蔭蔽脅迫下大豆莖稈形態建成的轉錄組分析

任夢露劉衛國，*劉 婷杜勇利鄧榆川鄒俊林袁 晉楊文鈺， *

1四川農業大學生態農業研究所 / 農業部西南作物生理生態與耕作重點實驗室， 四川成都 611130；2彭州市農村發展局， 四川彭州611930；3成都市種子管理站， 四川成都， 610041

蔭蔽脅迫下大豆莖稈形態建成的轉錄組分析

任夢露1劉衛國1，*劉 婷1杜勇利1鄧榆川1鄒俊林2袁 晉3楊文鈺1， *

1四川農業大學生態農業研究所 / 農業部西南作物生理生態與耕作重點實驗室， 四川成都 611130；2彭州市農村發展局， 四川彭州611930；3成都市種子管理站， 四川成都， 610041

玉米-大豆套作種植模式是國家農業重點推廣技術， 研究該模式下大豆莖稈對蔭蔽脅迫響應的分子機制將有助于大豆耐蔭性的分子遺傳改良。利用轉錄組測序技術分析蔭蔽脅迫對南豆12和南032-4大豆莖稈轉錄基因表達的影響， 結果表明， 蔭蔽條件下， 南豆12和南032-4分別有287個和110個差異轉錄基因， 皆以上調為主。基因功能注釋分析顯示， 這些基因主要富集于次生細胞壁的生物起源、多糖的合成、鈣調素結合和水解酶活性等生物過程中。蔭蔽條件下， 南豆12響應木質素、生長素合成的相關基因上調， 南032-4響應茉莉酸、乙烯合成的相關基因上調， 響應赤霉素代謝的相關基因則下調， 但南豆12表現出更多的差異轉錄基因。大豆莖稈積極響應蔭蔽信號， 增加莖稈細胞壁多糖， 加快次生細胞壁的生成， 從而阻礙莖稈橫向生長， 使大豆莖稈變細， 同時增加水解酶活性， 加快細胞的松弛， 使大豆莖稈伸長。南豆12和南032-4也通過各自特有的差異轉錄基因響應蔭蔽， 但南豆12通過更多地增加細胞壁多糖、木質素含量以及對生長素的響應等來增加莖稈強度， 保持莖稈一定的形態優勢， 最終提高自身抗倒伏能力，表現出對蔭蔽更強的適應性。

大豆； 套作； 蔭蔽脅迫； 莖稈； 轉錄組

近年來， 玉米-大豆套作種植模式在我國西南地區大面積推廣， 擴大了大豆種植面積， 增加了我國大豆供給， 成為振興我國大豆產業的新途徑［1-2］。如今， 玉米-大豆帶狀復合種植技術更是列為國家農業重點推廣技術。在玉米-大豆套作種植模式下， 大豆苗期與玉米共生， 大豆冠層的透光率降低［3］， 導致大豆出現避蔭反應， 植株莖稈變細， 節間過度伸長，容易出現倒伏， 最終影響大豆生長發育及產量和品質［4-7］。莖稈性狀作為影響大豆倒伏的最主要因素，其形態生理、生物力學等特征與抗倒性密切相關［8-9］。細胞壁是植物細胞的重要結構， 不但維持細胞形態，決定細胞壁強度， 還參與細胞分化、信號轉導等生理過程， 其結構、成分和狀態與植物細胞的伸長緊密相關， 而植物細胞的伸長又與植物的個體生長有密切的關系［10］。木質素作為細胞壁主要組成成分之一， 對維持莖稈機械強度以及抵御不良環境具有明顯的促進作用［11-12］。鄒俊林等［13］研究表明， 套作大豆苗期木質素含量與倒伏率呈顯著負相關。細胞壁中的纖維素和半纖維素含量的變化與細胞延伸生長有關， 而果膠組分的變化與細胞壁松弛有關［14］， 內切木葡聚糖轉糖基酶（XET）則是一種細胞壁松弛酶，屬于木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶（XTH）類， 有水解和形成糖苷鍵的雙重功能［15］。同時， 在植株生長發育過程中， 激素亦扮演著重要角色。研究表明赤霉素和生長素促進莖稈細胞伸長［16-17］， 茉莉酸和乙烯均能參與植物的逆境脅迫［18-19］。

