趨化因子CCL20及其受體CCR6在肺腺癌組織中的表達及與復發轉移的關系研究

張霄鵬，胡志娟，孟愛宏，賈曉梅，段國辰，王志康，趙慶濤

?

·論著·

趨化因子CCL20及其受體CCR6在肺腺癌組織中的表達及與復發轉移的關系研究

張霄鵬，胡志娟，孟愛宏，賈曉梅，段國辰，王志康，趙慶濤

目的通過觀察復發和非復發肺腺癌患者癌組織中CCL20和CCR6的表達情況，探討CCL20和CCR6在肺腺癌發生發展中的作用。方法選取2009年2月—2011年12月河北省人民醫院收治的肺腺癌患者162例，根據隨訪期間的復發轉移情況分為復發組(n=50)和非復發組(n=112)。采用免疫組織化學染色檢測CCL20和CCR6的表達；采用實時熒光定量PCR檢測CCL20、CCR6 mRNA的表達，采用蛋白質印跡(Western blot)法檢測CCL20、CCR6蛋白的表達。結果CCL20在肺腺癌組織中主要表達于細胞膜和細胞質，CCR6在肺腺癌組織中主要表達于細胞質，二者在肺腺癌癌旁組織中均無明顯表達。復發組CCL20、CCR6高表達率〔CCL20：38(76.0%)比9(8.0%)；CCR6：33(66.0%)比7(6.3%)〕和染色指數〔CCL20：(150.4±10.2)比(62.5±8.5)；CCR6：(134.4±11.3)比(58.0±9.5)〕均高于非復發組，差異有統計學意義(P<0.05)。復發組CCL20、CCR6 mRNA表達較非復發組分別增加82.3%、56.4%，CCL20、CCR6蛋白表達較非復發組分別增加292.0%、188.0%，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論CCL20和CCR6在肺腺癌組織中呈高表達，且與肺腺癌的發生發展相關。

肺腫瘤；趨化因子CCL20；受體，CCR6；復發；腫瘤轉移

張霄鵬，胡志娟，孟愛宏，等.趨化因子CCL20及其受體CCR6在肺腺癌組織中的表達及與復發轉移的關系研究[J].中國全科醫學，2016，19(25)：3065-3068,3073.[www.chinagp.net]

ZHANG X P,HU Z J,MENG A H,et al.Expression of chemokine CCL20 and its receptor CCR6 in lung adenocarcinoma and their relationship with recurrence or metastasis[J].Chinese General Practice，2016，19(25)：3065-3068,3073.

肺癌是癌癥相關死亡的首位原因[1]。趨化因子主要調節體內生理及病理情況下免疫細胞的轉移，通過激活G蛋白偶聯7次跨膜受體發揮作用[2]。不同的免疫細胞亞型表達特定的趨化因子受體，在靶器官中引導免疫細胞轉移、滯留及發揮功能[3]。多種腫瘤細胞表達趨化因子和趨化因子受體[4]。通過激活趨化因子/趨化因子受體軸，誘導自分泌和旁分泌環的形成，促進腫瘤的生長、血管生成，破壞抗腫瘤的免疫反應[4-5]。例如，趨化因子CXCL12及其受體CXCR4對腫瘤的擴散、部位特異性轉移以及患者存活起重要調節作用[4,6]。本研究通過觀察肺腺癌組織趨化因子CCL20及其受體CCR6的表達和定位，進一步探討CCL20及CCR6在非小細胞肺癌(NSCLC)發病中的作用以及與復發轉移的關系。

