高血糖通過HBP途徑增加SD大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞內(nèi)β-catenin穩(wěn)定性

周福興， 陳　穎， 劉高偉， 劉海霞 ，李　娜 ，馬　芮，陳必良

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安710032；2.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)教研室，陜西 西安 710032)

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高血糖通過HBP途徑增加SD大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞內(nèi)β-catenin穩(wěn)定性

周福興1， 陳穎2， 劉高偉1， 劉海霞1，李娜1，馬芮1，陳必良1

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安710032；2.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)教研室，陜西 西安 710032)

目的探討高血糖通過HBP途徑增加子宮內(nèi)膜細(xì)胞內(nèi)β-catenin穩(wěn)定性的相關(guān)機(jī)制。方法50只SD雌性大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、禁食組、高糖高脂組、葡萄糖胺組和葡萄糖組。高糖高脂組給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，其他組普通飼料喂養(yǎng)。8周后將高糖高脂組和正常對(duì)照組大鼠處死；禁食組禁食24h后處死；葡萄糖胺組禁食24h后給予葡萄糖胺 2.50g/kg灌胃，3h后處死；葡萄糖組禁食24h后給予葡萄糖5g/kg灌胃，3h后處死。分別取各組大鼠子宮內(nèi)膜組織，檢測(cè)相關(guān)蛋白和基因表達(dá)水平。結(jié)果HSHF組和NC組相比，各飼養(yǎng)周空腹血糖水平均明顯升高(t值2.34～2.78，均P<0.05)。GLU組和FASTING組相比，血糖水平明顯升高(t=3.46，P<0.05)，而GLN組和FASTING組相比血糖水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.84，P>0.05)。Westernblot檢測(cè)結(jié)果相對(duì)表達(dá)量分析顯示，GLN組和GLU組子宮內(nèi)膜組織內(nèi)β-catenin、O-GlcNAc表達(dá)量均明顯高于FASTING組(t值3.44～5.08，均P<0.05)，而GLN組和GLU組之間β-catenin、O-GlcNAc表達(dá)量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t值分別為0.75、0.66，均P>0.05)。RT-PCR檢測(cè)HSHF組Ctnnb1表達(dá)水平與NC組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.43，P>0.05)，而β-catenin特異性靶基因CyclinD1和Axin2表達(dá)水平HSHF組明顯高于NC組(t值分別為4.48、5.26，均P<0.05)。結(jié)論高血糖能夠通過HBP途徑，使β-catenin的O-GlcNAc化增加，從而增加其穩(wěn)定性，使進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的β-catenin增多，持續(xù)作用于下游靶基因引起細(xì)胞異常增殖分化。

高血糖；內(nèi)膜癌；WNT/β-catenin；O-GlcNAc

[Keywords]hyperglycemia;endometrialcancer;WNT/β-catenin;O-GlcNAc

子宮內(nèi)膜癌是女性三大惡性腫瘤之一。2014年美國女性內(nèi)膜癌的新增病例為52 630例，死亡病例為8 590例[1]，在女性常見的惡性腫瘤中占第4位，生殖系統(tǒng)腫瘤中占第1位。中國女性子宮內(nèi)膜癌的患病率僅次于宮頸癌，位于生殖系統(tǒng)腫瘤第2位。隨著人們生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的西方化改變，國內(nèi)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率逐年上升，并呈現(xiàn)年輕化，高侵襲性，低分化等特點(diǎn)，嚴(yán)重危害女性生命健康[2]。 肥胖[3]和糖尿病[4-5]是子宮內(nèi)膜癌的兩大危險(xiǎn)因素。而高血糖作為二者共同特征，已發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[6-7]，但是血糖升高是否與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生相關(guān)目前尚不清楚。因此，本研究重點(diǎn)探索高血糖對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞通路的影響及可能的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)以高糖高脂喂養(yǎng)的SD大鼠為切入點(diǎn)，研究高血糖狀態(tài)下子宮內(nèi)膜分子通路變化的情況。通過建立高糖高脂喂養(yǎng)的SD大鼠模型，模擬人類高血糖狀態(tài)下內(nèi)膜組織WNT/β-catenin通路異常狀態(tài)，探討高血糖狀態(tài)下氧連接的氮乙酰葡萄糖胺(Nacetylglucosamine，O-GlcNAc)化對(duì)β-catenin異常升高的作用。

1材料與方法

1.1動(dòng)物

8～10周齡雌性SD大鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心)50只，體重180～200g。

