海島棉轉錄因子基因GbMYB60的克隆、表達及其抗逆性分析

高 巍劉會利田新權 張 慧 宋 潔 楊 勇 龍 璐宋純鵬

河南大學生命科學學院 / 棉花生物學國家重點實驗室 / 植物逆境生物學重點實驗室， 河南開封 475004

海島棉轉錄因子基因GbMYB60的克隆、表達及其抗逆性分析

高 巍**劉會利**田新權 張 慧 宋 潔 楊 勇 龍 璐宋純鵬*

河南大學生命科學學院 / 棉花生物學國家重點實驗室 / 植物逆境生物學重點實驗室， 河南開封 475004

MYB轉錄因子是在真核生物細胞內廣泛存在的一類轉錄因子蛋白， 在植物的生長發育、代謝調節、抗病抗逆、以及激素介導的信號路徑等方面都發揮著重要的作用。本研究從海島棉品種海7124中克隆得到一個MYB轉錄因子基因， 根據序列同源性和進化分析， 將其命名為GbMYB60。該基因序列長990 bp， 編碼一個36.9 kD的R2R3類MYB轉錄因子蛋白。GbMYB60蛋白被特異地定位于植物細胞核。GbMYB60基因的表達水平較低， 在真葉中優勢表達， 根系中表達量最低。該基因受甘露醇、NaCl、低溫、高溫等非生物逆境， 以及脫落酸、乙烯利、茉莉酸甲酯和水楊酸等植物激素的誘導上調表達。利用病毒誘導的基因沉默技術在海島棉中干涉GbMYB60發現， 降低GbMYB60基因的表達水平， 使棉花幼苗對高鹽脅迫的耐受性降低； 但GbMYB60干涉的植株在甘露醇溶液的處理下與對照植株并無顯著的抗性差異。

棉花； MYB轉錄因子； 鹽； 甘露醇； 非生物脅迫

MYB轉錄因子是在真核生物細胞內廣泛存在的一類轉錄因子蛋白， 通過調節下游信號傳導基因和功能基因的轉錄水平來實現對細胞進程的調控［1］。植物的MYB家族成員可以根據其N端MYB保守結構域的氨基酸構成被分成4類（1R、R2R3、3R和4R），其中R2R3是植物特有的， 也是數量最多的。在擬南芥中， 目前報道的 MYB轉錄因子有 200個， 其中R2R3-MYB的數量為190個［2］。研究表明R2R3-MYB參與了植物生長發育、代謝、激素信號傳導、抗逆、抗病等重要的生物學過程［1-3］。例如， 擬南芥AtMYB2在干旱脅迫下表達量上升， 通過激活脫落酸（abscisic acid， ABA）介導的信號途徑增強植物的抗旱性。AtMYB2還影響了擬南芥腋芽發育和衰老過程［4-5］。AtMYB60和AtMYB96也參與了擬南芥的抗逆反應［6-8］。AtMYB60是一個耐旱的負調控因子， 在氣孔中特異表達， 表達水平被干旱脅迫抑制。atmyb60突變體氣孔開度小于野生型， 因此突變體植株在缺水環境中水分散失速率明顯下降， 耐旱性顯著提高。而超表達MYB60.1和 MYB60.2的擬南芥對干旱更加敏感［6，8］。AtMYB96同時參與了擬南芥的抗旱和抗病過程， 促進干旱脅迫下表皮蠟質合成、水楊酸（salicylic acid，SA）和 ABA介導的抗病信號傳遞［7，9］。除了擬南芥，其他物種如水稻、玉米中也發現了大量的 R2R3類MYB成員［10-11］， 但關于棉花中 R2R3-MYB轉錄因子深入的功能研究還較少。