1　對象與方法

1.1研究對象選取2009年2月—2011年12月河北省人民醫院收治的肺腺癌患者162例。納入標準：(1)根據國際抗癌聯盟TNM分期系統進行術前及術后的組織病理分析[7]，術前評估為TNMⅠ或Ⅱ期，術后病理證實為腺癌；(2)均采用胸腔鏡肺癌根治術；(3)隨訪2年。排除標準：不愿合作者。根據隨訪期間的復發轉移情況分為復發組(n=50)和非復發組(n=112)。本研究經河北省人民醫院醫學倫理委員會的批準，患者均簽署知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1手術方法及肺組織標本采集所有患者采用雙腔氣管插管和單肺通氣，常規全身麻醉。采用胸腔鏡肺癌根治術，根據病變的部位、性質和手術方式進行體位選擇。通常采用側臥位，分別在腋中線第7或第8肋間，腋前線第4或第5肋間，以及肩胛下線第8或第9肋間做切口以插入胸腔鏡手術器械。標本袋收集病變樣本，移出胸腔。操作器械退出胸膜腔后縫合切口，然后經一個原來的套管將胸腔引流管引出并固定于皮膚上，接水封瓶引流和進行肺的復張。部分病變肺組織以10%甲醛溶液固定；其余病變肺組織迅速放入液氮，并轉移到-80 ℃冰箱保存。

1.2.2肺腺癌組織CCL20、CCR6免疫組織化學染色10%甲醛溶液固定，石蠟包埋的肺腺癌組織切片厚約4 μm。二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，熱修復140 ℃，2 min；3%過氧化氫去離子水孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2 min×3次；滴加鼠抗人CCL20單克隆抗體或鼠抗人CCR6單克隆抗體，4 ℃過夜，PBS沖洗2 min×3次；依次滴加聚合物輔助劑和辣根酶標記的兔抗IgG工作液，37 ℃孵育20 min，每步后均進行PBS沖洗，2 min×3次；二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木精復染，常規脫水、透明、樹膠封固鏡檢。PBS替代一抗作陰性對照。

1.2.3肺腺癌組織CCL20、CCR6免疫組織化學染色結果評價由2名有經驗的病理醫生采用雙盲法評價組織切片CCL20和CCR6陽性腫瘤細胞比例和染色強度，評分均為0～3分，其中0～25%腫瘤細胞染色陽性為0分；26%～50%腫瘤細胞染色陽性為1分；51%～75%腫瘤細胞染色陽性為2分；76%～100%腫瘤細胞染色陽性為3分；趨化因子或其受體高表達的定義為50%以上的腫瘤細胞染色陽性；不著色，陰性為0分；淡黃色，弱陽性為1分；棕黃色，陽性為2分；棕褐色，強陽性為3分。每個標本計算染色指數：染色指數=染色強度×陽性腫瘤細胞比例/100%。

1.2.4肺腺癌組織CCL20、CCR6 mRNA表達的實時熒光定量PCR檢測引物設計使用Primers軟件，CCL20引物序列上游：5′-ATGTGCTGTACCAAGAGTTT-3′，下游：5′-CAAGTCTGTTTTGGATTTGC-3′；CCR6引物序列上游：5′-CCATTCTGGGCAGTGAGTCA-3′，下游：5′-AGCAGCATCCCGCAGTTAA-3′；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物序列上游：5′-ATCCCATCACCATCTTCCAG-3′，下游：5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。PCR熱循環參數：95℃ 5 min，然后3步反應：95℃ 15 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，進行35個循環，于每個循環的第3步(即72℃ 30 s)收集熒光信號。擴增完畢后，進入結果分析界面，以GAPDH為內參照基因，與對照組相比，得到目的基因表達的相對定量值(RQ)，將RQ用于統計分析。

1.2.5肺腺癌組織CCL20、CCR6蛋白表達的蛋白質印跡(Western blot)法檢測提取肺腺癌組織總蛋白，測定總蛋白水平，上樣蛋白總量為50 μg，以3%十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液定容于等體積，加入5×上樣緩沖液，常溫下聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，4 ℃電轉至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)孵育相應一抗(1∶200)和二抗(1∶5 000)，然后化學發光，X線曝光、顯影、定影。用Quantity One軟件分析Western blot圖片，以目的蛋白與內參吸光度比值進行半定量分析。

2　結果

2.1兩組CCL20、CCR6表達情況CCL20在肺腺癌組織中主要表達于細胞膜和細胞質，CCR6在肺腺癌組織主要表達于細胞質；二者在肺腺癌癌旁組織中均無明顯表達(見圖1)。復發組CCL20、CCR6陽性腫瘤細胞比例評分的總分分別為109、96分，非復發組分別為44、42分(見表1)；復發組CCL20、CCR6染色強度評分的總分分別為138、140分；非復發組分別為142、138分(見表2)。