轉錄組代表細胞或組織內全部的RNA轉錄本（RNA transcript）， 反映不同生命階段、不同組織類型、不同生理狀態以及不同環境條件下表達的基因。近年來， 高通量轉錄組測序技術的不斷發展和完善為開展不同生物功能基因組學研究提供了全新的思路和方法［20］。應用轉錄組測序篩選出逆境脅迫下差異表達基因， 分析基因的功能， 不僅能使我們更好地理解作物響應及耐受脅迫的分子機制， 也為利用這些基因對作物進行定向遺傳改良以提高作物的抗脅迫能力奠定一定的基礎［21-22］。目前， 轉錄組測序在大豆結瘤發育［23］、種子發育［24］、花發育［25］等方面已有一定研究， 但在蔭蔽脅迫下對大豆莖稈進行轉錄組測序分析還尚未見報道。本研究利用轉錄組測序技術分析蔭蔽脅迫下大豆莖稈中基因表達的差異，并對極顯著基因作進一步分析， 旨在探討大豆響應蔭蔽脅迫的分子基礎， 為利用分子生物學技術和基因工程手段提高大豆耐蔭抗倒性奠定基礎。

1　材料與方法

1.1試驗設計

強耐蔭性品種南豆12 （西南地區套作大豆主推品種， 四川省南充市農業科學院選育）和弱耐蔭性品種南032-4 （四川省南充市農業科學院育種材料）［13，26］，均由四川農業大學作物栽培學與耕作學大豆課題組提供。沙質土pH 6.55， 含有機質8.96 g kg-1， 全氮1.21 g kg-1， 全磷0.61 g kg-1， 全鉀11.44 g kg-1， 堿解氮62.35 mg kg-1， 速效磷25.34 mg kg-1， 速效鉀65.70 mg kg-1。

于2014年7月至8月在四川農業大學雅安科研教學園區（29°59′ N， 103°00′ E）進行試驗。采用兩因素隨機區組設計， 因素一為光照處理， 即全光照和遮蔭65%處理； 因素二為大豆材料， 即南豆12和南032-4， 共4個處理， 3次重復。盆缽直徑40 cm， 高35 cm， 每盆裝20 kg沙質土， 盆播5穴， 穴留2株。大豆幼苗第一片復葉全展開時使用遮陽網進行遮陰處理，透光率為35%。出苗30 d后， 于14：30至15：30取樣， 截取大豆頂端幼嫩部分莖稈樣品， 速凍于液氮中， 帶回實驗室-80℃冰箱保存。

1.2RNA的提取、純化和質檢

采用RNAqueous phenol-free total RNA Reagent （Cat#AM1912， Ambion）根據生產廠商提供的標準操作流程抽提樣品的總RNA， 經Agilent Bioanalyzer 2100 （Agilent technologies， Santa Clara， CA， US）電泳質檢合格后使用RNeasy Micro Kit （Cat#74004，QIAGEN， GmBH， Germany）和RNase-Free DNase Set （Cat#79254， QIAGEN， GmBH， Germany）純化總RNA。經NanoDrop ND-2000分光光度計及Agilent Bioanalyzer 2100 （Agilent technologies， Santa Clara，CA， US）質檢， 合格的RNA可用于后續的測序實驗。

1.3RNA的測序

在200 μL PCR管中加入質量合格的樣品RNA和Fragmentation buffer （LC-Bio）， 94℃反應8 min， 將mRNA隨機打斷成片段； 用隨機引物和逆轉錄酶將RNA片段反轉成cDNA第1鏈片段， 并合成第2鏈cDNA； 接著對雙鏈cDNA片段進行末端修復及3′末端加‘A'堿基， 并將DNA片段兩端連接上特定的測序接頭； 最后通過PCR擴增對cDNA富集純化， 完成測序樣本文庫構建； 使用Qubit 2.0 Fluorometer檢測所建文庫濃度， Agilent2100檢測文庫的大小。按照cBot User Guide所示相應流程， 在Illummina HiSeq 2500測序儀配套的cBot上完成 Cluster生成和第一向測序引物雜交； 按照HiSeq 2500 User Guide準備測序試劑， 將攜有cluster的flow cell上機（HiSeq 2500型，Illumina）， 選用paired-end程序， 進行2×100 nt multiplex測序， 測序過程由Illumina提供的data collection software進行控制， 并進行實時數據分析。文庫的構建和測序均由上海伯豪生物技術有限公司完成。

