探究CD4+T細胞及淋巴細胞亞群在小兒哮喘中的臨床意義

吳百平，張永剛

(廣饒縣中醫院兒科，山東 東營 257300)

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探究CD4+T細胞及淋巴細胞亞群在小兒哮喘中的臨床意義

吳百平，張永剛

(廣饒縣中醫院兒科，山東 東營 257300)

目的探究CD4+T細胞四大亞群及淋巴細胞亞群在小兒哮喘中的臨床意義。方法以2011年9月至2014年9月在廣饒縣中醫院兒科進行治療的哮喘患兒100例作為研究組，選取同期進行健康體檢的兒童100例作為對照組。兩組兒童均在早晨空腹情況下抽取靜脈血5mL于3小時內進行標本處理，利用流式細胞儀器測量外周血中Th1、Th2、Th17、外周血Treg及淋巴細胞亞群。結果研究組患兒外周血Treg占CD4+T細胞的比率明顯高于對照組，差異具有統計學意義(t=4.01，P<0.05)；Th1占CD4+T細胞的比率在兩組間無明顯統計學差異(t=1.03，P>0.05)；Th2占CD4+T細胞的比率明顯高于對照組(t=5.32，P<0.05)；Th17占CD4+T細胞的比率明顯高于對照組(t=6.94，P<0.05)。研究組CD3+所占百分率明顯低于對照組(t=4.56，P<0.05)；研究組CD4+所占百分率的水平均明顯低于對照組(t=5.61，P<0.05)；研究組CD8+所占百分率明顯低于對照組(t=5.04，P<0.05)；研究組CD16+56+的水平均明顯低于對照組(t=6.77，P<0.05)。兩組間的白細胞及中性粒細胞百分比差異無統計學意義(P>0.05)；研究組淋巴細胞百分比較對照組低(t=7.99，P<0.05)；嗜酸性粒細胞百分比明顯高于對照組(t=12.58，P<0.05)；單核細胞百分比的水平均明顯高于對照組(t=12.06，P<0.05)。結論CD4+T淋巴細胞內細胞因子(Th1/Th2/Th17)、Treg及淋巴細胞亞群可作為判斷哮喘免疫反應的標準，對疾病的診斷、預防、治療以及療效的評價都具有重要臨床意義。

哮喘；淋巴細胞亞群；流式細胞技術；CD4+細胞亞群

[Abstract]ObjectiveToexploretheclinicalsignificanceoffoursubsetsofCD4+Tcellsandlymphocytesubsetsinchildrenwithasthma.MethodsFromSeptember2011toSeptember2014 100childrenwithasthmatreatedinGuangraoCountyTCMHospitalwererecruitedinstudygroup,andanother100childrentakinghealthphysicalexaminationatthesameperiodwereselectedincontrolgroup.Fastingvenousbloodsamples(5mL)werecollectedinthemorninginchildrenofbothgroups,andtheywereprocessedwithin3hours.FlowcytometryinstrumentwasusedtomeasureperipheralbloodTh1,Th2,Th17,Tregandlymphocytesubsets.ResultsInthestudygroupthepercentageofperipheralbloodTreginCD4+Tcellswassignificantlyhigherthaninthecontrolgroup(t=4.01, P<0.05).TherewasnosignificantdifferenceinpercentageofTh1inCD4+Tcellsbetweentwogroups(t=1.03, P>0.05).ThepercentageofTh2andTh17wasobviouslyhigherthanthecontrolgroup(tvaluewas5.32and6.94,respectively,bothP<0.05).Comparedwiththecontrolgroup,thepercentageofCD3+,CD4+,CD8+andCD16+56+wassignificantlylowerinthestudygroup(tvaluewas4.56, 5.61, 5.04and6.77,respectively,allP<0.05).ThedifferencesinratiosofWBCandneutrophilswerenotsignificant(bothP>0.05).Comparedwiththecontrolgroup,thepercentageoflymphocytewaslowerbutthatofeosinophilandmonocytewashigherinthestudygroup(tvaluewas7.99, 12.58and12.06,respectively,allP<0.05).Conclusioncytokines(Th1/Th2/Th17),TregandlymphocytesubsetsinCD4+Tlymphocytes,canbetakenasjudgmentstandardforasthmaimmuneresponse,whichareimportanttovaluatethediagnosis,prevention,treatmentandcurativeeffectofdiseases.

