豬流行性腹瀉病毒SC-2014株的分離鑒定及繁殖條件的優化

王 飛，陳小芬，焦臣鵬，蘇丹萍，宋亞兵，陳瑞愛，2，賀東生，2

（1.華南農業大學獸醫學院 ，廣東　廣州　510642；2.廣東溫氏大華農生物科技有限公司，廣東　新興　527400）

豬流行性腹瀉病毒SC-2014株的分離鑒定及繁殖條件的優化

王 飛1，陳小芬1，焦臣鵬1，蘇丹萍1，宋亞兵1，陳瑞愛1，2，賀東生1，2

（1.華南農業大學獸醫學院 ，廣東廣州510642；2.廣東溫氏大華農生物科技有限公司，廣東新興527400）

從四川省某豬場疑似病毒性腹瀉的發病豬采集部分小腸內容物樣品，應用RT-PCR檢測得到該病料呈PEDV陽性，命名為SC-2014株，將其在Vero細胞上進行連續盲傳，傳至第8代觀察到CPE，傳至30代基本能夠在Vero細胞上穩定增殖。并通過分別不同胰酶濃度、不同吸附時間、不同PAPN濃度到培養體系中，將分離的病毒繼續繁殖8代，然后分別測定不同條件下病毒的TCID50，結果表明：在胰酶濃度為15 μg/mL，吸附時間為1.5 h，添加的PAPN濃度為5 μg/mL時，PEDV SC-2014株的病毒滴度為10-5.22，達到最大值，使PEDV SC-2014株的繁殖條件得到一定程度的優化。

豬流行性腹瀉；病毒分離；繁殖條件

流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）由豬流行性腹瀉病毒引起的高度接觸性腸道傳染病，臨床上以腹瀉，脫水，嘔吐和對哺乳仔豬高死亡率為特征［1］。它對哺乳仔豬危害嚴重，感染后死亡率高達95%～100%，自2010年至今，在我國各省豬場發病率高居不下，給養豬業造成了巨大的經濟損失。

國內外關于PEDV的致病機理、適應細胞的分子基礎等方面研究相對落后，主要是由于PEDV細胞培養比較困難，直到1988年，Hofmann等首次通過在Vero細胞中添加適量胰酶，成功分離培養了PEDV［2］；隨后，日本Kweon CH等［3］、韓國Song DS等［4］也同樣通過在Vero細胞中添加胰酶分離得到細胞適應株，并制成疫苗，近年來也相繼有一些成功分離PEDV的報道，但是PEDV適應細胞難度大，繁殖滴度低仍然是現階段研究中的兩大難題。

本實驗從四川某疑似病毒性腹瀉豬場的發病仔豬小腸內容物中獲取病料，通過在Vero細胞上連續盲傳，成功分離一株豬流行性腹瀉病毒，命名為SC-2014株，并不斷摸索最佳繁殖條件，以便更深入地掌握該株病毒的培養特性，為疫苗生產提供指導。

1　材料與方法

1.1病料及細胞系

病料來源于四川某病毒性腹瀉豬場哺乳仔豬小腸內容物，Vero E6傳代細胞系由華南農業大學獸醫學院傳染病教研室保存。

1.2試劑與儀器

胰蛋白酶、DMEM營養液、胎牛血清購自Gibco公司；One step RTPCR試劑盒、DNA Marker-2000購自Takara公司；胰蛋白?磷酸肉湯、APAN購自BI公司；5%CO2細胞培養箱，細胞培養箱購自賽默飛公司，倒置顯微鏡（尼康）。

1.3引物的設計及合成

根據Genbank中登錄的PEDV參考毒株N基因序列，利用Primer5.0軟件涉及合成1對特異性引物，上下游引物分別為P1、P2，擴增產物大小為：引物序列如下P1：5’—TAAGTTGCTAGTGCGTAAT—3’，P2：5’—TTTACAACGAGAGTTACC ATTA—3’。引物由北京睿博生物技術有限公司合成。

1.4病毒RNA的提取和cDNA的合成

將小腸內容物與PBS以1∶4的比例稀釋，充分震蕩后反復凍融3次，6 000 r/min離心10 min，提取上清液中總RNA，按試劑盒說明書合成cDNA，將反轉錄產物置于-20 ℃保存備用。