1.4RNA-Seq序列的分析

利用Illumina 平臺將測序所得的圖像數據轉化為相應的核苷酸序列數據， 通過 fastx （version：0.0.13， http：//hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/index. html）去除測序過程中低質量的序列和不確定的序列（Q ＜ 20）。采用 tophat （version： 2.0.9）的 spliced mapping算法對預處理后 reads進行 Genome mapping。通過 Genome mapping去除重復序列， 應用cufflinks （version： 2.1.1）對tophat的mapping結果進行基因定量。通過FPKM方法使轉錄水平規范化。差異表達基因篩選標準為表達倍數 Fold change≥2或≤0.5 （表達上調或下調）， FDR （False discover rate）＜ 0.05。把所挑選的差異表達基因向Gene Ontology數據庫的各個條目（term）映射， 并進行Gene Ontology分析， corrected P-value （FDR）≤0.05為閾值， 滿足此條件的 GO term定義為在差異表達基因中顯著富集的GO term。

1.5實時定量RT-PCR檢測

隨機挑選10個篩選出來的差異表達基因來驗證其在4個處理中的表達， 設計特異引物， 提取同期樣品RNA， 逆轉錄為cDNA， 進行實時熒光定量PCR分析， 選用 Actin 11基因為內參（表1）。反應體系含2×SYBR Green PCR buffer 5 μL、Template 0.5 ng、Primer-F 0.5 μL、Primer-R 0.5 μL， 補水至總體積10 μL。擴增反應程序為50℃孵育2 min， 95℃， 10 min；40個循環的95 ℃， 15 s； 60℃， 1 min。儀器為ABI 7900 HT Sequence Detection System。

表1　實時定量PCR選用基因及其引物Table 1 Genes and primers for qRT-PCR

2　結果與分析

2.1序列的整體評估以及差異轉錄基因的篩選

NGS （Next Generation Sequencing， 二代高通量測序）技術應用高通量測序儀lllumina Hiseq 2500對12個樣本（蔭蔽或全光照條件下的南 032-4和南豆12， 各3個重復）的cDNA測序得到232.2～383.1萬條原始序列（表 2）， 再通過fastx （version 0.0.13）過濾得到 216.5～356.7萬條有效序列， 占原始序列92.6%～93.3%。通過tophat （version 2.0.9）與大豆參考基因組進行基因比對， 成功比對202.6～334.1萬條序列。

表2　Illumina測定序列與大豆基因組比對結果統計Table 2 Statistics of Illumina reads and comparison with soybean genome

序列整體評估優良， 結果合格可用。通過在遮蔭和全光照下3個重復的FPKM值進行樣本間差異基因分析， 采用Fold change （表達差異倍數）以及Fisher-test精確檢驗統計學方法對差異基因差異程度進行篩選， 篩選條件為|log2FC| ＞ 1， 且FDR ＜ 0.05。經篩選， 在蔭蔽脅迫下南032-4的差異轉錄基因數量為110個， 上、下調轉錄基因數量分別為77個和33個； 南豆12的差異轉錄基因數量為287個， 上、下調轉錄基因數量分別為239個和48個； 南032-4和南豆12共有的差異轉錄基因數目為60個（圖1-A）。

圖1　蔭蔽脅迫下大豆莖稈中差異轉錄基因的篩選、功能注釋及顯著條目Fig. 1 Screening， annotation， and significant entry of differential transcription genes in soybean stem under shade stress

2.2轉錄基因的功能注釋

通過對差異轉錄基因篩選， 從Ensemble Plant獲得GO IDs， 對南032-4和南豆12的差異轉錄基因進行功能注釋， 南032-4和南豆12共有的60個差異轉錄基因， 其中獲得功能注釋的基因數為42個， 未找到匹配信息的基因數為18個， 2種注釋情況占比分別為70.0%、30.0%， 此外， 對南032-4和南豆12特有的差異轉錄基因這2種注釋情況占比分別為44.0%、56.0% 和75.3%、24.7% （圖1-B）。

