腦白質低灌注損傷后星形膠質細胞縫隙連接蛋白43的表達變化

秦　川　渠文生

華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院神經內科　武漢　430030

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腦白質低灌注損傷后星形膠質細胞縫隙連接蛋白43的表達變化

秦川渠文生△

華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院神經內科武漢430030

目的研究慢性腦白質缺血后星形膠質細胞和縫隙連接蛋白Connexin43(Cx43)的變化。方法原代培養星形膠質細胞，建立體外慢性缺氧模型；雙側頸總動脈狹窄法，建立慢性低灌注腦白質損傷小鼠模型；免疫熒光共染觀察星形膠質細胞活化與Cx43表達。Western蛋白定量分析髓鞘相關指標髓鞘相關糖蛋白MAG，星形膠質細胞標記物GFAP和Cx43的表達。結果與對照組相比，細胞慢性缺氧7d后，星形膠質細胞明顯增生活化，伴隨Cx43表達水平明顯上調。Westernblot發現，在慢性腦白質缺血過程中，MAG的表達逐漸降低，GFAP持續增高，Cx43表達明顯上調。免疫熒光共標記可見，星形膠質細胞中Cx43表達上調，主要分布于胼胝體中央區。結論慢性腦白質缺血損傷過程伴隨星形膠質細胞Cx43表達增加，Cx43可能成為臨床治療血管性認知障礙的新靶點。

缺血性腦白質損傷；星形膠質細胞；縫隙連接蛋白43

隨著社會人口構成的老齡化，認知障礙疾病對人類健康造成的影響日益突出。血管性認知功能障礙(vascularcognitiveimpairment，VCI)是臨床最常見的認知功能障礙類型之一。以小血管病和低灌注為主要病因，以皮質下多發腔隙性梗死和缺血性腦白質病變(Whitematterlesions，WML)為主要腦部損傷特點的皮質下缺血性認知功能障礙，是VCI的主要和常見亞型[1]。“白質神經血管單元”由神經元軸突、髓鞘、各種膠質細胞以及深部血管構成。其中，星形膠質細胞與各種膠質細胞形成廣泛的網絡合胞體[2]，，對維持“白質神經血管單元”的發育、分化和功能穩定具有重要作用[3-4]。然而，星形膠質細胞表達的縫隙連接蛋白conexin43(Cx43)是否直接參與腦白質損傷的病理過程尚不明確。本實驗擬通過建立慢性低灌注所致白質損傷小鼠模型和原代星形膠質細胞慢性缺氧模型，研究小鼠在低灌注的不同時期星形膠質細胞激活增生情況與Cx43的表達改變，以期解釋腦白質缺血缺氧改變所致的脫髓鞘改變與星形膠質細胞Cx43表達變化之間的關系。

1　材料與方法

1.1主要儀器與試劑激光共聚焦熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；恒溫冰凍切片機(德國Leica公司)；牛血清白蛋白BSA、DMEM/F12培養基(美國Gibco公司)；山羊抗MAG單克隆抗體(美國SantaCruz公司)；小鼠抗GFAP單克隆抗體、兔抗Connexin43多克隆抗體(美國Millipore公司)；組織細胞裂解液、FITC標記的羊抗小鼠IgG、Cy3標記的兔抗羊IgG、HRP標記IgG(美國Pierce公司)。

1.2動物分組與制作模型健康SPF級成年C57BL/6J小鼠30只，雄性，體質量24～29g，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供。遵循隨機原則進行實驗動物分組：假手術組(n=10)、術后1d組(n=10)、術后10d組(n=5)和術后1個月組(n=5)，其中假手術組、術后1個月組各5只與術后1d組、術后10d組用于Westernblot檢測，假手術組和術后1個月組余5只用于免疫熒光檢測。小鼠BCAS模型的建立：根據ShibataM報道的方法稍加改良[4]，雙側頸總動脈狹窄(bilateralcommoncarotidarterystenosis，BCAS)小鼠模型，用內徑0.18mm的microcoil夾套小鼠雙側頸總動脈，可選擇性損傷前額葉-皮層下白質，影響該神經環路，而無明顯的灰質損傷。假手術組分離雙側頸總動脈后縫合頸部切口，不上彈簧圈。

1.3原代星形膠質細胞培養與體外模型建立參考文獻報道[5]的方法稍加改良進行大鼠乳鼠大腦皮質星形膠質細胞原代培養。選取新生0～1d的SD大鼠，無菌條件下取腦，剔除軟腦膜及血管；用眼科剪剪碎組織，直至成為1mm3的組織碎塊；0.125%胰酶37 ℃條件下消化2min，含血清培養基終止消化；無菌巴氏管反復吹打為細胞懸液；直徑200目篩網過濾；4℃離心 8min(800r/min)，棄上清；用全培養基(DMEM/F12培養基+20%胎牛血清)重懸細胞；接種于多聚賴氨酸包被的培養瓶中，置于37℃、95%O2、5%CO2培養箱中培養；常規換液培養；實驗所用細胞為傳2代細胞。通過化學法建立體外慢性缺氧模型，基本方法為1MCoCl2誘導星形膠質細胞7d。

1.4樣本采集與檢測培養細胞在化學法缺氧干預7d后多聚甲醛固定。術后1個月麻醉取腦，行冠狀面切片，厚度為10m，用于冰凍切片染色取相同位置的切片進行染色。染色主要步驟：4 ℃預冷的多聚甲醛溶液固定15min破膜液，室溫孵育10～15min；10%BSA封閉液，室溫封閉2h；添加稀釋的一抗(1：200)，在濕盒內孵育過夜；添加稀釋的二抗(1：200)，室溫避光孵育1h；封片后觀察。

