被 GUS染色（圖7）。可見(jiàn)， 在轉(zhuǎn)基因擬南芥中， 啟動(dòng)子PB″α 和 5′端缺失片段 PB″α-1545、PB″α-1389可以驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)， 具有啟動(dòng)子活性， 結(jié)果顯示PB″α的-1389至-946 bp區(qū)段是啟動(dòng)子的活性區(qū)域。

2.4不同脅迫條件下的GUS定量分析

對(duì)含有不同啟動(dòng)子片段的擬南芥株系進(jìn)行脅迫處理， 分析不同脅迫條件下各啟動(dòng)子片段的表達(dá)情況。與無(wú)脅迫對(duì)照相比， 經(jīng)NaCl、甘露醇處理后， 轉(zhuǎn)PB″α和5′端缺失片段PB″α-1545、PB″α-1389的擬南芥幼苗GUS活性顯著升高， 而其他5′端缺失片段轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS活性沒(méi)有顯著變化。經(jīng)低溫（4）℃和ABA處理后的擬南芥GUS活性與對(duì)照相比均無(wú)顯著差異（圖8）， 表明啟動(dòng)子PB″α的-1389至-946 bp區(qū)段是應(yīng)答NaCl、甘露醇處理的活性區(qū)。

圖4　PB″α啟動(dòng)子5′端缺失片段順式作用元件示意圖Fig. 4 Schematic show of cis-acting elements in 5′-truncated promoter PB″α

圖5　啟動(dòng)子5′端缺失擴(kuò)增片段Fig. 5 Amplified fragment of 5′-truncated promotersM： DMarker III； 1： PB"α-1545； 2： PB"α-1389； 3： PB"α-945；4： PB"α-483； 5： PB"α-150.

圖6　T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR檢測(cè)Fig. 6 PCR analysis of T1transgenic Arabidopsis linesM： DMarker III； 1-3： PB"α； 4-6： PB"α-1545； 7-9： PB"α-1389； 10-12： PB"α-945； 13-15： PB"α-483； 16-18： PB"α-150.

圖7　野生型和T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗GUS染色Fig. 7 Histochemical GUS staining of wild-type （WT） and T3transgenic Arabidopsis plants

圖8　脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS定量分析Fig. 8 Quantification of GUS activity in transgenic Arabidopsis under different stresses*和**分別表示脅迫處理與對(duì)照（CK）在0.05和0.01概率水平的差異顯著（t檢驗(yàn)）。* and ** indicate significant difference between stress treatment and the control （CK） at the 0.05 and 0.01 probability levels， respectively （t-test）.

3　討論

目前， 研究啟動(dòng)子的方法主要有生物信息學(xué)分析及實(shí)驗(yàn)分析兩種。利用生物信息學(xué)分析啟動(dòng)子序列， 預(yù)測(cè)其中的順式作用元件種類、數(shù)目及位置， 可以為進(jìn)一步確定啟動(dòng)子的功能奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)分析主要有瞬時(shí)表達(dá)、5′端缺失分析［25］、凝膠阻滯［26］和酵母單雜交［27］等方法。本研究采用生物信息學(xué)分析和 5′端缺失分析相結(jié)合的方法， 研究 TaPP2AbB″-α基因啟動(dòng)子的表達(dá)特性、活性區(qū)域和重要順式作用元件。

通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)， 在 TaPP2AbB″-α啟動(dòng)子區(qū)存在多種重要的非生物脅迫應(yīng)答元件， 例如響應(yīng)干旱、低溫等逆境的元件等。通過(guò) 5′端缺失分析和轉(zhuǎn)基因擬南芥 GUS組織化學(xué)染色確定，TaPP2AbB″-α啟動(dòng)子-1389至-946 bp區(qū)段是其活性核心區(qū)域， 同時(shí)生物信息學(xué)分析結(jié)果也表明， 該活性區(qū)域中包含了響應(yīng)干旱和滲透脅迫的順式作用元件 EECCRCAH1 （-1058至-1052 bp）、GCCCORE （-1073至-1068 bp）和MYCCONSE （-1179至-1174 bp）。而在缺失了這段活性核心區(qū)域后， 剩余啟動(dòng)子片段無(wú)法驅(qū)動(dòng)GUS基因在植物體內(nèi)表達(dá)。上述結(jié)果表明945 bp長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段上可能有負(fù)調(diào)控元件，抑制啟動(dòng)子的活性； 同時(shí)由于缺少-1389至-946 bp的啟動(dòng)子核心活性區(qū)域， 啟動(dòng)子基本活性無(wú)法表達(dá)，其具體原因還有待研究。Chakravarthy等［28］對(duì)番茄轉(zhuǎn)錄因子Pti4的研究發(fā)現(xiàn)， Pti4通過(guò)結(jié)合順式作用元件 GCC-box來(lái)調(diào)控防御基因的表達(dá)； 擬南芥AtMYC2和AtMYB2轉(zhuǎn)錄因子與MYC、MYB啟動(dòng)子識(shí)別位點(diǎn)特異性結(jié)合可誘導(dǎo)對(duì)干旱及 ABA響應(yīng)基因的表達(dá)［29］； Kim 等［30］發(fā)現(xiàn)在擬南芥中， 順式作用元件LTR （C/DRE）響應(yīng)干旱及低溫脅迫。為了驗(yàn)證TaPP2AbB″-α啟動(dòng)子活性區(qū)域內(nèi)順式作用元件的功能， 我們對(duì)轉(zhuǎn) 5′端缺失片段啟動(dòng)子擬南芥進(jìn)行四種脅迫處理， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在NaCl和甘露醇處理后， 具有活性區(qū)域啟動(dòng)子片段PB″α-1545、PB″α-1389擬南芥的GUS表達(dá)量顯著升高， 表明啟動(dòng)子活性區(qū)域內(nèi)的順式作用元件響應(yīng)鹽脅迫和滲透脅迫， 驗(yàn)證了TaPP2AbB″-α基因啟動(dòng)子PB″α的活性區(qū)域。