2.3差異轉錄基因的GO分類

Gene Ontology可分為生物過程（biological process）、細胞組成（cellular component）和分子功能（molecular function） 3個部分。將得到的數據通過FDR＜0.05為篩選條件篩選出差異轉錄基因中顯著富集的GO條目。經蔭蔽處理， 南032-4和南豆12差異轉錄基因中獲得顯著性GO富集的條目分別有189個和263個（圖1-C）， 共有98個顯著性GO富集的條目。其中， 南032-4特有的顯著性GO富集條目的生物過程、細胞組成和分子功能分別有55、2和34個， 占比為60.4%、2.2%和37.4%； 南豆12特有的顯著性GO富集條目的三個過程分別有107、6和52個， 占比為64.9%、3.6%和31.5%。此外， 南032-4和南豆12共有98個顯著性GO富集條目， 其生物過程、細胞組成和分子功能分別占比58.2%、11.2%和30.6%（圖1-D）。

2.4GO功能的顯著性富集分析

為了進一步推斷大豆莖稈對蔭蔽的響應， 通過FDR ＜ 0.01篩選出極顯著的GO條目（圖1-C）， 南032-4和南豆12分別具有111個和129個極顯著富集條目， 共有52個極顯著的富集條目， 主要涉及次生細胞壁的生物起源（GO： 0009834）、木聚糖的生物合成過程（GO： 0045492）、作用于糖基鍵的水解酶活性（GO： 0016798）、木質素生物合成過程（GO： 0009809）等（表3）。

表3　蔭蔽脅迫下南032-4和南豆12共有的極顯著GO富集Table 3 Highly significant GO terms in both Nan 032-4 and Nandou 12 under shade stress

南032-4特有59個極顯著的富集條目（表4）， 主要涉及茉莉酸、乙烯、赤霉素等相關代謝。其中， 有8個差異轉錄基因富集于茉莉酸的生物合成過程（GO： 0009695）， 5個差異轉錄基因富集于乙烯的生物合成過程（GO： 0009693）， 2個差異轉錄基因富集于赤霉素的代謝過程（GO： 0009685）。在這15個差異轉錄基因中， 主要有6個編碼茉莉酮酸酯ZIM結構域蛋白、2個編碼赤霉素氧化酶、1個編碼乙烯合成前體1-氨基環丙烷-1-羧酸（ACC）、1個編碼乙烯形成酶等，除編碼赤霉素相關代謝的基因下調外其他的皆上調（表5）。

南豆12特有77個極顯著的富集條目（表6）， 主要涉及細胞壁相關多糖的合成， 尤其是木質素合成，比如 3個編碼4-香豆酰輔酶A連接酶的差異轉錄基因富集于4-香豆酰輔酶A連接酶活性（GO： 0016207）、3個編碼苯丙氨酸裂解酶的差異轉錄基因富集于苯丙氨酸解氨酶活性（GO： 0045548）、3個編碼甲基轉移酶的差異轉錄基因富集于咖啡酸-O-甲基轉移酶活性（GO： 0047763）等， 所有的這些基因皆上調。此外，在蔭蔽條件下南豆12有23個差異轉錄基因涉及植物激素的響應（GO： 0009733）， 其中， 有9個編碼SAUR-like生長素響應家族蛋白， 1個編碼吲哚乙酸，10個基因皆上調（表7）。