表1　兩組CCL20、CCR6陽性腫瘤細胞比例評分分布情況〔n(分)〕

表2　兩組CCL20、CCR6染色強度評分分布情況〔n(分)〕

2.2兩組CCL20、CCR6高表達率和染色指數比較兩組CCL20、CCR6高表達率和染色指數比較，差異均有統計學意義(P<0.05，見表3)。

2.3兩組CCL20、CCR6 mRNA和蛋白表達比較復發組CCL20、CCR6 mRNA表達較非復發組分別增加82.3%、56.4%，CCL20、CCR6蛋白表達較非復發組分別增加292.0%、188.0%，差異均有統計學意義(P<0.05，見表4)。

3　討論

近年來，肺癌已成為世界癌癥相關死亡的首位原因。據估計，2010年，僅在美國，肺癌的新增病例為222 000人，死亡病例為157 000人[8]。腺癌常表現為周圍型肺實質腫塊。顯微鏡下可見到腺癌由新生的立方和柱狀細胞構成，傾向于形成有纖維基質支持的腺樣結構。細胞核可變大或不規則，含有明顯的核仁，胞質中可見黏蛋白。腺癌傾向于氣管外生長，但也可循肺泡壁蔓延，常在肺邊緣部形成直徑為2～4 cm的腫塊。腺癌早期即可侵犯血管、淋巴管，常在原發癌引起癥狀前即已轉移，易轉移至肝、腦和骨，更易累及胸膜而引起胸腔積液[9]。

表3　兩組CCL20、CCR6高表達率和染色指數比較

注：a為t值

表4　兩組CCL20、CCR6 mRNA和蛋白表達比較

注：A為CCL20在肺腺癌組織中的表達情況；B為CCL20在癌旁組織中的表達情況；C為CCR6在肺腺癌組織中的表達情況；D為CCR6在癌旁組織中的表達情況

趨化因子組成趨化細胞因子家族，在生理狀態及炎性狀態下，趨化全身白細胞的遷移，參與血管的生成、胚胎的發育、自身免疫以及腫瘤的生長和轉移[10]。BABA等[11]首先確定CCL20為GPR-CY4的高度選擇性和功能性激動劑，然后按照趨化因子受體的命名法將此受體命名為CC趨化因子受體6或CCR6。經典鈣動員和/或CCR6轉染細胞系的遷移實驗一致表明CCL20趨化因子的唯一受體是CCR6，且CCL20無法引發其他已知的趨化因子受體的生物應答[11]。趨化因子及其受體在多種細胞中表達，其中包括白細胞和腫瘤細胞[12]。一些癌細胞或腫瘤相關的白細胞產生的趨化因子是腫瘤細胞的生長因子。趨化因子也能通過吸引內皮細胞使血管再生或通過影響癌細胞的運動或遷移促進腫瘤的生長或轉移。本研究結果顯示，CCL20在肺腺癌組織中主要表達于細胞膜和細胞質，CCR6在肺腺癌組織中主要表達于細胞質，二者在肺腺癌癌旁組織中均無明顯表達；復發組CCL20、CCR6高表達率和染色指數均明顯高于非復發組；與非復發組相比，復發組肺腺癌組織中CCL20、CCR6 mRNA表達分別增加82.3%、56.4%，CCL20、CCR6蛋白表達分別增加292.0%、188.0%。