隨著棉花基因組測序的完成［12-13］， 棉花中預測有200多個MYB轉錄因子， 但大部分成員還沒有功能報道， 只有少數成員被證明參與了棉花重要農藝性狀如纖維品質、抗性的調控［14-19］。例如， 海島棉GbMYB5基因正調控植物對干旱的適應性反應， 干涉GbMYB5的表達降低了植株在干旱脅迫下脯氨酸和抗氧化酶的含量， 細胞內的丙二醛含量增加， 進而使得干涉植株在缺水環境下的死亡率上升。GbMYB5可能通過參與ABA信號路徑和影響抗旱相關基因NCED3、RD22和RD26的表達來調節棉花的耐旱性［19］。近幾年， 一些研究證實MYB基因參與了棉纖維發育過程。研究者分別在陸地棉中克隆到與擬南芥表皮毛發育相關基因GL1同源的GhMYB109、在纖維起始時期優勢表達的GhMYB25和GhMYB25-like， 這些R2R3-MYB基因在纖維原始細胞（突起于胚珠表皮細胞）起始和纖維伸長過程中起重要作用［14-17］。

棉花遺傳轉化的方法中， 應用最廣泛的是農桿菌介導的穩定遺傳轉化［20］。然而， 此方法轉化效率較低、周期長， 限制了棉花MYB基因功能的研究。病毒誘導的基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）技術在棉花中的成功運用能夠部分彌補穩定轉化在基因功能分析中的限制［21］。VIGS周期短、轉化效率高。其中煙草脆裂病毒 TRV （tobacco rattle virus）類的VIGS載體適用于棉花幼苗期的基因功能分析［21-22］， 應用此方法可以在棉花中有效、快速地開展 MYB轉錄因子的功能研究， 為后續穩定轉化棉花并深入解析其分子功能提供理論基礎。本研究克隆了海島棉中的 MYB轉錄因子基因 GbMYB60，分析了 GbMYB60的表達模式、蛋白定位及GbMYB60干涉棉花植株對非生物脅迫的響應。為GbMYB60后續的功能研究提供依據， 為棉花抗逆育種提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1植物材料的種植和處理 海島棉（Gossypium barbadense L.）品種海 7124種子由南京農業大學提供， 并在海南三亞棉花繁殖基地繁種。本氏煙（Nicotiana benthamiana）由本實驗室保存。棉花及煙草種子播種于營養土， 并于植物光照培箱中生長，溫度保持25， ℃光照周期為16 h光照， 8 h黑暗。

選擇二葉一心時期的棉花植株， 收集根、莖、子葉和真葉的鮮樣， 用于組織表達模式分析。選擇長勢一致的棉花幼苗， 于非生物逆境脅迫和植物激素處理后3 h取棉花葉片用于逆境和激素響應分析。鹽和甘露醇處理是用300 mmol L-1的NaCl溶液和甘露醇溶液澆灌幼苗根系； 低溫和高溫處理是將幼苗放置到 4℃和 37℃的生長箱中； 傷口處理是用剪刀對待取樣的幼苗葉片進行機械損傷處理； 植物激素處理是用100 μmol L-1ABA、200 μmol L-1乙烯利（ethephon， ETH）、100 μmol L-1H2O2、100 μmol L-1茉莉酸甲酯（methyl jasmonate， MeJA）和1 mmol L-1SA分別對植株地上部分噴施， 水處理為平行對照。

1.1.2載體和菌株 棉花VIGS實驗載體pTRV1、pTRV2由荷蘭瓦赫寧根大學Bart P. H. J. Thomma教授惠贈。Gateway系列載體pDONOR221和pK7FWGF2， 0分別從美國Invitrogen公司和比利時VIB研究所購得； TA克隆載體pGEM-T購自Promega公司。實驗中所用大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α、根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株 GV3101均由本實驗室保存。

1.1.3試驗試劑 構建 VIGS載體所用限制性內切酶購于NEB公司； Gateway載體構建所需要的BP酶、LR酶購于美國Invitrogen公司。質粒提取試劑盒、PCR產物回收試劑盒和DNA聚合酶購于北京天根生物公司； DNA測序和引物序列合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成； 植物激素購于索萊寶生物公司； RNA提取試劑盒購于北京艾德萊生物公司； 反轉錄試劑盒購于日本TOYOBO公司； qRT-PCR用的SYBR Green購于南京諾唯贊生物公司。