[Keywords]asthma;lymphocytesubsets;flowcytometrytechnology;CD4+cellssubset

支氣管哮喘是由多種細胞(如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞、氣道上皮細胞等)和細胞組分參與的氣道慢性炎癥疾病，主要特征包括氣道慢性炎癥，氣道對多種刺激因素呈現高反應性，廣泛多變的可逆性氣流受限以及隨著病程延長而導致的一系列氣道結構的改變及氣道重構[1-2]。很多哮喘患兒因為治療不及時或是治療方法不當最終遷延成為成人哮喘，導致肺功能嚴重損傷，一些患兒甚至完全失去勞動能力。兒童與成人基本上相似，但兒童和成人哮喘在某些方面仍然存在著差異。哮喘患兒由于正處于生理、心理、智能及免疫系統，尤其是在免疫學和病理生理學方面[3-4]不斷發育成長階段。本研究的目的在于探討利用流式細胞檢測儀測量哮喘兒童外周靜脈血中的Th1、Th2、Th17、Treg及淋巴細胞亞群[5]。結合臨床相關因素，分析各檢測因子在小兒哮喘患兒免疫方面的異同，從而探索CD4+T細胞四大亞群及淋巴細胞亞群在小兒哮喘中的意義。

1資料與方法

1.1研究對象

研究組：選取2011年9月至2014年9月在廣饒縣中醫院兒科進行哮喘治療的100例患病兒童,其中男孩54例，女孩46例;年齡3～12歲，平均(6.6±3.5)歲。診斷以中華醫學兒科分會呼吸學組制定的哮喘防治常規作為診斷標準；試驗前兩周均未使用過茶堿、免疫球蛋白、糖皮質激素、色甘酸鈉、白三烯拮抗劑等免疫調節藥物；排除伴有其他心肺疾病、自身免疫疾病史、腫瘤等惡性疾病史的患兒。

對照組：同期本院兒童保健門診正常健康體檢的兒童100例,年齡4～11歲，平均(5.8±2.2)歲;男56例，女44例。排除伴有其他心肺疾病、自身免疫疾病史、腫瘤等惡性疾病史的患兒；均無自身過敏及過敏性家族史。

兩組兒童在年齡、性別等一般資料上，差別無統計學意義(均P>0.05)，有可比性。

1.2方法

1.2.1標本采集

哮喘患兒入院時，用肝素鈉抗凝負壓真空方法采取其清晨空腹靜脈血5mL，在3h內檢測。對照組患兒則采用其進行微量元素檢測的余血。

1.2.2T淋巴細胞Th1、Th2、Th17、Treg細胞因子檢測

刺激細胞：按順序在流式管中加入PMA5μL、離子霉素1μL、BFA1μL、外周全血500μL，混勻，于37℃、5%CO2培養箱孵育4～6h。標記管：標記IFN-γ/IL-4抗體管、IFN-γ/IL-4對照管、IL-17抗體管，IL-17對照管。固定/破膜及細胞打孔：將全血200μL置于4管中，在4管中分別加固定/破膜稀釋液2mL/管，混勻，于4℃避光保存40min后，在室溫下(20～25℃)離心10min，轉速2 000r/min；棄去上清，再在每個管中加入固定/破膜洗滌液1mL，混勻，離心，棄去上清。胞膜內免疫熒光標記：在各管中均加5μLCD4-APC后，在抗體管中加入小鼠抗人IFN-γ/IL-4及IL-17APE單克隆抗體，同型管中加入相應同型對照20μL/管，混勻，于4℃避光保存30min。加固定/破膜洗滌液2mL/管，離心，棄上清。流式細胞儀檢測：在每管中加入PBS400μL，混勻，上機檢測。T淋巴細胞亞群檢測按照MulttestIMK的四色免洗淋巴細胞亞群分析方法進行操作，系統會自動分析測量結果。