以往在其他惡性腫瘤的研究中，也發現了腫瘤細胞CCL20及CCR6表達增加。對人胰腺導管腺癌組織的諾瑟雜交分析顯示，與正常胰腺組織相比，惡變組織中CCL20的轉錄明顯上調[13]。原位雜交顯示，導管樣癌細胞和腫瘤相關巨噬細胞在體外均來源于CCL20 mRNA。而且胰腺腫瘤細胞系不僅表達了CCL20的轉錄，同時表達了其特異性受體CCR6的轉錄。反轉錄PCR(RT-PCR)分析和免疫組織化學染色發現，乳腺癌腫瘤細胞有CCL20 mRNA及蛋白的強烈表達[14]。RUBIE等[15]也研究了肝細胞癌中CCL19、CCL20、CCL21、CXCL12及其受體的表達，發現所有趨化因子在正常肝臟和肝細胞癌組織中均有表達，而CCL20是肝細胞癌組織中唯一表達明顯上調的趨化因子。在肝細胞癌組織中唯一明顯上調的趨化因子受體是CCR6。CHANG等[16]研究發現，鼻咽癌腫瘤細胞中CCL20過表達，與正常對照、完全緩解和長期無病患者比較，未治療的、復發的和遠處轉移的鼻咽癌患者血清CCL20水平明顯升高。在以有效的自分泌和旁分泌環為基礎的前提下，結直腸癌腫瘤細胞以非極性的方式同時表達CCL20和CCR6，與正常結腸黏膜比較，結直腸癌黏膜CCR6表達上調，其相應的CCL20表達也上調[17]。KIRSHBERG等[18]研究了CCL20/CCR6/白介素17(IL-17)在NSCLC生長中的特異性作用，結果顯示CCL20在77.5%的腫瘤患者中高表達，CCR6在16.5%的腫瘤患者中高表達，CCR6的高表達與短的無病存活相關，與疾病復發風險獨立相關；CCL20刺激后癌細胞的克隆形成能力增加，這一效應部分依賴于ERK磷酸化和信號轉導；在NSCLC患者中有IL-17表達，IL-17增加了癌細胞產生CCL20；CCL20/CCR6促進了NSCLC疾病的進展，CCR6被認為是潛在的新的預后標志物，CCL20/CCR6/IL-17軸是潛在的新的治療靶點。

綜上所述，肺腺癌組織中有CCL20和CCR6的高表達。復發和轉移患者CCL20和CCR6表達比例更高，且CCL20、CCR6 mRNA和蛋白的表達明顯增加。肺腺癌的發生發展可能與CCL20及CCR6高表達介導的腫瘤免疫反應有關。進一步研究其信號轉導通路，可能為肺腺癌的治療提供新的靶點。

作者貢獻：張霄鵬負責全面工作；胡志娟負責論文撰寫；孟愛宏負責篩選患者入組；賈曉梅負責資料收集；段國辰、王志康、趙慶濤負責完成手術臨床操作。

本文無利益沖突。

[1]PARKIN D M,BRAY F,FERLAY J,et al.Global cancer statistics,2002[J].CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-108.

[2]ZLOTNIK A,YOSHIE O.Chemokines:a new classification system and their role in immunity[J].Immunity,2000,12(2):121-127.

[3]MANTOVANI A,ALLAVENA P,SOZZANI S,et al.Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors[J].Semin Cancer Biol,2004,14(3):155-160.

[4]MANTOVANI A.Chemokines in neoplastic progression[J].Semin Cancer Biol,2004,14(3):147-148.

[5]BEIDER K,ABRAHAM M,BEGIN M,et al.Interaction between CXCR4 and CCL20 pathways regulates tumor growth[J].PLoS One,2009,4(4):e5125.DOI:10.1371/journal.pone.0005125.

[6]BURGER J A,KIPPS T J.CXCR4:a key receptor in the crosstalk between tumor cells and their microenvironment[J].Blood,2006,107(5):1761-1767.

[7]MOUNTAIN C F.Revisions in the international system for staging lung cancer[J].Chest,1997,111(6):1710-1717.

[8]JEMAL A,SIEGEL R,XU J,et al.Cancer statistics 2010[J].CA Cancer J Clin,2010,60(5):277-300.

[9]SAKASHITA S,SAKASHITA M,SOUND TSAO M.Genes and pathology of non-small cell lung carcinoma[J].Semin Oncol,2014,41(1):28-39.

[10]YOSHIE O,IMAI T,NOMIUYAMA H.Chemokines in immunity[J].Adv Immunol,2001,78:57-110.

[11]BABA M,IMAI T,NISHIMURA M,et al.Identification of CCR6,the specific receptor for a novel lymphocyte-directed CC chemokine LARC[J].J Biol Chem,1997,272(23):14893-14898.

[12]VICARI A P,CAUX C.Chemokines in cancer[J].Cytokine Growth Factor Rev,2002,13(2):143-154.

[13]KLEEFF J,KUSAMA T,ROSSI D L,et al.Detection and localization of Mip-3alpha/LARC/Exodus,a macrophage proinflammatory chemokine,and its CCR6 receptor in human pancreatic cancer[J].Int J Cancer,1999,81(4):650-657.