1.2棉花總RNA提取和cDNA的合成

采用EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒，按說明書提取棉花總 RNA。取 1 μg總 RNA， 用ReverTra Ace qPCR RT試劑盒進行反轉錄。首先將總RNA在65℃變性5 min， 并立即于冰上冷卻。反轉錄體系含5倍RT緩沖液2 μL、RT Mix 0.5 μL、引物0.5 μL、變性RNA 1 μg， 用無核酸污染的ddH2O補足到10 μL。反轉錄程序為37℃ 15 min， 98℃ 5 min。反轉錄完成后稀釋50倍用于RT-PCR和qRT-PCR。

1.3GbMYB60序列的克隆、比對和進化分析

在海島棉基因組數據庫（http：//cotton.cropdb.org/ cotton/download/data.php）中搜索獲得 GbMYB60基因的 CDS序列， 并據此設計基因特異引物M60O-F/R （表1）， 以海7124幼苗葉片cDNA為模板，用pfu DNA聚合酶進行高保真擴增。PCR反應體系含10倍pfu緩沖液5 μL、dNTPs （10 mmol L-1） 1 μL、M60O-F/R （10 μmol L-1）各0.5 μL、pfu DNA聚合酶1 μL、用ddH2O補足至50 μL。PCR反應程序為95℃5 min； 95℃ 30 s， 59℃ 30 s， 72℃ 2 min， 30個循環；72℃ 10 min。將目標基因的 PCR產物連接到 TA克隆載體pGEM-T上， 并轉化大腸桿菌DH5α。比對測序后的片段與轉錄組中獲得的片段， 序列一致者為同一基因。使用軟件Primer Premier 5.0設計引物。

從NCBI上下載擬南芥、葡萄和棉花R2R3類MYB轉錄因子的氨基酸序列， 用 MEGA6軟件對GbMYB60及R2R3類MYB家族的其他成員進行系統進化分析， 分析方法為近鄰結合法（Neighbor-Joining），設置1000次BootStraps進行評估。多序列比對所使用的軟件為DNAMAN。

1.4載體構建

用Gateway系統構建融合表達載體。經BP、LR兩步反應將目標片段分別連接到中間載體pDONOR221和目標載體pK7FWG2，0上， 獲得融合表達載體p35S-GbMYB60：GFP， 并通過電擊轉化導入農桿菌菌株GV3101中。BP和LR反應的操作步驟見BP Clonase Enzyme Mix和LR Clonase Enzyme Mix試劑說明書。

根據GbMYB60的CDS序列設計引物M60V-F/R（表1）， 構建VIGS載體， 具體操作方法參考Gao等［22］。將構建的 VIGS載體 pTRV-MYB60和空載體對照pTRV2通過電擊轉化導入農桿菌 GV3101中， 保存陽性克隆備用。

1.5亞細胞定位

將含有 p35S-GbMYB60：GFP質粒的農桿菌從葉背面注射到幼嫩的本氏煙葉片中， 含 p35S-GFP的農桿菌為陽性對照。葉片避光處理48 h后， 用激光共聚焦顯微鏡（Bio-Rad Radiance 2100， 美國）觀察綠色熒光蛋白的表達。

1.6RT-PCR和qRT-PCR

RT-PCR反應引物為M60RT-F/R （擴增32個循環）和UBI7-F/R （擴增26個循環）。每次VIGS注射后， 都應通過 RT-PCR對干涉棉花植株進行基因表達量檢測， RT-PCR實驗至少重復4次以上。用SYBR Green染料法， 在ABI7500 Fast （Applied Biosystems，美國）上進行qRT-PCR擴增。反應使用的酶為AceQ qPCR SYBR Green Master Mix， 基因特異引物為M60Q-F/R， UBI7-F/R為內參基因擴增引物（表 1）。GbMYB60干涉效率檢測 qRT-PCR的實驗重復設置與 RT-PCR的實驗重復一樣。組織表達及逆境表達部分GbMYB60基因的qRT-PCR實驗進行3次生物學重復， 每次重復 4個技術重復。目標基因在模板中的相對變化量計算方法為2-?Ct， 其中?Ct =（CT，Targe-CT，Actin）Time x［23］。