1.2主要試劑

O-GlcNAc抗體(RL2,Abcam公司)，β-catenin抗體(Abcam公司)，葡萄糖胺(Sigma公司)，RNA提取試劑盒(TaKaRa公司)。

1.3動(dòng)物分組及模型的建立

將所有實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組(normalcontrolgroup，NC組)、禁食組(fastinggrop，F(xiàn)ASTING組)、高糖高脂組(highsugarandhighfatgroup，HSHF組)、葡萄糖胺組(glucosaminegroup，GLN組)和葡萄糖組(glucosegroup，GLU組)。HSHF組喂養(yǎng)高糖高脂飼料(普通飼料中加入10%的豬油、20%的蔗糖、2.5%的膽固醇、1%的膽酸鈉，特洛菲公司)，其他組喂養(yǎng)普通飼料喂養(yǎng)(65%碳水化合物，11% 脂肪，24%蛋白)，自由飲水。NC組和HSHF組連續(xù)喂養(yǎng)8周后處死。FASTING組禁食24h后處死；GLN組禁食24h后給予葡萄糖胺 2.50g/kg灌胃，3h后處死；GLU組禁食24h后給予葡萄糖5g/kg灌胃，3h后處死。

1.4觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

觀察大鼠一般狀態(tài)包括精神活動(dòng)狀態(tài)，皮毛色澤，凈飲食量，二便等狀況。每周稱量并記錄體重。檢測(cè)空腹血糖：夜間禁食12h，尾部取血檢測(cè)空腹血糖。內(nèi)膜組織取材前陰道涂片確定大鼠生理周期，在動(dòng)情期處死大鼠，取子宮角，迅速刮取子宮內(nèi)膜置于液氮中凍存，用于蛋白免疫印跡(westernblot，WB)和實(shí)時(shí)定量PCR(real-timepolymerasechainreaction，RT-PCR)檢測(cè)。

1.5 蛋白免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

提取內(nèi)膜組織蛋白，測(cè)定蛋白含量后，按每孔30ug總蛋白量上樣進(jìn)行電泳分離，0.30A橫流電轉(zhuǎn)2h，5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉抗體2h，分別加入一抗孵育液中(β-catenin1:4 000稀釋，RL2 1:1 000稀釋)4℃孵育過夜。0.25%PBST洗膜10min×3次，用含辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫孵育2h，洗膜10min×3次，滴加化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行檢測(cè)，ImageJ軟件分析圖像。

1.6 RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)水平

TaKaRaRNA提取試劑盒(TaKaRaMiniBESTUniversalRNAExtractionKit)提取內(nèi)膜組織RNA，測(cè)濃度，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RealTimePCR檢測(cè)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)參，進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。引物設(shè)計(jì)與合成如下：Ctnnb1，正義：5′-GTGCAATTCCTGAGCTGACC-3′，反義：5′-CGGGCTG￣TTTCTACGTCATT-3′；CyclinD1，正義：5′-TCAAGTGTG￣ACCCGGACTG-3′，反義：5′-GACCAGCTTCTTCCTCCACTT-3′；Axin2，正義：5′-TCCTTACCGCATGGGGAGTA-3′，反義：5′-GTGGGTTCTCGGGAAGTGAG-3′。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1各組血糖值比較

HSHF組和NC組相比，各飼養(yǎng)周空腹血糖水平均明顯升高(t值2.34～2.78，均P<0.05)。GLU組和FASTING組相比，血糖水平明顯升高(t=3.46，P<0.05)，而GLN組和FASTING組相比血糖水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.84，P>0.05)(圖1)。

圖1各組血糖值比較(a為NC組和HSHF組飼養(yǎng)周空腹血糖水平對(duì)比；b為FASTING組、GLU組和GLN組大鼠血糖水平的比較)

Fig.1Comparisonofbloodglucoselevelsamongdeffrentgroups(a:fastingbloodglucoselevelsinNCgroupandHSHFgroup;b:BloodglucoselevelsinFASTING,GLUandGLNgroups)

2.2子宮內(nèi)膜組織內(nèi)β-catenin和O-GlcNAc表達(dá)比較

Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，HSHF組子宮內(nèi)膜組織內(nèi)β-catenin表達(dá)量明顯高于NC組，O-GlcNAc化水平也增高。相對(duì)表達(dá)量分析顯示，GLN組和GLU組子宮內(nèi)膜組織內(nèi)β-catenin、O-GlcNAc表達(dá)量均明顯高于FASTING組(t值3.44～5.08，均P<0.05)，而GLN組和GLU組之間β-catenin、O-GlcNAc表達(dá)量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t值分別為0.75、0.66，均P>0.05)(圖2)。