術后3d、10d、1個月取腦，分離提取白質總蛋白，用于Western定量檢測。基本步驟為：組織細胞裂解液裂解腦組織，測定調整蛋白濃度后，上樣60μg蛋白，120V的恒壓繼續電泳90min，調整電流為250mA，4℃電泳轉移120min；加入稀釋的一抗(1：400)，4℃緩慢搖動過夜；二抗(1：1000)室溫緩慢搖動1h；顯色掃膜拍照。測量條帶的OD值，以GAPDH為基準折算相對值，進行統計學分析。

2　結果

2.1慢性缺氧細胞的變化化學誘導7d后，原代星形膠質細胞慢性缺氧模型建立成功。通過免疫熒光共標記GFAP和CX43，缺氧模型細胞組與對照組(圖1A)相比，可見缺氧的星形膠質細胞明顯增生活化，胞體肥厚，細胞排列紊亂、密集，而Cx43表達水平明顯上調(圖1B)。

圖1　慢性缺氧后星形膠質細胞活化和CX43表達A：對照組；B慢性白質缺血模型組。綠色熒光標記GFAP，紅色熒光標記Cx43

2.2動物模型中相關蛋白的表達變化慢性低灌注所致白質損傷小鼠模型成功建立后，Westernblot檢測發現，在慢性腦白質缺血過程中，髓鞘損傷標記物從BCAS第3d起表達明顯降低，1個月時降至最低，降低趨勢具有統計學意義。GFAP持續增高，縫隙連接蛋白Cx43表達明顯上調(圖2)。

圖2　慢性腦白質缺血模型組相關蛋白的表達變化

2.3動物模型建立1月后星型膠質細胞表達CX43的變化通過免疫熒光共標記可見，與對照組(圖3A1/A2)相比，慢性低灌注模型組GFAP的表達明顯增高(圖3B1)，伴隨Cx43的表達增高(圖3B2)，GFAP和Cx43共表達，表明慢性腦白質缺血1個月后，星形膠質細胞的增殖仍活躍，伴隨Cx43的表達增高。Cx43表達上調，主要分布于胼胝體中央區，即白質損傷最嚴重的區域。

圖3　慢性腦白質缺血1個月后的變化A：對照組；B慢性白質缺血模型組。綠色熒光標記GFAP，紅色熒光標記Cx43

3　討論

星形膠質細胞作為神經系統重要的支持細胞和輔助免疫細胞，其功能具有雙面性。一方面，活化后肥大、增生的星形膠質細胞有助于保證缺血損傷后結構的相對完整，可維持神經纖維的營養，促進其再生；另一方面，過度增生的星形膠質細胞可產生大量氧自由基和炎性因子以及谷氨酸等興奮性神經遞質，加重局灶組織損傷，同時其產生的內皮素等還可誘導小膠質細胞炎性反應的進一步加重[2，5]。本研究通過免疫熒光雙標技術和Western技術觀察低灌注后不同時間點胼胝體中央區星形膠質細胞增殖的變化，發現小鼠白質區域(胼胝體中央部)星形膠質細胞活化增殖，1個月時星形膠質細胞增殖明顯，活化的星形膠質細胞胞體肥大，軸突分支增粗濃密，與文獻報道[4]相一致。伴隨星形膠質細胞活化增殖，Cx43表達量明顯上調，且在低灌注1個月后損傷最為明顯。在離體慢性缺氧模型中，星形膠質細胞與Cx43也具有同樣的變化趨勢。這些結果提示星形膠質細胞活化伴隨的Cx43表達增加，可能參與到白質損傷與修復的過程中。

髓鞘相關糖蛋白MAG是髓鞘受損額敏感指標，在各類白質損傷模型中其表達量均明顯下調[4，6]。我們的結果發現隨著低灌注時間延長，MAG表達量逐漸降低，到1個月時下降最為顯著，與既往文獻報道相一致[4]，與星形膠質細胞縫隙連接蛋白Cx43表達上調呈負相關關系。文獻報道稱，腦缺血時星形膠質細胞縫隙連接可介導損傷信號分子(Ca2+，Glu等)在細胞間傳播，導致損傷的擴大[7]。同時神經損傷導致的細胞外Ca2+降低及炎性因子釋放，可激活星形膠質細胞半通道，釋放ATP、谷氨酸。Glu、ATP相關信號通路誘發膠質細胞產生Ca2+信號，調控軸突傳導，是參與缺血時白質神經元、少突膠質細胞及軸突損傷的重要因素[8]。由此我們推測若選擇性抑制星形膠質細胞縫隙連接通訊的表達及功能可能可以通過減少ATP、Glu等興奮性物質的釋放，抑制損傷因子在膠質細胞網絡合胞體內的異常傳播而產生腦白質保護作用。這也是我們值得進一步探索的研究方向。

本研究發現缺氧后星形膠質細胞增生活躍和Cx43表達持續上調的動態變化，特點與髓鞘損傷變化相一致，為進一步闡明星形膠質細胞與Cx43在低灌注腦白質損傷病變過程中的具體作用提供了研究基礎。

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(收稿2016-05-16)

國家自然基金，編號：81400977

渠文生，男，1982年3月出生，河南南陽市人，目前為同濟醫院神經內科主治醫師，從事腦血管病相關研究。E-mail：qws0309@163.com

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1673-5110(2016)16-0044-03