1.7抗逆性鑒定

在子葉平展時期選擇長勢一致的棉花幼苗進行VIGS注射， 具體方法參照Gao等［21］。15 d后， 分別取TRV：00和TRV：MYB60的第2片真葉提取總RNA，檢測GbMYB60的沉默效果。選擇相同大小、發育一致的真葉統計離體葉片失水率， 每30 min測定一次葉片鮮重變化。葉盤處理方法參考Long等［24］， 同樣取發育一致的棉花真葉， 用打孔器對葉片相同部位打孔取葉盤， 挑選一致的葉盤放于培養皿中。在培養皿中加入0、100、250和400 mmol L-1甘露醇或NaCl溶液， 處理 6 d之后照相。選取長勢一致的TRV：00和TRV：MYB60植株進行NaCl和甘露醇溶液澆灌處理， 處理濃度為400 mmol L-1。處理之后每天觀察植株的萎蔫反應， 并統計萎蔫葉片和失綠葉片數量。

2　結果與分析

2.1GbMYB60基因的克隆及序列分析

根據本實驗室研究棉花響應非生物脅迫的RNA-Seq分析結果， 獲得一條在鹽脅迫處理后表達豐度上升的EST片段。在海7124中擴增到一個CDS（coding sequence）長度為990 bp的基因， 該基因包含與前期分析發現的EST片段完全一致的區段， 編碼一個長度為 329 AA的蛋白（圖 1）。在線分析軟件（http：//web.expasy.org/compute_pi/）預測顯示該蛋白的分子量（Mw）為36.9 kD， 等電點（pI）為5.67。

表1　本文中所涉及的引物Table 1 Primers used in this study

圖1　GbMYB60與同源蛋白的序列比對Fig. 1 Multiple sequence alignments of GbMYB60 and homologous proteins完全一致的氨基酸殘基序列用黑色背景標注， 保守的R2和R3結構域用方框標注。Identical amino acid residues are shaded in black， conserved domains R2 and R3 are boxed.

在 NCBI網站用 protein blast （http：//blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析蛋白的保守結構域， 發現該蛋白在靠近N端的部位有2個DNA結合區域， 可能為一個轉錄因子蛋白。這2個DNA結合區域的序列內部存在MYB類轉錄因子的典型特征。用tBlastx分析的結果顯示， 該基因編碼的蛋白與擬南芥AtMYB60.1 （GI：15223917）、 葡 萄VvMYB60 （GI：526117436）的相似性較高， 分別為 52.6%和55.4%， 因此該基因被命名為 GbMYB60。氨基酸序列比對分析表明， GbMYB60、AtMYB60.1、VvMYB60、GbMYB5 （GI：333101822）、GhMYB25 （GI：38456066）、GhMYB25-like （GI：326631704）和GhMYB109 （GI：38091115）在N端的120 AA比較保守， 且都含有并且僅有R2和R3兩個MYB類DNA結合區域， 該區段為 MYB轉錄因子蛋白的保守區段。C端序列的差異性相對較大， 說明 C端為該蛋白的特異區段（圖 1）。對 GbMYB60和部分擬南芥R2R3類 MYB成員的氨基酸序列采用鄰接法（N-J）構建進化樹， 發現 GbMYB60與棉花中已報道的GbMYB2、GbMYB5、GhMYB25、GhMYB25-like、GhMYB109和 GbMYBL1遺傳距離較遠， 與AtMYB60.1、AtMYB60.2的遺傳距離最近（圖2）。