[14]BELL D,CHOMARAT P,BROYLES D,et al.In breast carcinoma tissue,immature dendritic cells reside within the tumor,whereas mature dendritic cells are located in peritumoral areas[J].J Exp Med,1999,190(10):1417-1426.

[15]RUBIE C,FRICK V O,WAGNER M,et al.Enhanced expression and clinical significance of CC-chemokine MIP-3 alpha in hepatocellular carcinoma[J].Scand J Immunol,2006,63(6):468-477.

[16]CHANG K P,HAO S P,CHANG J H,et al.Macrophage inflammatory protein-3alpha is a novel serum marker for nasopharyngeal carcinoma detection and prediction of treatment outcomes[J].Clin Cancer Res,2008,14(21):6979-6987.

[17]RUBIE C,OLIVEIRA V,KEMPF K,et al.Involvement of chemokine receptor CCR6 in colorectal cancer metastasis[J].Tumor Biol,2006,27(3):166-174.

[18]KIRSHBERG S,IZHAR U,AMIR G,et al.Involvement of CCR6/CCL20/IL-17 axis in NSCLC disease progression[J].PLoS One,2011,6(9):e24856.DOI:10.1371/journal.pone.0024856.

(本文編輯：崔沙沙)

Expression of Chemokine CCL20 and Its Receptor CCR6 in Lung Adenocarcinoma and Their Relationship with Recurrence or Metastasis

ZHANGXiao-peng,HUZhi-juan,MENGAi-hong,JIAXiao-mei,DUANGuo-chen,WANGZhi-kang,ZHAOQing-tao.DepartmentofThoracicSurgery,HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050051,China

Correspondingauthor:ZHANGXiao-peng,DepartmentofThoracicSurgery,HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050051,China；E-mail:13931115929@163.com

ObjectiveTo observe the expression status of CCL20 and CCR6 in cancer tissue of patients with recurrent and non-recurrent lung adenocarcinoma and explore the effects of CCL20 and CCR6 in the development of the disease.Methods162 lung adenocarcinoma patients who received treatment in Hebei General Hospital from February 2009 to December 2011 were selected.The patients were divided into recurrent group(n=50) and non-recurrent group(n=112) according to their recurrence and metastasis conditions.The expression,the mRNA expression and the protein expression of CCL20 and CCR6 were detected by immunohistochemistry staining,real-time PCR and Western-blot method respectively.ResultsCCL20 was mainly expressed in cell membrane and cytoplasm of lung adenocarcinoma tissue,while CCR6 expressed in cytoplasm of lung adenocarcinoma tissue.The two had no significant expression in para-carcinoma tissue of lung adenocarcinoma.The high-expression ratio and the staining index of CCL20 and CCR6 in recurrent group was significantly higher than those of the non-recurrent group(P<0.05).The high-expression ratio of CCL20 and of CCR6 between recurrent and non-recurrent group were 38(76.0%) to 9(8.0%) and 33(66.0%) to 7(6.3%) separately;and the staining index of CCL20 and CCR6 between the two groups were(150.4±10.2) to(62.5±8.5) and(134.4±11.3) to(58.0±9.5) respectively.Compared with non-recurrent group,the mRNA expression of CCL20 and CCR6 in recurrent group increased by 82.3% and 56.4% respectively,the protein expression of CCL20 and CCR6 increased by 292.0% and 188.0% respectively,showing significant differences(P<0.05).ConclusionPresenting high expression in lung adenocarcinoma tissue,CCL20 and CCR6 are related with the development of lung adenocarcinoma.

Lung neoplasms;Chemokine CCL20;Receptors,CCR6;Recurrence;Neoplasm metastasis

050051河北省石家莊市，河北省人民醫院胸外科(張霄鵬，段國辰，王志康，趙慶濤)，腎內科(胡志娟)，門診部(賈曉梅)；河北醫科大學第二醫院呼吸內科(孟愛宏)

張霄鵬，050051河北省石家莊市，河北省人民醫院胸外科；E-mail:13931115929@163.com

R 734.2

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.25.013

2016-04-12；

2016-06-18)