1.5病毒的PCR檢測

以cDNA為模板進行PCR擴增， 反 應 體 系 為：One-step RTPCR buffer 12.5μL，上下游引物各1.0μL，RNA模板3μL，滅菌的DEPC水7.5μL。PCR擴增程序為：50 ℃ 30 min；95 ℃預變性1 min；94 ℃變性5 min； 55 ℃復性30 S；72 ℃延伸70 S，30個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取5μL PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，用黑馬成像儀拍照觀察。

1.6病毒的分離

取PCR呈陽性的樣品，在8 000 g下離心10 min，取上清液用0.22μm無菌過濾器過濾除菌。將過濾的病毒液加入終濃度為15μg/mL的胰酶，置于37℃溫箱作用30 min；取24 h生長良好的Vero單層細胞的6孔細胞培養板，棄去培養液，用PBS清洗3遍，將處理好的病毒液以400μL /孔接種5孔，另1孔作對照，置于37 ℃培養箱孵育2 h后取培養板，棄去液體，每孔中加入2 mL含終濃度為25μg/mL的胰酶，0.3%胰蛋白?磷酸肉湯，0.02%酵母提取物的DMEM培養基，然后將培養板置于培養箱中繼續培養3 d，收獲病毒培養物，于-20 ℃反復凍融3次，繼續進行下一代盲傳，直至出現穩定的CPE。

1.7SC-2014株繁殖條件的優化

1.7.1不同胰酶濃度條件

取生長良好的Vero單層細胞，消化后分裝到12孔板中，待細胞長滿時棄去培養液，用PBS清洗細胞2次，加入病毒液200μL，同時加入胰酶終濃度分別為2.5μg/mL，5μg/mL，10μg/ mL，15μg/mL，20μg/mL，25μg/ mL，50μg/mL，并設置對照組，在37 ℃溫箱中共同吸附1.5 h后棄去毒液，加入含胰酶各終濃度的DMEM營養液1 mL，37 ℃培養，72 h收毒，分別繁殖8代后均進行TCID50測定。

1.7.2不同吸附時間

取生長良好的Vero單層細胞，消化后分裝到12孔板中，待細胞長滿時棄去培養液，用PBS清洗細胞2次，加入含胰酶濃度為15μg/mL的病毒液200μL，在37 ℃溫箱中分別吸附30 min、1h、1.5h、2 h后棄去毒液，每孔加入1 mL含終濃度15μg/mL胰酶的DMEM營養液，37 ℃培養，72 h收毒，分別繁殖8代后均進行TCID50測定。

1.7.3不同可溶性APAN濃度

取生長良好的Vero單層細胞，消化后分裝到12孔板中，待細胞長滿時棄去培養液，用PBS清洗細胞2次，先分別每孔加入終濃度為 10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/ mL，1μg/mL，0.5μg/mL的可溶性APAN200μL，37℃吸附1 h，后每孔加入含胰酶濃度為15μg/mL的病毒液200μL，在37 ℃溫箱中吸附1.5 h棄去毒液，每孔加入1 mL含終濃度15μg/mL胰酶的DMEM營養液，37 ℃培養，72 h收毒，分別繁殖8代后均進行TCID50測定。

2　結果

2.1病料RT-PCR檢測結果

將病料和已知陽性PEDV、TGEV、RV提取病毒RNA后，用P1，P2引物進行RT-PCR擴增，結果如圖1，病料和陽性PEDV均擴增出747 bp的目的片段，TGEV、RV均未擴增出目的條帶，說明該病料為PEDV陽性，并未混合感染其他腹瀉類病毒。

圖1　采集糞便樣品RT-PCR鑒定結果

2.2PEDV SC-2014株的分離與鑒定結果

病毒在Vero細胞上傳代前幾代幾乎無病變，盲傳至第8代出現細胞皺縮，變圓，折光性變強，部分細胞脫落等典型病變。隨著傳代代數的增加，細胞病變的時間逐漸變短，傳至30代時基本能在Vero細胞上穩定增殖，48 h即出現輕微病變，60 h出現大面積典型病變。每隔5代做PCR檢測均為陽性，由此確定PEDV SC-2014株在Vero細胞上成功分離。

2.3PEDV SC-2014株繁殖條件優化結果

2.3.1不同胰酶濃度對病毒滴度的影響

對不同胰酶濃度培養下病毒滴度測定結果如圖3，當胰酶濃度在10μg/ mL以下時，病毒滴度增長幅度較小，當胰酶濃度為15μg/mL時，病毒滴度達到最高值，后隨著胰酶濃度逐漸增大，病毒滴度也在緩慢降低，當胰酶濃度超過50 μg/mL時，細胞會出現脫落情況，表明SC-2014株在Vero細胞中增殖的最佳胰酶濃度為15μg/mL。