2.2GbMYB60的亞細胞定位

利用在線軟件 ProtComp 9.0 （http：//linux1.soft berry.com/berry.phtml）預測 GbMYB60定位在細胞核。并構建 C端融合 GFP的融合表達載體 p35SGbMYB60：GFP轉化煙草， 48 h之后用激光共聚焦顯微鏡觀察葉片表皮細胞。結果顯示， GFP單獨存在時， 能在表皮細胞的細胞膜、細胞質、細胞核觀察到熒光的存在； 而GFP融合GbMYB60蛋白共同表達時， 只能在細胞核里檢測到綠色熒光（圖3）。說明GbMYB60蛋白定位在細胞核， 符合亞細胞定位預測的結果和轉錄因子蛋白通常存在的定位情況。

圖2　GbMYB60與擬南芥R2R3-MYB轉錄因子的進化樹分析Fig. 2 Phylogenetic tree of GbMYB60 and R2R3-MYB transcription factors in Arabidopsis

圖3　GbMYB60蛋白的亞細胞定位Fig. 3 Subcellular localization of GbMYB60 protein

2.3GbMYB60的表達模式

利用在線工具PlantCARE （http：//bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對GbMYB60轉錄起始位點上游 2 kb的 DNA序列預測發現， 在GbMYB60的啟動子區存在多種與生長發育、代謝調控、抗病、抗逆和激素響應相關的順式作用元件（表2）。其中包括與干旱相關的MBS、響應高溫脅迫的HSE、逆境脅迫和防衛反應相關的TC-rich repeats、真菌激發子誘導相關的Box-W1、啟動基因在地上部分特異表達的as-2-box、ABA響應元件ABRE和乙烯響應元件ERE等。說明GbMYB60在轉錄水平受多種因素影響， 在植物細胞中可能參與激素調控和非激素介導的脅迫信號傳導和響應過程。

利用qRT-PCR技術檢測GbMYB60的表達顯示，GbMYB60在真葉中表達量最高， 子葉和莖中表達量次之， 在根系中表達量最低， 約為真葉中的1/20。說明 GbMYB60在棉花幼苗的不同組織中轉錄水平呈現較大差異， 即 GbMYB60的表達存在組織特異性，在地上部分優勢表達。此外， GbMYB60在棉花中的表達水平較低， 子葉和莖中的GbMYB60表達量僅為內參基因GbUB7的1/50 （圖4）。

為了進一步驗證啟動子順式元件預測的結果，對真葉進行不同逆境和植物生長調節劑處理。結果顯示， 在鹽、甘露醇、低溫和高溫 4種非生物脅迫以及 ABA、ETH、MeJA和 SA四種激素處理下，GbMYB60的表達量都有提高， 說明GbMYB60在轉錄水平受到這些因素的誘導。但是對真葉機械損傷和噴施H2O2時， GbMYB60的表達量維持在與對照相近的水平（圖5）。

表2　預測的GbMYB60啟動子區段部分順式元件Table 2 Part of the predicated cis-elements in GbMYB60 promoter region

圖4　GbMYB60在棉花幼苗真葉、子葉、莖和根中的組織表達模式Fig. 4 Tissue-specific expression of GbMYB60 in leaf，cotyledon， stem， and root of cotton seedling

圖5　GbMYB60基因在非生物逆境和激素誘導下的表達變化Fig. 5 GbMYB60 expression changes under abiotic stress and phytohormone treatments

2.4GbMYB60對棉花抗逆性的影響

2.4.1VIGS干涉GbMYB60棉花植株的檢測 海7214在注射含VIGS載體的農桿菌2周時， GbMYB60沉默的棉花幼苗TRV：MYB60地上部分的外部特征，包括株高、葉片大小等， 與空載體轉化的對照植株TRV：00無明顯區別（圖6-A）。用RT-PCR和qRT-PCR檢測植株中 GbMYB60基因的干涉效率， 發現TRV：MYB60中 GbMYB60的表達量僅為對照TRV：00的30%， 為同條件下內參基因GbUB7轉錄水平的1% （圖6-B）。說明利用VIGS技術， 能顯著降低海 7124中 GbMYB60基因的表達水平， 干涉GbMYB60不影響海7124棉花幼苗的生長發育。