圖2Westernblot檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織內(nèi)β-catenin、O-GlcNAc表達(dá)結(jié)果

Fig.2Expressionsofβ-cateninandO-GlcNAcinendometriumtissuesdetectedbyWesternblot

2.3正常對(duì)照組高糖高脂組RT-PCR檢測(cè)結(jié)果比較

RT-PCR檢測(cè)HSHF組Ctnnb1表達(dá)水平與NC組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.43，P>0.05)，而β-catenin特異性靶基因CyclinD1和Axin2表達(dá)水平HSHF組明顯高于NC組(t值分別為4.48、5.26，均P<0.05(圖3)。

圖3RT-PCR檢測(cè)NC組和HSHF組中Ctnnb1,CyclinD1和Axin2的表達(dá)水平。

Fig.3ExpressionsofCtnnb1,CyclinD1andAxin2detectedbyRT-PCR

3討論

3.1WNT/β-catenin通路正常和異常狀態(tài)下對(duì)細(xì)胞生長發(fā)育的作用

WNT/β-catenin通路是真核生物一條保守的分子通路，能夠調(diào)節(jié)多種細(xì)胞進(jìn)程如細(xì)胞生存、凋亡、轉(zhuǎn)移等[8-9]。β-catenin是這條通路中的核心蛋白，正常代謝過程中合成的β-catenin蛋白在胞質(zhì)中會(huì)被酶解復(fù)合體降解，只有少部分β-catenin能進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與靶基因結(jié)合來調(diào)控細(xì)胞生理活動(dòng)[10]。因此當(dāng)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin異常增加，會(huì)使進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的β-catenin增多，持續(xù)作用于核內(nèi)的靶基因，誘導(dǎo)細(xì)胞異常增殖分化發(fā)生癌變[11]。β-catenin編碼基因的突變、酶解復(fù)合體突變和β-catenin本身結(jié)構(gòu)改變都可以造成β-catenin的異常增加[11]。近些年，越來越多的研究表明WNT/β-catenin通路異常與內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系，之前對(duì)子宮內(nèi)膜癌的研究多集中于β-catenin編碼基因突變和酶解復(fù)合體突變?nèi)鏏PC的突變[12-13]，對(duì)于β-catenin本身結(jié)構(gòu)改變所致的突變研究較少，所以本實(shí)驗(yàn)著重于β-catenin本身結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致通路突變的研究。

3.2氮乙酰葡萄糖胺化對(duì)于WNT/β-catenin通路的作用

O-GlcNAcylation是一種翻譯后修飾，與磷酸化類似，能夠使β-catenin蛋白O-GlcNAc化，使其結(jié)構(gòu)改變而不被酶解復(fù)合體識(shí)別[14]。O-GlcNAc化所需的GlcNAc基團(tuán)是由己糖胺合成途徑(hexosaminebiosynthesispathway，HBP)途徑的終產(chǎn)物UDP-GlcNAc提供的，HBP途徑是糖代謝的一個(gè)小分支，正常情況下細(xì)胞內(nèi)有大約5%的葡萄糖用于HPB途徑產(chǎn)生UDP-GlcNAc[14]。目前已有研究表明血糖升高可導(dǎo)致HBP途徑活躍，進(jìn)而通過O-GlcNACylation影響包括WNT/β-catenin在內(nèi)的一系列通路[15-17]。那么高血糖會(huì)不會(huì)通過HBP使β-catenin升高而誘導(dǎo)內(nèi)膜癌的發(fā)生呢？本研究主要通過檢測(cè)高糖高脂喂養(yǎng)的SD大鼠子宮內(nèi)膜β-catenin表達(dá)變化探究其與高血糖之間的可能的相關(guān)關(guān)系。