2.5細胞壁形成相關基因

南032-4和南豆12分別有40個和62個差異基因富集在次級細胞壁生物發生（GO： 0009834）， 共有40個差異基因（表3）， 其中， 22個差異基因編碼類成束蛋白阿拉伯半乳聚糖蛋白FLAs， 5個編碼漆酶氧化酶， 2個編碼植物類糖原淀粉起始蛋白， 3個編碼纖維素合酶， 2個編碼EXT蛋白， 這些差異基因在蔭蔽條件下皆上調（圖2-A）； 同時多個富集條目涉及細胞壁相關多糖的合成， 比如與纖維素合成緊密相關的纖維素合酶活性（GO： 0016759）等； 與果膠合成相關的鼠李半乳糖醛酸聚糖側鏈代謝過程（GO： 0010400）等；與半纖維素合成緊密相關的木聚糖生物合成的過程（GO： 0045492）、葡糖醛酸木聚糖代謝過程（GO：0010413）等； 與木質素合成緊密相關的木質素合成過程（GO： 0009809）、苯丙烷代謝過程（GO： 0009698）等； 在蔭蔽條件下這些差異表達基因皆上調且南032-4較南豆12上調的基因數相對少些（表3）。

表4　蔭蔽脅迫下南032-4特有的極顯著GO富集Table 4 Highly significant GO terms in Nan 032-4 under shade stress

表5　蔭蔽脅迫對南032-4茉莉酸合成、乙烯合成、赤霉素代謝的影響Table 5 Effect of shade stress on jasmonic acid biosynthetic process， ethylene biosynthetic process， and gibberellin metabolic process in Nan 032-4

（續表6）

表7　蔭蔽脅迫對南豆12合成木質素相關酶類及生長素的影響Table 7 Effect of shade stress on lignin synthesis related enzymes and auxin in Nandou 12

（續表7）

2.6水解酶和鈣調素相關基因

南032-4和南豆12分別有14個和11個差異基因富集在作用于糖基鍵的水解酶活性（GO： 0016798），所有差異轉錄基因皆編碼木葡聚糖內轉糖苷酶/ 水解酶（XTH）， 皆上調（圖2-B）。在蔭蔽條件下， 南032-4和南豆12分別有7個和14個差異基因富集于鈣調素的結合（GO： 0005516）， 其主要參與編碼IQ-domain、鈣-ATP酶、與質膜相關的鈣離子結合蛋白等， 除了南豆12有4個編碼脂質轉運蛋白LTP基因下調外其他的皆上調（圖2-C）。

2.7實時熒光定量PCR驗證

為了驗證RNA-seq轉錄組測序的可靠性， 隨機挑選 10個差異表達基因（表 1）進行實時熒光定量PCR檢驗。由圖3可知， qRT-PCR的結果與RNA-seq在數值上基本一致， 相關分析q-PCR和RNA-seq的數據顯示相關系數為0.984 （P ＜ 0.001）， 說明轉錄組測序結果獲得的基因差異表達信息具有較高的可重復性和準確性。

3　討論

作物的抗逆性是由多基因控制的復雜數量性狀，涉及信號轉導、激素代謝、防御和脅迫耐受蛋白、能量代謝和轉錄翻譯等方面［27-28］。在蔭蔽條件下，作物感受蔭蔽信號， 表現出避蔭反應， 致使植株高度增加， 莖稈細長纖弱， 由于蔭蔽條件的復雜性和作物基因型的多樣性可能使作物對蔭蔽存在不同程度或方式的適應性［4-7，29］。本研究對不同耐蔭型大豆品種的莖稈轉錄組測序顯示， 在蔭蔽條件下大豆莖稈轉錄基因出現顯著差異， 且皆以上調為主， 這或許與蔭蔽脅迫適應調節機制密切相關， 但仍需進一步研究揭示。強耐蔭品種南豆12較弱耐蔭品種南032-4表現出更多的差異轉錄基因， 體現了不同基因型對蔭蔽適應能力的不同， 強耐蔭品種南豆12對蔭蔽具有更強的響應能力， 積極調控以增強對蔭蔽的適應能力。

圖2　蔭蔽脅迫對大豆莖稈次生細胞壁、水解酶活性及鈣調素結合的影響Fig. 2 Effect of shade stress on secondary cell wall， hydrolase activity， and calmodulin binding in soybean stem

圖3　實時熒光定量PCR與RNA-seq相關性分析Fig. 3 Analysis of the correlation between qRT-PCR and RNA-seq