2.4.2干涉 GbMYB60不影響棉花對甘露醇的耐受性 圖7-A所示， 選擇TRV：00和TRV：MYB60同一發育時期的葉片， 取葉盤浸泡在不同濃度的甘露醇溶液中， 觀察葉盤的變化。處理6 d后， 水處理的對照組中葉盤沒有明顯變化， 100、250和400 mmol L-1甘露醇處理的葉盤邊緣均出現不同程度的失綠和褐化， 但TRV：00和TRV：MYB60之間的失綠、褐化程度沒有差異。結果顯示， TRV：00和TRV：MYB60的離體葉片在自然條件下水分散失的速率在數據統計上沒有顯著區別（圖7-B）； 澆灌400 mmol L-1甘露醇處理12 d后， TRV：00和TRV：MYB60植株均出現下端葉片黃化、萎蔫的現象， 但上部的葉片仍然保持綠色， 并未受甘露醇影響， 且TRV：00和TRV：MYB60黃化、萎蔫葉片的數目和萎蔫程度也未見差異（圖8）。說明在海7124中干涉GbMYB60基因并未影響棉花對高濃度甘露醇溶液的耐受性和離體葉片的失水速率。

圖6　利用VIGS技術沉默棉花幼苗中的GbMYB60基因Fig. 6 Silencing of the GbMYB60 gene in cotton seedlings using VIGSA： 空載體轉化的對照材料TRV：00和GbMYB60干涉材料TRV：MYB60； B： qRT-PCR和RT-PCR檢測棉花葉片中GbMYB60的干涉效率（** P ＜ 0.01， t檢驗）。A： Representative seedlings of TRV：00 （empty control） and TRV：MYB60 （GbMYB60- silencing）； B： qRT-PCR and RT-PCR of GbMYB60 expression level in cotton leaf （** P ＜ 0.01， t-test）.

圖7　TRV:00和TRV:MYB60葉片對甘露醇耐受性的分析Fig. 7 Mannitol tolerance analysis of TRV:00 and TRV:MYB60 leavesA： 0、100、250、400 mmol L-1甘露醇溶液處理TRV：00和TRV：MYB60葉盤； B： 離體棉花葉片的失水率測定。A： Leaf disks of TRV：00 and TRV：MYB60 in 0， 100， 250， 400 mmol L-1mannitol solutions； B： Measurement of the dehydrating rate of detached cotton leaf.

圖8　經400 mmol L-1甘露醇溶液處理后TRV:00和TRV:MYB60棉花幼苗Fig. 8 TRV:00 and TRV:MYB60 seedlings treated with 400 mmol L-1mannitol solution

2.4.3GbMYB60干涉植株對鹽脅迫的敏感性增加

GbMYB60在鹽處理下表達量顯著上調， 為了分析GbMYB60是否影響棉花對鹽脅迫的耐受性， 分別對TRV：00和TRV：MYB60材料的葉盤和整株植株用NaCl溶液處理。如圖9所示， 處理6 d后， 除水處理的對照組外， 100、250和400 mmol L-1NaCl溶液處理的葉盤均出現嚴重的失綠和褐化， 說明鹽溶液對TRV：00和 TRV：MYB60都造成了脅迫。100、250 mmol L-1兩種濃度處理下TRV：MYB60材料受脅迫的程度略高于TRV：00， TRV：00在100 mmol L-1的NaCl溶液中有部分葉盤維持綠色， 而 TRV：MYB60的葉盤都已經褐化。澆灌400 mmol L-1NaCl溶液12 d后， 棉花幼苗出現典型的鹽脅迫表型， 下部葉片萎蔫現象嚴重（圖10-A）。其中TRV：MYB60植株的萎蔫葉片占總葉片的48%， TRV：00僅為22% （圖10-B）。說明在海7124中干涉GbMYB60基因增加了棉花幼苗對鹽脅迫的敏感性。