3.3血糖通過HBP途徑影響β-catenin的氮乙酰葡萄糖胺化水平

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HSHF組大鼠子宮內(nèi)膜組織β-catenin的表達(dá)量和O-GlcNAc化水平明顯高于NC組。HSHF組血糖升高，相應(yīng)的HBP途徑增強(qiáng)，使UDP-GlcNAc合成增多，進(jìn)而蛋白的O-GlcNAc化也增多。β-catenin也隨著血糖的升高而表達(dá)增加，提示我們?chǔ)?catenin可能與HBP途徑相關(guān),這與之前的文獻(xiàn)報(bào)道相符[14]。葡萄糖胺是HBP途徑的中間產(chǎn)物，能夠直接進(jìn)入HBP途徑參與下一步反應(yīng)[15]，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)給饑餓24h的SD大鼠灌胃葡萄糖胺后，子宮內(nèi)膜的β-catenin和O-GlcNAc的表達(dá)量明顯高于FASTING組，同樣的結(jié)果在出現(xiàn)在GLU組；但是相應(yīng)的血糖濃度GLN組和FASTING組比并沒有升高，而GLU組明顯升高，這支持了我們之前的假設(shè)即升高的血糖可以通過HBP途徑作用于β-catenin的使其表達(dá)量增高。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的β-catenin的O-GlcNAc化能改變其結(jié)構(gòu)[14,15-16]，提示血糖通過HBP途徑產(chǎn)生UDP-GlcNAc，作用于β-catenin使其結(jié)構(gòu)改變，穩(wěn)定性增加使其在細(xì)胞內(nèi)含量增加。

3.4高血糖引起的β-catenin的增加能夠進(jìn)一步激活下游的靶基因

為了驗(yàn)證β-catenin高表達(dá)是由于穩(wěn)定性增加導(dǎo)致的，而非β-catenin編碼基因Ctnnb1表達(dá)量增加導(dǎo)致的，本實(shí)驗(yàn)對(duì)HSHF組和NC組的Ctnnb1的表達(dá)量進(jìn)行了比較，HSHF組的Ctnnb1轉(zhuǎn)錄水平未發(fā)現(xiàn)明顯的增加，提示β-catenin細(xì)胞內(nèi)異常增高可能是由于其降解減少引起的。同時(shí)β-catenin的特異性靶基因Axin2和Cyclin1的表達(dá)量在HSHF組中明顯增高，說明高血糖引起的β-catenin的變化能夠進(jìn)一步激活下游的靶基因，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長增殖。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)高血糖能夠通過HBP途徑使β-catenin的O-GlcNAc化水平增加，導(dǎo)致穩(wěn)定性增加使進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的β-catenin增多，激活下游靶基因。而β-catenin激活的下游靶基因是否能進(jìn)一步引起細(xì)胞的異常增殖分化還需要進(jìn)一步研究，同時(shí)高血糖對(duì)于β-catenin的影響是否也對(duì)人類的子宮內(nèi)膜產(chǎn)生類似的影響還需要進(jìn)一步研究。

[1]SiegelR,MaJ,ZouZ, et al.Cancerstatistics, 2014 [J].CA:CancerJClin, 2014, 64(1):9-29.

[2]TorreLA,BrayF,SiegelRL, et al.Globalcancerstatistics, 2012 [J].CA:acancerjournalforclinicians, 2015,65(2):87-108.

[3]NevadunskyNS,VanArsdaleA,StricklerHD, et al.Obesityandageatdiagnosisofendometrialcancer[J].Obstetgynecol, 2014,124(3):300-6.

[4]PeteraJ,SmahelovaA.Diabetesmellitusandmalignancies[J].VnitrniLekarstvi, 2014, 60(2): 69-74.

[5]黃春琴,詹美色. 1608例妊娠期婦女葡萄糖耐量篩查分析 [J].中國婦幼健康研究, 2008, 19(6): 635-6

[6]LambeM,WigertzA,GarmoH, et al.Impairedglucosemetabolismanddiabetesandtheriskofbreast,endometrial,andovariancancer[J].CancerCauses&Control:CCC, 2011, 22(8): 1163-1171.

[7]ShikataK,NinomiyaT,KiyoharaY.Diabetesmellitusandcancerrisk:reviewoftheepidemiologicalevidence[J].CancerSci, 2013,104(1):9-14.

[8]VoronkovA,KraussS.Wnt/beta-cateninsignalingandsmallmoleculeinhibitors[J].CurrPharmDes, 2013,19(4):634-64.

[9]CleversH,NusseR.Wnt/beta-cateninsignalinganddisease[J].Cell, 2012,149(6):1192-1205.

[10]GordonMD,NusseR.Wntsignaling:multiplepathways,multiplereceptors,andmultipletranscriptionfactors[J].JBioChem, 2006,281(32):22429-33.

[11]CleversH.Wnt/β-CateninSignalinginDevelopmentandDisease[J].Cell, 2006, 127(3): 469-480.

[12]MarkowskaA,PawalowskaM,LubinJ, et al.Signallingpathwaysinendometrialcancer[J].ContempoOncol, 2014,18(3):143-148.