圖2　正常Vero細胞和接毒病變細胞的對比

圖3　不同胰酶濃度對病毒滴度的影響

2.3.2不同吸附時間對病毒滴度的影響

不同吸附時間下對病毒滴度測定結果如圖4，當吸附時間為0.5 h時，病毒滴度較低，隨著吸附時間的不斷延長，病毒呈直線增長，當吸附時間為1.5 h時，病毒滴度達到最高值，當吸附時間為2 h時，相比1.5 h病毒滴度也在緩慢降低，表明SC-2014株在Vero細胞中增殖的最佳吸附時間是1.5 h。

圖4　不同吸附時間對病毒滴度的影響

圖5　不同PAPN濃度對病毒滴度的影響

2.3.3不同PAPN濃度對病毒滴度影響不同PAPN濃度作用下對病毒滴度測定結果如圖5，與不加PAPN相比，

明顯發現病毒滴度稍微有所提升，當PAPN濃度低于2.5μg/mL時，病毒滴度增長很小，隨后隨PAPN濃度逐漸增大，滴度開始有所提升，當濃度達到5μg/mL時，病毒滴度達到最高值，當PAPN濃度超過5μg/mL時，病毒又會快速下降，表明病毒對PAPN濃度比較敏感，且SC-2014株在Vero細胞中增殖時需要的最佳PAPN濃度為5μg/mL。

3　討論

目前，國內外關于PEDV的分離鑒定和培養特性的相關報道越來越豐富。1988年，Hofmann等首次通過在Vero細胞中添加適量胰酶，成功分離培養了PEDV；2000年Shibata等用已適應Vero細胞的PEDV可轉入PK和ST細胞中增殖，并產生病變［5］；2002年，Kadoi K等在豬細胞系KSE6和IBRS2上不添加胰酶成功培養傳代［6］。本實驗通過采用Vero細胞，添加終濃度為10μg/mL的胰酶盲傳至第6代產生細胞病變并能穩定傳代，而且傳至40代發現不添加胰酶也可在Vero細胞上繼續穩定增殖，這可能是胰酶前期已對PEDV纖突蛋白有效切割，使病毒在不斷傳代中已適應細胞，不再需要胰酶的作用。

不同學者在PEDV培養時對于胰酶終濃度選擇也是不同的，李樹根等在維持液中加入60μg/mL胰酶，最終獲得成功［7］；田野等用胰酶終濃度為8μg/mL的維持液也成功培養PEDV［8］。本研究在PEDV SC-2014株進行培養時最終確定胰酶濃度為10μg/mL，病毒滴度達到最高，說明不同的細胞系、不同的毒株、不同的培養條件下對胰酶濃度的敏感性也是有所差異的，需要我們在實驗中不斷探索。

病毒培養中吸附過程是病毒感染的第一步，也是病毒能否成功大量繁殖的關鍵一步。朱文革等研究表明PRRSV NVDC-JXA1吸附30 min病毒增殖效果最佳［9］；Iwata，K等報道PRV在Vero細胞上1 h完成吸附［10］。本實驗PEDV在細胞上吸附達最大量需要1.5 h，表明不同病毒，不同毒株吸附過程所用的時間也是不同的，基本都在25～120 min之間。

Li等證實PAPN為PEDV細胞感染的一種功能性受體［11］，實驗中通過在Vero細胞中添加可溶性的豬氨基肽酶發現明顯提高了病毒的滴度。2003年，Oh，J S等曾推測外源性受體的加入會增加病毒與細胞結合的機會，為病毒吸附細胞提供良好條件，增加病毒產量［12］，本實驗中也得到較好的印證。

本實驗將分離的PEDV SC-2014株設置不同胰酶濃度，不同吸附時間、不同的培養時間和是否加APAN等條件，探索病毒最佳的繁殖條件，為提高病毒滴度提供途徑，為大量繁殖病毒，生產高效疫苗提供重要參考。

（本實驗是在華南農業大學獸醫學院、人獸共患病防控制劑國家地方聯合工程實驗室、農業部獸用疫苗創制重點實驗室、廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室完成）

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2016-03-12）

國家自然科學基金項目

王飛（1991-），男，碩士生，研究方向為動物傳染病，E-mail：1137852078@qq.com

賀東生，博士、教授，獸醫傳染病研究方向。E-mail：dhe@scau.edu.cn