植物細胞壁對植物體的支撐、水分和養料的供給、植物形態建成和植物與環境的相互作用起著重要作用， 與植物細胞分化、植物體生長發育也有密切關系， 其中， 次生細胞壁對加強植物向上生長所需要的機械支持能力起重要作用［30］。本研究中， 在蔭蔽條件下大多基因主要集中于莖稈次生細胞壁的起源以及細胞壁相關多糖的合成， 且皆上調， 這是作物對蔭蔽脅迫的積極響應以加強自身向上生長所需的機械支持力和所需的物質基礎， 進而增強對蔭蔽脅迫的耐受能力。其中， 又以編碼FLAs基因占多數， 其屬于阿拉伯半乳聚糖蛋白中的一類， 前人研究表明， 阿拉伯半乳聚糖蛋白能夠促進棉花纖維的伸長［31］、參與植物細胞定向生長的控制［32］以及莖的伸長［33］等。亦有研究證明， FLA在細胞伸長及次生細胞壁的成熟中起作用［34-35］。本研究表明， 在蔭蔽條件下編碼細胞壁纖維素、半纖維素、木質素等相關多糖的基因上調， 這便促進細胞壁多糖的積累， 為細胞生長提供物質基礎， 加之在蔭蔽脅迫下編碼FLA增多， 促進細胞伸長， 加快次生細胞壁的成熟，這就使得細胞周邊擴散生長減弱致使莖稈變細。其中， 南豆12相關基因上調數目較南032-4多， 表明在蔭蔽脅迫下強耐蔭品種南豆12莖稈物質積累豐富，致使莖稈不至過于纖細， 能維持莖稈較強的機械能力， 防止倒伏， 體現了較強的耐蔭能力。

細胞壁松弛對植物發育有著深刻的影響， 其中木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶XTH能催化木葡聚糖分子水解與再連接， 通過一種“分子嫁接”的機制介導細胞壁的松弛及重構促進細胞伸長［36-37］。在蔭蔽條件下大豆莖稈編碼水解酶活性的XTH基因皆上調，促進了細胞壁的松弛進而促進細胞壁細胞伸長， 致使大豆莖稈伸長生長。這與前人研究的AtXTH9的突變會導致節間變短［38］， 水稻OsXTH8基因上調表達參與細胞伸長［39］的研究結果基本一致。其中， 南豆12較南032-4上調的基因少些， 說明在蔭蔽條件下南豆12莖稈維持一定長度， 減弱莖稈藤蔓化程度， 降低植株倒伏率， 較032-4更適應蔭蔽環境。

在蔭蔽條件下， 作物莖稈變得纖細， 歸結于作物對蔭蔽信號作出的響應， 本研究表明作為第二信使Ca2+結合蛋白的鈣調素尤為明顯， 其積極的響應促使作物通過信號轉導對蔭蔽作出響應， 增強對蔭蔽的適應能力。其中， 南豆12莖稈中4個編碼響應鈣調素結合的脂質轉運蛋白皆下調， 脂質轉運蛋白是一種重要的逆境蛋白［40］， 其下調可能介導復雜的信號系統增加南豆12對蔭蔽的耐受力， 但其調節機制還需進一步研究。在蔭蔽條件下， 南豆12和南032-4也有各自特有的對蔭蔽的響應和適應性。本研究表明， 遮蔭使南豆12莖稈中編碼木質素合成和響應生長素的相關基因顯著上調。木質素是次生細胞壁重要組成成分， 編碼其合成的基因上調與次生細胞壁合成加快相照應， 前人研究表明木質素對莖稈機械強度的增加具有促進作用， 在蔭蔽條件下大豆莖稈變得纖細， 木質素含量降低， 易出現倒伏［11，13］， 南豆12通過促進木質素合成增強其自身莖稈抗折力，加強了對蔭蔽環境的適應性， 體現了其強耐陰性。同時， 其編碼響應生長素的相關基因皆上調， 促進了生長素的合成， 由于高濃度的生長素抑制生長，因此， 抑制了莖稈過度伸長生長， 減弱莖稈藤蔓化程度， 降低植株倒伏率， 體現了對蔭蔽較強的適應性。至于南032-4， 在蔭蔽條件下， 主要通過相關的激素代謝響應蔭蔽。前人研究表明， 赤霉素促進莖稈伸長［16］， 茉莉酸參與植物抗逆境脅迫［18］， 乙烯提高植物抗逆性［19］。本試驗中南032-4編碼赤霉素代謝的基因下調， 而編碼茉莉酸和乙烯相關的基因則上調， 皆表現出南032-4對蔭蔽環境的適應性。總之，在套作蔭蔽條件下， 大豆幼苗出現避蔭反應， 其莖稈變細伸長， 抗折力下降， 易倒伏， 這歸結于分子水平上作出積極響應而調控其形態、生理的變化， 再者， 不同基因型品種表現出不同程度的適應性， 強耐蔭品種南豆12較弱耐蔭品種南032-4表現出更多的差異轉錄基因， 對蔭蔽響應能力和適應能力更強。