3　討論

MYB家族是植物中最大的轉錄因子家族之一，通過N端保守的MYB核酸結合位點與啟動子區特異位點相結合， 實現對下游基因的轉錄調控［1-3］， 從而參與植物的生長發育、信號傳遞和對逆境協迫的響應［25-26］。相對于擬南芥、水稻等模式植物， 棉花中 MYB轉錄因子基因功能以及調控機制的研究主要集中在纖維發育上［14-17］， 抗逆相關棉花 MYB轉錄因子的研究還很少， 克隆該家族基因并解析其功能對棉花抗逆分子機制的研究具有重要的意義。本研究從海島棉中克隆到一個轉錄因子GbMYB60。通過序列比對分析發現GbMYB60在N端包含2個連續的 R2、R3類 MYB結構， 確定該基因為R2R3-MYB， 這 2個結構的氨基酸序列與其同源蛋白AtMYB60和VvMYB60高度相似， 但在120 AA后的C端其序列長度和氨基酸組成都出現了很大的差異。MYB蛋白的C端為負責蛋白活性調節的特異區段， 決定了不同 MYB成員之間的功能差異［2］。GbMYB60雖然在序列上與AtMYB60和VvMYB60同源度高， 但這3個蛋白C端活性調節區的差異說明GbMYB60在棉花中的功能與這2個蛋白已報道的功能可能不同， 參與的逆境響應和信號響應也可能存在差異。

圖9　TRV:00和TRV:MYB60葉片的耐鹽性分析Fig. 9 Salt tolerance analysis of TRV:00 and TRV:MYB60 leaves

圖10　TRV:00和TRV:MYB60幼苗的耐鹽性分析Fig. 10 Salt tolerance analysis of TRV:00和TRV:MYB60 seedlingsA： 經400 mmol L-1NaCl溶液處理的TRV：00和TRV：MYB60棉花幼苗； B： 鹽處理后植株存活葉片比率統計。A： TRV：00 and TRV：MYB60 seedlings treated with 400 mmol L-1NaCl solution； B： calculation of cotton leaves remaining green after salt treatment.

本研究預測 GbMYB60的啟動子區域存在多種響應逆境脅迫和激素誘導的順式元件。其中包括ABA響應以及干旱信號應答相關的元件 ABRE和MBS［27］。qRT-PCR的結果也與預測結果一致， 在鹽、甘露醇、低溫、高溫、ABA、ETH、MeJA、SA處理下， GbMYB60轉錄水平都出現了不同程度的上升，說明 GbMYB60可能參與了多種棉花抵抗非生物脅迫的響應和激素調控的信號傳遞過程。R2R3類MYB在植物MYB家族中數量眾多， 功能各異。目前已有的大量研究工作證明R2R3-MYB參與植物初生及次生代謝、細胞分化、發育、抗病和抗逆等過程［1-3］。且同一個MYB轉錄因子在不同的環境中具有不同的功能， 如 AtMYB60被報道響應病原菌的侵染； 在干旱脅迫下調控氣孔運動； 異源表達AtMYB60影響了生菜中的花青素合成［6，8，28］。這些都預示著 GbMYB60在棉花的逆境響應甚至生長發育中都可能行使著一定的功能。