[13]DellingerTH,PlanutisK,TewariKS, et al.RoleofcanonicalWntsignalinginendometrialcarcinogenesis[J].ExpRevAnticancerTherapy,2012,12(1):51-62.

[14]Olivier-VanStichelenS,DehennautV,BuzyA, et al.O-GlcNAcylationstabilizesbeta-cateninthroughdirectcompetitionwithphosphorylationatthreonine41 [J].FASEBJ, 2014, 28(8): 3325-3338.

[15]Olivier-VanStichelenS,GuinezC,MirAM, et al.ThehexosaminebiosyntheticpathwayandO-GlcNAcylationdrivetheexpressionofbeta-cateninandcellproliferation[J].AmJphyEndocrimetab, 2012,302(4):E417-E424.

[16]AnagnostouSH,ShepherdPR.GlucoseinducesanautocrineactivationoftheWnt/beta-cateninpathwayinmacrophagecelllines[J].BiochemJ, 2008,416(2):211-218.

[17]HaJR,HaoL,VenkateswaranG, et al.beta-cateninisO-GlcNAcglycosylatedatSerine23:implicationsforbeta-catenin'ssubcellularlocalizationandtransactivatorfunction[J].ExperCellRes, 2014,321(2):153-66.

[專業(yè)責(zé)任編輯：張忠明]

Glucose enhances the stability of β-catenin via hexosamine biosynthetic pathway in endometrium of SD rats

ZHOU Fu-xing1, CHEN Ying2, LIU Gao-wei1, LIU Hai-xia1, LI Na1, MA Rui1, CHEN Bi-liang1

(1.DepartmentofGynecologyandObstetrics,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,ShaanxiXi’an710032,China;2.DepartmentofNaturalMedicine,SchoolofPharmacy,FourthMilitaryMedicalUniversity,ShaanxiXi’an710032,China)

ObjectiveToinvestigatethemechanismofhyperglycemiaenhancingthestabilityofβ-catenininendometrialcellsviahexosaminbiosyntheticpathyway(HBP).MethodsFemaleSDratswererandomlydividedinto5groups:normalcontrol(NC)group,fasting(FASTING)group,highsugarandhighfat(HSHF)group,glucosamine(GLN)groupandglucose(GLU)group.RatsintheHSHFgroupweregivenhighglucoseandhighfatdiet,whiletheothergroupsweregivennormaldiet.After8weeks’feedingratsinHSHFgroupandNCgroupwereexecutedandendometriumofthemwerecollected.RatsinFASTINGgroupwereexecutedafter24h.GLNgroupandGLUgroupwaslavagedwithglucosamine(2.50g/kg)andglucose(5g/kg)afterfastingfor24hours.Threehourslatertheratswereexecuted.Thenendometriumofratsineachgorupwascollectedtodetectexpressionsofproteinandgenes.ResultsComparedwithNCgroup,fastingbloodglucoselevelincreasedremarkablyinHSHFgroup(tvalueranged2.34-2.78,bothP<0.05).ComparedwithFASTINGgroup,glucoselevelofGLUgroupenhancedsignificantly(t=3.46,P<0.05),butGLNgroupwasnotsignificantlydifferent(t=0.84,P>0.05).Westernblotdetectionresultsshowedthattheexpressionsofβ-cateninandO-GlcNAcinGLNgroupandGLUgroupwereremarkablyhigherthanthoseinFASTINGgroup(tvalueranged3.44-5.08,respectively,allP<0.05),butthedifferencesinGLNgroupandGLUgroupwerenotsignificant(tvaluewas0.75and0.66,respectively,bothP>0.05).RT-PCRdetetionrevealedthatthedifferenceinCtnnb1expressionwasnotsignificantbetweenHSHFgroupandNCgroup(t=0.43, P>0.05),buttheexpressionsofCyclinD1andAxin2wereremarkablyhigherinHSHFgroupthaninNCgroup(tvaluewas4.48and5.26,respectively,bothP<0.05).ConclusionHyperglycemiacanenhanceO-GlcNAclevelofβ-cateninviaHBP,andthuselevateitsstabilitytohelptheaccululationofβ-catenin,whichcausesabnormalproliferationbyconsitentactionondownstreamtargetgenes.

2015-06-29

周福興(1989-)，男，碩士研究生，主要從事婦科腫瘤的研究。

陳必良，教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.01.005

R711.7

A

1673-5293(2016)01-0014-04