1.3統計學方法

采用SPSS18.0統計學軟件進行數據的處理分析，定量資料用均數±標準差來表示，組間比較則采用t檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1對比兩組CD4+T細胞各亞群水平

研究組患兒外周血Treg占CD4+T細胞的比率明顯高于對照組(t=4.01，P=0.04)。Th1占CD4+T細胞的比率在兩組間無明顯統計學差異。研究組Th2占CD4+T細胞的比率明顯高于對照組(t=5.32，P=0.03)；研究組Th17占CD4+T細胞的比率明顯高于對照組(t=6.94，P=0.01),見表1。

2.2兩組淋巴細胞亞群所占百分率比較

研究組CD3+所占百分率明顯低于對照組(t=4.56，P<0.05)；研究組CD4+所占百分率的水平均明顯低于對照組(t=5.61，P<0.05)；研究組CD8+所占百分率明顯低于對照組(t=5.04，P<0.05)；研究組CD16+56+的水平均明顯低于對照組(t=6.77，P<0.05)，見表2。

Table 1 Comparison of percentage of peripheral blood Treg ,Th1, Th2 and Th17 cells between two ±S)

Table 2 Comparison of percentage of lymphocyte subsetsbetween two groups ±S)

2.3兩組血常規檢測結果比較

兩組間白細胞及中性粒細胞無明顯統計學差異，研究組淋巴細胞百分比較正常對照組低(t=7.99，P<0.05)；嗜酸性粒細胞百分比明顯高于對照組(t=12.58，P<0.05)；單核細胞百分比水平均明顯高于對照組(t=12.06，P<0.05)，見表3。

表3　兩組血常規檢測結果比較±S)

3討論

3.1哮喘相關流式細胞技術

流式細胞學技術是一種分析單個微粒(如細胞，微生物和人工合成微球等)物理和化學特性的技術，其特點是快速、準確、客觀、能定量。流式細胞學技術的作用機理：懸浮在血液中的離散細胞單個地有順序的通過檢測區域時會發出電信號，從而可迅速的對所有細胞進行多參數的測定(例如細胞的大小、粒度、表面積，核質的比率，DNA、RNA、蛋白質的含量，細胞的活性，細胞因子，酶的活性等)并進行分析，從而并可從整個集體中選出目標細胞亞群。

3.2CD4+T細胞及淋巴細胞亞群在小兒哮喘中的臨床意義

CD8+是抑制性細胞、細胞毒性細胞亞群，CD8+T細胞于殺死靶細胞后立即溶解，在發病時外周靜脈血中其含量不平穩[6]。CD16+56+是自然殺傷細胞，它是機體的第一道防御屏障，可以清除病毒感染，降低了就表示患兒免疫力、清除病原的能力下降，這樣就會導致病程較延以及容易發生重復感染[7]。本研究結果試驗組患兒CD3+、CD4+、CD8+、CD16+56+均低于對照組，提示哮喘患兒淋巴細胞抑制作用明顯降低，導致了其免疫力的抑制[8]。研究組Th17水平明顯高于對照組，這可能與Th17細胞應答和氣道中性粒細胞的浸潤對過敏性哮喘的氣道高反應性起主導作用有關。從本研究認識到，哮喘患兒存在的免疫學改變，表現為Th2、Th17的水平明顯高于對照組，CD3+、CD4+、CD8+、CD16+56+百分率明顯低于對照組。這些研究結果提示了對哮喘患兒，在臨床治療中除了止咳、平喘對癥治療并抗感染外，還應該注意加強其免疫功能的治療。

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[專業責任編輯：侯偉]

Clinical significance of CD4+T cells and lymphocyte subsets in children with asthma

WU Bai-ping, ZHANG Yong-gang

(Pediatrics Department, Guangrao County TCM Hospital, Shandong Dongying 257300, China)

2015-10-09

吳百平(1976-)，男，主治醫師，主要從事兒科臨床醫療工作。

張永剛，副主任醫師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.01.036

R725.6

A

1673-5293(2016)01-0104-03