本研究分析了 GbMYB60在棉花抵御非生物脅迫中的功能， 通過對GbMYB60干涉棉花幼苗進行甘露醇和鹽處理的表型實驗分析， 發現海島棉中GbMYB60的表達抑制對棉花幼苗對高濃度甘露醇溶液的耐受性、以及離體葉片的失水速率沒有影響，而對鹽脅迫的敏感性增強。擬南芥的AtMYB60在葉片氣孔細胞中特異表達， 而且其表達受到ABA的抑制［6，8］。擬南芥突變體 atmyb60對干旱脅迫的抗性增強， 說明AtMYB60是一個干旱耐受性的負調控因子［8］，對鹽脅迫的影響目前未見報道。二倍體植物擬南芥的基因組為120 Mb， 包含11 600萬個堿基對， 可能編碼大約26 000個基因［29］； 海島棉是一種異源四倍體， 基因組大小為 2.5 Gb， 海島棉基因組非常復雜，重復序列多， 在異源四倍體中分離到的基因多數為多拷貝基因， 因此生物學過程中的基因調控網絡也更復雜［12-13］。在棉花中抑制GbMYB60的表達與同源基因AtMYB60的結果不同， 可能是由GbMYB60和AtMYB60氨基酸序列C端特異的活性調控區段， 或者是物種之間的差異造成的。高等植物為了保證其生長發育的正常運行， 進化出幾個基因同時控制同一性狀的現象， 即功能冗余。如擬南芥中 MPK3和MPK6共同調控擬南芥抗病途徑的Priming效應， 同時突變MPK3和MPK6才能降低擬南芥誘導抗病性的產生［30］。鑒于 GbMYB60受逆境脅迫和抗逆相關激素的誘導， 在棉花中也可能存在與GbMYB60功能冗余的基因， 共同調控棉花的抗逆性， 但是這個推論還需要在棉花中更深入的研究來驗證。研究GbMYB60基因在棉花抗逆中的功能和作用機制， 可能為棉花抗性育種提供理論基礎和候選基因。

4　結論

從海島棉中克隆到一個 MYB轉錄因子基因GbMYB60， 該基因在真葉中優勢表達并受NaCl、低溫、高溫等非生物逆境， 以及ABA、ETH、MeJA和SA等激素的誘導上調。GbMYB60蛋白定位于植物細胞核。該基因不影響植株對甘露醇的耐受性， 但正調控對鹽脅迫的耐性。

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Cloning， Expression， and Functional Analysis of Transcription Factor Gene GbMYB60 in Cotton

GAO Wei**， LIU Hui-Li**， TIAN Xin-Quan， ZHANG Hui， SONG Jie， YANG Yong， LONG Lu， and SONG Chun-Peng*
School of Life Science， Henan University / State Key Laboratory of Cotton Biology / Henan Key Laboratory of Plant Stress Biology， Kaifeng，475004， China

MYB transcription factors are conserved proteins in all eukaryotic cell， which play important roles in plant growth， development， metabolism， abiotic and biotic stress resistance， as well as phytohormone-mediated signal transduction. In this research， a MYB gene was isolated from the sea-island cotton cultivar Hai 7124. This gene was named GbMYB60 based on the sequence similarity search and phylogenetic analysis. The full-length of GbMYB60 coding sequence is 990 bp， and GbMYB60 encodes a 36.9 kD R2R3-type MYB protein， which is specifically located in nucleus of plant cell. GbMYB60 was preferentially expressed in leaf and induced by abiotic stresses （such as salt， mannitol， cold， and heat） and phytohormones （abscisic acid， ethephon，methyl jasmonate， and salicylic acid） treatments， but the general expression of GbMYB60 was low in all tissues. Salt and mannitol tolerances were analyzed in control and GbMYB60 silenced-cotton generated by virus-induced gene silencing system， and the results showed that GbMYB60 positively regulated cotton tolerance to salt but not to mannitol.

Cotton； MYB transcription factor； Salt； Mannitol； Abiotic stress

10.3724/SP.J.1006.2016.01342

本研究由國家重點基礎研究發展計劃項目（2012CB1143001）， 棉花生物學國家重點實驗室開放課題（CB2015A31）和河南省教育廳項目（15A180028， 15A180029）資助。

This study was supported by the National Basic Research Program of China （2012CB1143001）， State Key Laboratory of Cotton Biology Open Fund （CB2015A31）， and Henan Provincial Educational Department Foundation of China （15A180028， 15A180029）.

（Corresponding author）： 宋純鵬， E-mail： songcp@henu.edu.cn， Tel： 0371-23880002

聯系方式： E-mail： gaowei021@163.com**同等貢獻（Contributed equally to this work）

Received（）： 2016-01-29； Accepted（接受日期）： 2016-06-20； Published online（網絡出版日期）： 2016-06-27.

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160627.0836.006.html