通常情況下， 啟動(dòng)子特性與基因功能緊密相連。干旱條件下， 擬南芥RD29A與RD29B基因啟動(dòng)子的活性顯著增強(qiáng)［31］； 來(lái)自水稻的WRKY71基因和硬粒小麥Cor39基因的低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以增強(qiáng)植物抗寒性， 減輕低溫傷害［32］； 高鹽條件下， 水稻脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Wsi18在根和葉中特異表達(dá)［33］。旱選10號(hào)是小麥強(qiáng)抗旱品種， 本實(shí)驗(yàn)室從該品種基因組中克隆得到的TaPP2AbB″-α基因過(guò)量表達(dá)可增強(qiáng)擬南芥植株的耐鹽性和抗旱性［15］。本研究不僅驗(yàn)證了我們前期的研究結(jié)果， 而且揭示了 TaPP2AbB″-α啟動(dòng)子響應(yīng)鹽和滲透脅迫的活性區(qū)域， 為進(jìn)一步合理選用啟動(dòng)子對(duì)作物的抗逆性進(jìn)行遺傳改良提供了依據(jù)和技術(shù)支持。

4　結(jié)論

從小麥抗旱品種旱選10號(hào)基因組DNA中克隆了TaPP2AbB″-α基因的啟動(dòng)子PB″α， 全長(zhǎng)1899 bp，其活性核心區(qū)位于-1389 bp至-946 bp區(qū)段， 該區(qū)域內(nèi)包含了響應(yīng)干旱和滲透脅迫的順式作用元件EECCRCAH1、GCCCORE和MYCCONSE。NaCl或甘露醇處理 72 h后， 轉(zhuǎn) PB″α、PB″α-1545和PB″α-1389擬南芥的GUS活性顯著升高， 驗(yàn)證了啟動(dòng)子活性區(qū)的功能。本研究結(jié)果為合理選用啟動(dòng)子以改良作物提供了依據(jù)。

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Cloning and Expression Analysis of Protein Phosphatase 2A Gene TaPP2AbB″-α Promoter in Wheat

YI Heng1，2， LI Ang2， LIU Hui-Min1， and JING Rui-Lian2，*1College of Bioengineering， Shanxi University， Taiyuan 030006， China；2National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Institute of Crop Science， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China

Protein phosphatase 2A （PP2A） is a heterotrimeric protein， consisting of a scaffolding subunit （A）， a catalytic subunit（C）， and a member of four families of regulatory subunits （B）. PP2A plays significant roles in the pathway responding to abiotic stresses in plants. TaPP2AbB″-α， a member of regulatory subunit B″ in wheat （Triticum aestivum L.）， enhanced root development and could develop more lateral roots in the gene overexpressed Arabidopsis， especially under the osmotic stresses of mannitol and NaCl. In order to elucidate transcriptional regulatory mechanism of the promoter PB″α of TaPP2AbB″-α， we isolated an 1899 bp full-length sequence of promoter PB″α from a drought-tolerant wheat cultivar Hanxuan 10. The PB″α sequence contained TATA-box， CAAT-box and a series of cis-acting elements responding to drought and osmotic stresses， such as elements of EECCRCAH1 （from -1058 to -1052 bp）， GCCCORE （from -1073 to -1068 bp） and MYCCONSE （from -1179 to -1174 bp）. The full-length promoter PB″α and five 5′-end truncated PB″α promoters in different lengths fused with the reporter gene β-glucuronidas （GUS） were transformed into Arabidopsis， respectively. The histochemical staining results showed that the full-length promoter PB″α， and the deletion fragments of PB″α-1545 and PB″α-1389 could drive GUS gene expression in shoots and roots of transgenic Arabidopsis seedlings. As the result of quantitative fluorometric GUS assay， only the expression of PB″α，PB″α-1545 and PB″α-1389 could be up-regulated by salt and osmotic stresses in transgenic Arabidopsis lines， and the active region of PB″α promoter was located in the interval between -1389 bp and -946 bp. In conclusion， PB″α has strong basic promoteractivity which is up-regulated significantly by salt and osmotic stresses. These findings contribute to the selection of a suitable promoter for crop improvement.

Wheat； PP2A； Promoter； cis-acting Element； GUS histochemical staining； Quantitative fluorometric GUS assay

10.3724/SP.J.1006.2016.01282

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201206）和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程項(xiàng)目資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China （31201206） and the Agricultural Science and Technology Innovation Program （CAAS）.

（Corresponding author）： 景蕊蓮， E-mail： jingruilian@caas.cn， Tel： 010-82105829

聯(lián)系方式： E-mail： yiheng1127@126.com

Received（）： 2016-02-05； Accepted（接受日期）： 2016-05-09； Published online（網(wǎng)絡(luò)出版日期）： 2016-06-06.

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160606.1616.008.html