4　結論

套作蔭蔽條件下， 南豆12和南032-4分別有287個和110個差異轉錄基因影響莖稈形態建成， 主要富集于次生細胞壁的生物起源、多糖的合成、鈣調素結合和水解酶活性等生物過程。強耐蔭品種通過更多地增加細胞壁多糖、木質素含量以及對生長素的響應等來增加莖稈強度， 保持莖稈一定的形態優勢， 最終提高自身抗倒伏能力， 表現出對蔭蔽更強的適應性。

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Transcriptome Analysis of Stem Morphogenesis under Shade Stress in Soybean

REN Meng-Lu1， LIU Wei-Guo1， *， LIU Ting1， DU Yong-Li1， DENG Yu-Chuan1， ZOU Jun-Lin2， YUAN Jin3， and YANG Wen-Yu1， *

1Institute of Ecological Agriculture， Sichuan Agricultural University / Key Laboratory of Crop Ecophysiology and Farming System in Southwest China， Ministry of Agriculture， Chengdu 611130， China；2Bureau of Rural Economic Development of Pengzhou City， Pengzhou 611930， China；3The Seed Management Station， Chengdu 610041， China

Maize-soybean relay-cropping system is a key technology in agriculture， studying the molecular mechanisms for shade stress responses of soybean grown in the intercropping system will be useful for soybean improvement by genetic manipulation. An experiment was conducted using two different shade susceptive soybean （Glycine max L.） varieties Nandou 12 and Nan 032-4 to investigate the transcriptome changes in response to shade stress by RNA-seq technology. The results indicated that 287 differentially expressed genes in Nandou 12 and 110 genes in Nan 032-4 were significantly affected by shade， and the expression of the genes was mainly up-regulated. Gene ontology analyses showed that differentially expressed genes were enriched in secondary cell wall biogenesis， polysaccharides synthesis， calmodulin binding， hydrolase activity and so on. In the shade treatment， differentially expressed genes responded to lignin and auxin biosynthetic processes were up-regulated in Nandou 12； and genes responded to jasmonic acid and ethylene biosynthetic processes were up-regulated， but genes responded to gibberellin metabolic process were down-regulated in Nan 032-4. However， Nandou 12 had more differentially expressed genes than Nan 032-4. The accumulateion of polysaccharides in cell wall and acceleration of secondary cell wall formation hindered the radial growth of stem making stem thinner， meanwhile the increase of hydrolysis enzyme activity accelerated the relaxation of cells， making stem longer.Nandou12 and Nan032-4 also had their particular genes to response shade， but Nandou 12 had more cell wall polysaccharides，lignin content and auxin content to increase the intensity of stem keeping a certain morphological advantage， resulting in higher lodging resistance under the shade， that is a stronger adaptability to shade.

Soybean； Replay strip intercropping； Shade stress； Stem； Transcriptome

10.3724/SP.J.1006.2016.01319

本研究由四川省作物育種公關項目資助。

This study was supported by Sichuan Crop Breeding Key Project.

（Corresponding authors）： 劉衛國， E-mail： lwgsy@126.com， Tel： 028-86290960； 楊文鈺， E-mail： mssiyangwy@sicau.edu.cn，Tel： 0835-2882004

聯系方式： E-mail： 1461755144@qq.com

Received（）： 2016-01-11； Accepted（接受日期）： 2016-03-14； Published online（網絡出版日期）： 2016-03-28.

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160328.1115.002.html